三種蟲生菌協(xié)同毒性及與有機(jī)肥耦合效應(yīng)研究

謝永紅 聶銘 陳霞 廖敦秀

摘 要 為揭示白僵菌、綠僵菌、淡紫紫孢菌對(duì)蚜蟲、地蠶、根結(jié)線蟲的毒性大小，并探索生防菌與有機(jī)肥耦合效應(yīng)，采用PDA對(duì)白僵菌、綠僵菌、淡紫紫孢菌對(duì)其進(jìn)行活化培養(yǎng)，并稀釋不同濃度菌劑作用于蚜蟲，觀察單獨(dú)菌種下毒性大小，然后利用對(duì)峙法研究菌種間拮抗性，尋求最優(yōu)協(xié)同殺蟲組合，最后利用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)不同有機(jī)肥與菌劑配比，分析混合配方對(duì)防效的影響。結(jié)果表明：三種蟲生真菌對(duì)蚜蟲的毒力大小為白僵菌>淡紫紫孢菌>綠僵菌，50%致死濃度分別為5.048×106、6.962×106、1.155×107 cfu·mL-1，三種蟲生菌間沒有拮抗性，白僵菌與淡紫紫孢菌對(duì)蚜蟲和根結(jié)線蟲的協(xié)同效果最優(yōu)，協(xié)同毒力指數(shù)分別為3.66、4.77，有機(jī)肥與蟲生菌耦合效果影響因子大小為有機(jī)肥比例>菌劑濃度>油餅比例，并得到“有機(jī)肥80.5%+油餅14.3%+白僵菌-淡紫紫孢菌組合菌劑8.4%”配比對(duì)線蟲的防效最高。

關(guān)鍵詞 蟲生菌;蚜蟲;協(xié)同毒性;根結(jié)線蟲;有機(jī)肥;耦合效應(yīng);生物防治

中圖分類號(hào)：S476+.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2022.01.002

蚜蟲是繁殖最快的昆蟲之一，主要分布在北半球溫帶地區(qū)和亞熱帶地區(qū)。蚜蟲柔軟的身體無法保護(hù)它免受天敵和疾病的侵害，因此蚜蟲發(fā)展出了多種自我保護(hù)的防御方式，從而增大了植保難度。根結(jié)線蟲是一種高度?；偷碾s食性植物病原線蟲[1-2]。對(duì)作物病蟲害須嚴(yán)格實(shí)行“預(yù)防為主，綜合防治”植保方針，著重抓好農(nóng)業(yè)、物理防治措施，配合化學(xué)及生物防治，才能有效地減輕其危害[3]。目前已有大量關(guān)于生防菌防控報(bào)道，然而研究發(fā)現(xiàn)平板上抑菌作用明顯的拮抗菌在盆栽和田間試驗(yàn)中的防病效果不穩(wěn)定[4-5]。大量生防菌施用到土壤后，由于缺少營養(yǎng)來源，不能在土壤形成優(yōu)勢(shì)種群，難以有效抑制土傳病害的發(fā)展[6]。由于培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和含量與土壤環(huán)境截然不同，拮抗菌施入土壤后，缺少足夠的營養(yǎng)資源，不能大量定殖或者不能產(chǎn)生足夠的拮抗物質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致其生防效率不高[7]。在植物根際土壤中存活著大量的微生物，這些微生物中的部分及其自身的代謝產(chǎn)物能夠抑制病原微生物的生長繁殖，使得從土壤中分離拮抗細(xì)菌并利用其防治土傳病害成為可能，這不僅能克服使用農(nóng)藥帶來的環(huán)境污染，而且能避免農(nóng)藥造成的病原菌產(chǎn)生抗藥性等問題[8-9]，因此日益受到重視。據(jù)報(bào)道，用蘋果渣與熒光假單胞桿菌、哈茨木霉和綠色木霉復(fù)合使用可以最大限度抑制尖孢鐮刀菌香蕉?；蚚10]，用非致病尖孢鐮刀菌與惡臭假單胞菌復(fù)合使用可以抑制劍麻枯萎病和黃瓜枯萎病[11-12]。本研究通過培養(yǎng)白僵菌、綠僵菌、淡紫紫孢菌，研究單獨(dú)菌種對(duì)病蟲的毒性及協(xié)同作用，尋求高效生防效果的菌株，在此基礎(chǔ)上制備微生物有機(jī)肥，研究不同配比有機(jī)肥的實(shí)際效能，以期為生物有機(jī)肥高效防控蟲害提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

