連香樹(shù)花芽發(fā)育過(guò)程中的生理生化特性研究

段秋笛，楊 旭，趙 焱，盧麗晶，崔秀偉，梁宏偉，4

（1.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2.山東省濟(jì)南市林業(yè)局，濟(jì)南 250000；3.山東省濟(jì)南農(nóng)業(yè)科學(xué)院，濟(jì)南 250000；4.三峽區(qū)域植物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（三峽大學(xué)）/三峽大學(xué)生物技術(shù)研究中心，湖北 宜昌 443002）

連香樹(shù)（Cercidiphyllum japonicum）為溫帶落葉喬木，屬連香樹(shù)科連香樹(shù)屬。連香樹(shù)為第三紀(jì)孑遺植物，間斷分布在中國(guó)和日本等亞洲地區(qū)，對(duì)于研究第三紀(jì)植物區(qū)系起源以及中國(guó)與日本植物區(qū)系的關(guān)系有十分重要的科研價(jià)值［1］。連香樹(shù)雌雄異株，植株結(jié)實(shí)率低，幼苗脆弱，容易受外界環(huán)境危害，難以生存，因此，在野外環(huán)境中種群年齡結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，資源稀少，瀕臨滅絕，是中國(guó)的二級(jí)保護(hù)植物［2］。連香樹(shù)高大雄偉，葉形奇特似心形，春季新發(fā)嫩葉和秋季葉色彩絢麗，是具有高觀賞價(jià)值的園林綠化樹(shù)種［3］。

連香樹(shù)的研究受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。廖興利等［4］研究了連香樹(shù)對(duì)不同海拔梯度環(huán)境的適應(yīng)能力。有外國(guó)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)連香樹(shù)的物種多樣性與海拔呈二次相關(guān)和負(fù)相關(guān)［5］。相關(guān)學(xué)者對(duì)連香樹(shù)群落功能多樣性的調(diào)查揭示了其功能多樣性可作為瀕危物種連香樹(shù)保護(hù)效率的一個(gè)指標(biāo)［6］。黃雪梅等［7］發(fā)現(xiàn)連香樹(shù)葉片C、N、P 化學(xué)計(jì)量特征已呈現(xiàn)出一定的性別二態(tài)性，這可能與其物種瀕危有關(guān)。馬文寶等［8］調(diào)查了天然連香樹(shù)種群性比并比較其雌、雄株之間的形態(tài)、光合能力、水分和養(yǎng)分利用效率差異，發(fā)現(xiàn)連香樹(shù)種群性比顯著偏雌，且該特性明顯影響了連香樹(shù)的天然繁殖。陳香波［3］對(duì)連香樹(shù)野生群實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)連香樹(shù)群體年齡結(jié)構(gòu)不合理，種群更新不良、面臨退化的風(fēng)險(xiǎn)。皮琪［9］對(duì)連香樹(shù)的適應(yīng)性和繁殖特性研究表明，野生連香樹(shù)呈零星分布且相距較遠(yuǎn)加劇了物種瀕危程度。

現(xiàn)有相關(guān)研究表明，造成連香樹(shù)天然繁殖困難的原因主要是其資源稀少、雌雄異株、結(jié)實(shí)較少?；ㄆ鞴偈潜蛔又参锾赜械脑诜敝尺^(guò)程中產(chǎn)生的生殖器官，花芽分化發(fā)育是高等植物個(gè)體發(fā)育的中心環(huán)節(jié)，也是植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向生殖生長(zhǎng)、繁衍后代的關(guān)鍵步驟［10］。植物的雌雄花芽發(fā)育是植物有性生殖過(guò)程的重要階段，其發(fā)育好壞直接影響植物的授粉、受精和坐果［11］?？扇苄蕴呛涂扇苄缘鞍踪|(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)植物花芽發(fā)育分化有重要作用［12］，過(guò)氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）是植物防止膜脂過(guò)氧化酶促防御體系中重要的保護(hù)酶［13］。同時(shí)POD、SOD 等酶的活性也是影響花芽發(fā)育分化的重要指標(biāo)［14］，而丙二醛則與植株抗逆性有關(guān)［15］。