供試蟲生真菌為白僵菌（Beauveria）、綠僵菌（Metarhizium）、淡紫紫孢菌（Purpureocillium sp.），均由重慶微核生物科技有限公司提供;選擇2日齡的蚜蟲、地蠶、根結(jié)線蟲作為蟲生真菌的防殺對(duì)象。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 三種蟲生真菌毒性試驗(yàn)

配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養(yǎng)基，對(duì)白僵菌、綠僵菌、淡紫紫孢菌進(jìn)行活化，獲得生長旺盛的三種蟲生真菌菌種。培養(yǎng)基配制參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。以150頭2日齡蚜蟲為寄主，設(shè)置孢子懸浮液含量共五個(gè)水平，分別為1×105、1×106、1×107、1×108、1×109 cfu·mL-1，各處理噴施3 d后每隔2 d用顯微鏡觀察蚜蟲死亡頭數(shù)，每個(gè)水平3次重復(fù)，共計(jì)45個(gè)毒性觀察試驗(yàn)。利用最小二乘法擬合各蟲生菌處理濃度與蚜蟲死亡率的回歸模型。

1.2.2? 三種蟲生真菌拮抗性試驗(yàn)

配制PPDA培養(yǎng)基，采用平板對(duì)峙法，將活化的三種原菌打成6 mm菌餅，置于PPDA培養(yǎng)基遠(yuǎn)離中心4 cm的圓周上等分間隔分布，3次重復(fù)，平放于25 ℃恒溫箱培養(yǎng)，5 d后觀察三種蟲生真菌在PPDA培養(yǎng)基上的生長情況及抑菌帶的寬度。

1.2.3? 三種蟲生菌協(xié)同殺蟲試驗(yàn)

對(duì)活化后的三種蟲生菌進(jìn)行組合，組合方式設(shè)置為“白僵菌+綠僵菌”“綠僵菌+淡紫紫孢菌”“白僵菌+淡紫紫孢菌”“白僵菌+綠僵菌+淡紫紫孢菌”四種，菌劑濃度為1×109 cfu·mL-1，對(duì)蚜蟲、地蠶、根結(jié)線蟲進(jìn)行毒性測(cè)定，11 d后觀察試驗(yàn)結(jié)果;以單獨(dú)的三種蟲生菌作為對(duì)照。根據(jù)校正死亡率減去理論致死率計(jì)算得到協(xié)同毒力指數(shù)。

1.2.4? 生防菌群與有機(jī)肥耦合增效試驗(yàn)

通過設(shè)置不同白僵菌-淡紫紫孢菌組合菌群與油餅、有機(jī)肥配施水平，觀察生防菌與有機(jī)肥耦合效應(yīng)。設(shè)置的處理分別為“5%油餅+95%有機(jī)肥”“清水+5%菌劑”“5%油餅+95%有機(jī)肥+2%菌劑”“5%油餅+95%有機(jī)肥+5%菌劑”“5%油餅+95%有機(jī)肥+10%菌劑”“10%油餅+90%有機(jī)肥”“10%油餅+90%有機(jī)肥+2%菌劑”“10%油餅+90%有機(jī)肥+5%菌劑”“10%油餅+90%有機(jī)肥+10%菌劑”“15%油餅+85%有機(jī)肥”“15%油餅+85%有機(jī)肥+2%菌劑”“15%油餅+85%有機(jī)肥+5%菌劑”“15%油餅+85%有機(jī)肥+10%菌劑”，共計(jì)13個(gè)處理，以“5%油餅+95%”有機(jī)肥為對(duì)照。將各處理與試驗(yàn)土壤充分混合，選擇100株植物進(jìn)行根結(jié)線蟲感染觀察。并用響應(yīng)曲面法進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，求出最優(yōu)有機(jī)肥與真菌配比。

1.3? 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2013進(jìn)行整理與統(tǒng)計(jì)，利用SPSS 19.0進(jìn)行方差和回歸分析，利用Design expert 8.0進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)回歸及圖形繪制。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 三種蟲生菌對(duì)蚜蟲的毒性

以150頭2日齡蚜蟲為寄主，觀察1×105、1×106、1×107、1×108、1×109 cfu·mL-1孢子懸浮液濃度下蚜蟲死亡頭數(shù)，計(jì)算出藥后3～11 d的校正死亡率（見表1）。

藥后11 d，對(duì)照的蚜蟲正常死亡率為6.67%～9.33%;由低至高不同濃度的白僵菌菌株對(duì)蚜蟲的校正死亡率分別為28.57%、38.57%、66.43%、79.29%、85.71%，綠僵菌對(duì)蚜蟲的校正死亡率分別為12.14%、26.43%、49.29%、63.57%、77.14%，淡紫紫孢菌對(duì)蚜蟲的校正死亡率分別為17.86%、45.71%、58.57%、69.29%、80.00%。三種蟲生菌株均隨著孢子濃度增加，對(duì)蚜蟲的致死率越高;其中白僵菌、淡紫紫孢菌孢子濃度大于1×107 cfu·mL-1時(shí)，蚜蟲死亡率均大于50%，綠僵菌孢子濃度為1×107 cfu·mL-1時(shí)，蚜蟲死亡率接近50%。

以濃度為變量，11 d后蚜蟲的死亡率為響應(yīng)量，采用最小二乘法建立回歸模型，結(jié)果見表2。白僵菌、綠僵菌、淡紫紫孢菌的濃度與蚜蟲致死率之間均服從對(duì)數(shù)函數(shù)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.934 7、0.953 6、0.997 5，回歸模型為極顯著，說明得到的擬合模型是有效的，能夠很好地預(yù)測(cè)不同濃度對(duì)蚜蟲的致死率。通過回歸方程得到白僵菌、綠僵菌、淡紫紫孢菌對(duì)蚜蟲50%致死濃度分別為5.048×106、1.155×107、6.962×106 cfu·mL-1，說明三種蟲生真菌對(duì)蚜蟲的毒力大小為白僵菌>淡紫紫孢菌>綠僵菌。

2.2? 拮抗試驗(yàn)

觀察三種蟲生真菌在PPDA培養(yǎng)基上的生長情況，發(fā)現(xiàn)三種蟲生真菌的菌落都能正常生長，菌落交界處都沒有產(chǎn)生任何抑菌帶，說明白僵菌、綠僵菌和淡紫紫孢菌菌株三種蟲生真菌菌株相互之間都沒有生長拮抗性，可用于組合殺蟲菌群。

2.3? 生防菌群協(xié)同殺蟲效果

將不同蟲生真菌菌株進(jìn)行組合后殺蟲，測(cè)定不同組合的協(xié)同殺蟲效果（見表3、表4、表5），結(jié)果發(fā)現(xiàn)組合菌群的殺蟲效果均優(yōu)于單一菌株的殺蟲效果。白僵菌+淡紫紫孢菌組合菌群對(duì)蚜蟲、根結(jié)線蟲的校正死亡率分別為96.69%、94.48%，分別大于其84.23%、90.17%的組合理論致死率;對(duì)蚜蟲、根結(jié)線蟲的協(xié)同毒力指數(shù)分別為3.66、4.77，具有一定的協(xié)同殺蟲效果。其他組合菌群對(duì)蚜蟲、根結(jié)線蟲的校正死亡率均低于組合理論致死率，協(xié)同毒力指數(shù)均為負(fù)值。白僵菌+綠僵菌組合菌群對(duì)地蠶的校正死亡率為91.16%，大于組合理論致死率（84.2%）;對(duì)地蠶的協(xié)同毒力指數(shù)為8.23，具有一定的協(xié)同殺蟲效果。其他組合菌群對(duì)地蠶的校正死亡率均低于組合理論致死率，協(xié)同毒力指數(shù)均為負(fù)值。白僵菌+綠僵菌+淡紫紫孢菌組合菌群對(duì)蚜蟲、地蠶、根結(jié)線蟲的致死率均較高，但均未超過其組合理論致死率，無協(xié)同殺蟲效果。

2.4? 生防菌群與有機(jī)肥耦合效應(yīng)

由生防菌協(xié)同殺蟲效果得到白僵菌+淡紫紫孢菌組合的協(xié)同毒力指數(shù)最高，因此以該菌群與油餅、有機(jī)肥配施，設(shè)置配比試驗(yàn)。由表6結(jié)果可見，不同有機(jī)肥配比提升白僵菌+淡紫紫孢菌組合菌群根結(jié)線蟲防效5.3～26.4個(gè)百分點(diǎn)。在15%油餅添加比例范圍內(nèi)，有機(jī)肥C/N與組合菌群的殺蟲效果呈負(fù)相關(guān)，在10%油餅添加比例有機(jī)肥提高根結(jié)線蟲平均防效16.5%。綜合考慮有機(jī)肥載體成本和防治效果，以10%油餅+90%有機(jī)肥組合作為適宜的組合菌群有機(jī)肥載體。在有機(jī)肥載體中，白僵菌+淡紫紫孢菌組合菌群濃度與殺蟲效果呈正相關(guān)，5%菌劑添加量對(duì)根結(jié)線蟲的防效達(dá)到70%以上。

為獲得優(yōu)化的菌肥耦合配比，通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，因子分別為有機(jī)肥、油餅、白僵菌+淡紫紫孢菌組合菌劑，試驗(yàn)觀察指標(biāo)為根結(jié)線蟲殺蟲率。由表7結(jié)果可見，第11組即“85%有機(jī)肥+10%油餅+10%菌劑”組合對(duì)根結(jié)線蟲的防效最高，達(dá)到74.58%。

根據(jù)表7 的試驗(yàn)結(jié)果，通過 Design-Expert 軟件中 Analysis 模塊進(jìn)行方差分析可確定回歸方程。分析得到白僵菌+淡紫紫孢菌組合菌群與油餅、有機(jī)肥配施對(duì)根結(jié)線蟲防效的多元二次回歸方程為：

由一次項(xiàng)系數(shù)大小可以看出，C因素（菌劑濃度）對(duì)菌肥耦合殺蟲效果的影響最為顯著，A因素（有機(jī)肥比例）次之，B 因素（油餅比例）最弱。通過方差分析表明，A因素和C因素對(duì)菌肥耦合殺蟲效果的影響達(dá)到極顯著水平，B 因素和C因素交互作用對(duì)菌肥耦合殺蟲效果的影響達(dá)到顯著水平。利用Design-Expert軟件繪出模型中AB、AC和BC交互項(xiàng)的響應(yīng)曲面（見圖1），響應(yīng)曲面的陡峭程度，反映了因素對(duì)試驗(yàn)的影響程度，如果曲面陡峭程度高，說明該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響大，反之，則對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響小。

通過數(shù)學(xué)模型對(duì)菌肥耦合條件進(jìn)行優(yōu)化，利用 Design-Expert 軟件中Optimization預(yù)測(cè)優(yōu)化功能分析可得到菌肥耦合優(yōu)化條件，最優(yōu)線蟲防效達(dá)到80.5%，此時(shí)的菌肥優(yōu)化配比為有機(jī)肥80.5%、油餅14.3%、“白僵菌+淡紫紫孢菌”組合菌劑8.4%。綜合考慮生產(chǎn)成本和殺蟲效果因素，確定有機(jī)肥中添加10%油餅和8%組合菌群作為優(yōu)化的生防菌群與有機(jī)肥耦合增效配比。

3? 結(jié)論與討論

據(jù)報(bào)道，解淀粉芽孢桿菌能夠有效抑制灰霉病、青霉病等真菌病害[14]，但目前國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)利用白僵菌、綠僵菌、淡紫紫孢菌防治蚜蟲和根結(jié)線蟲的報(bào)道。本文通過試驗(yàn)得到白僵菌、綠僵菌、淡紫紫孢菌對(duì)蚜蟲50%致死濃度分別為5.048×106、1.155×107、6.962×106 cfu·mL-1，說明三種蟲生真菌對(duì)蚜蟲的毒力大小為白僵菌>淡紫紫孢菌>綠僵菌。白僵菌、綠僵菌和淡紫紫孢菌菌株三種蟲生真菌菌株相互之間都沒有生長拮抗性，可用于組合殺蟲菌群，白僵菌+淡紫紫孢菌組合菌群對(duì)蚜蟲、根結(jié)線蟲的協(xié)同毒力指數(shù)分別為3.66、4.77，白僵菌+綠僵菌組合菌群對(duì)地蠶的協(xié)同毒力指數(shù)為8.23，具有一定的協(xié)同殺蟲效果，其余為負(fù)值，說明協(xié)同效果降低。生物有機(jī)肥產(chǎn)品的質(zhì)量直接影響使用效果，而產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)是產(chǎn)品的有效活菌數(shù)。生物有機(jī)肥的活菌數(shù)量決定于產(chǎn)品生產(chǎn)工藝，而供微生物生長的有機(jī)質(zhì)載體是其重要的決定因素。有機(jī)肥比例和菌劑濃度對(duì)菌肥耦合殺蟲效果的影響達(dá)到極顯著水平，油餅比例、有機(jī)肥比例和菌劑濃度交互作用對(duì)菌肥耦合殺蟲效果的影響達(dá)到顯著水平，有機(jī)肥與蟲生菌耦合效果影響因子大小為有機(jī)肥比例>菌劑濃度>油餅比例。相較于對(duì)照，在配制一定的生物菌后其防病能力都顯著提高，更加說明了增加生防菌營養(yǎng)載體的重要性。曹亮亮等研究同一功能菌株添加不同有機(jī)載體制成的生物有機(jī)肥時(shí)，發(fā)現(xiàn)添加膨化羽毛粉制成的生物有機(jī)肥不及添加菜粕制成的生物有機(jī)肥對(duì)香蕉的促生作用顯著[15]，這一研究結(jié)果給我們的一個(gè)重要啟示是，在篩選生防菌資源時(shí)，應(yīng)以產(chǎn)品開發(fā)為主導(dǎo)，根據(jù)不同的有機(jī)載體，篩選并獲得具有較大潛力的功能菌株。本文通過數(shù)學(xué)建模分析表明，當(dāng)有機(jī)肥80.5%、油餅14.3%、白僵菌-淡紫紫孢菌組合菌劑8.4%時(shí)，對(duì)根結(jié)線蟲防效達(dá)到最優(yōu)，其值為80.5%。

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收稿日期：2021-10-09

基金項(xiàng)目：重慶市科技局項(xiàng)目“功能性微生物有機(jī)肥產(chǎn)業(yè)化開發(fā)關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”（cstc2018jscx-mszd0439）。

作者簡介：謝永紅（1968—），男，重慶人，碩士，研究員，長期從事農(nóng)業(yè)生態(tài)與廢棄物處理研究。E-mail：103709829@qq.com。

*為通信作者，E-mail：xiuchai2006@163.com。