本研究通過(guò)測(cè)量并分析連香樹(shù)花芽發(fā)育過(guò)程中相關(guān)生理生化指標(biāo)的變化和雌雄株之間生理生化指標(biāo)差異，探究其在花芽發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能和意義，從而為連香樹(shù)的有性繁殖提供有效的理論依據(jù)，對(duì)保護(hù)好這一珍稀瀕危樹(shù)種、保護(hù)生物多樣性及連香樹(shù)的可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為采集于神農(nóng)架地區(qū)7月末、10月中旬、12月末、次年3月初及3月末不同時(shí)期的連香樹(shù)雌株和雄株的花芽，即分別對(duì)應(yīng)連香樹(shù)花芽發(fā)育的分化發(fā)育初期、分化完成期、休眠期、春季快速發(fā)育期及開(kāi)花期，依次標(biāo)記性別及時(shí)期，分別為S1、S2、S3、S4、S5，于-70 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

試驗(yàn)于2020年7月至次年3月末進(jìn)行，于野外采集連香樹(shù)雌、雄花芽并立即液氮速凍保存。開(kāi)展生理生化指標(biāo)分析時(shí)，取等量的不同月份、不同性別的連香樹(shù)花芽，分別置于預(yù)冷的研缽中，加入1 mL預(yù)冷pH 7.0 的0.05 mol/L PBS 緩沖液（0.05 mol/L 磷酸二氫鈉40 mL+0.05 mol/L 磷酸二氫鉀60 mL），在冰浴中充分研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入離心管中，12 000 r/min離心15 min。取上清液分裝于1.5 mL帶蓋塑料離心管中，置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?。過(guò)氧化物酶活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，超氧化物歧化酶活性采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定，可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法測(cè)定，可溶性糖含量采用蒽酮法測(cè)定，丙二醛含量測(cè)定采用2-硫代巴比妥酸（TBA）法［16，17］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，利用Excel 2010、Origin 2018、SPSS Statistics 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 連香樹(shù)花芽發(fā)育過(guò)程中過(guò)氧化物酶活性的變化

由圖1 可知，POD 活性在花芽發(fā)育過(guò)程中呈先上升再下降的趨勢(shì)，各階段差異顯著，變化幅度較大。雌、雄花芽從S1 時(shí)期到S4 時(shí)期POD 活性整體增高，雄性花芽在S4 時(shí)期達(dá)到最高，POD 活性為44.23 U/（g·min·FW），參與植物體內(nèi)多個(gè)代謝過(guò)程。雌性花芽的POD 活性在S3、S4 時(shí)期沒(méi)有顯著差異，花芽處于休眠期，POD 含量達(dá)到最高。S4 到S5 時(shí)期溫度逐漸升高，雌、雄花芽代謝活動(dòng)加強(qiáng)，POD 活性顯著下降。

圖1 連香樹(shù)花芽發(fā)育過(guò)程中POD 活性變化

由單因素方差分析可得，雄性花芽POD 活性顯著高于雌性花芽POD 活性。POD 能更好地保護(hù)花芽，有利于使繁殖水平處于較高水平，推測(cè)連香樹(shù)雄花芽的分化比雌花芽分化需要更多的POD。

2.2 連香樹(shù)花芽發(fā)育過(guò)程中超氧化物歧化酶活性的變化

由圖2 可知，SOD 的活性在花芽發(fā)育過(guò)程中變化幅度較小，總體呈先緩慢下降再緩慢升高的趨勢(shì)，含量均處于較高水平。其中，S3 時(shí)期雄性花芽和雌性花芽SOD 活性最低，雄性花芽SOD 活性僅為541.03 U/（g·h·FW），S3 時(shí)期花芽處于休眠狀態(tài)，此時(shí)花芽細(xì)胞代謝作用較弱，自由基產(chǎn)生較少，SOD 活性較低。S1 到S2 時(shí)期，雌性花芽SOD 活性升高，花芽此時(shí)處于分化時(shí)期，代謝能力較強(qiáng)。S4 到S5 時(shí)期雌、雄花芽SOD 活性均明顯上升，花芽度過(guò)休眠期，進(jìn)入春季快速發(fā)育期和開(kāi)花期，細(xì)胞代謝能力強(qiáng)，SOD 活性升高。

圖2 花芽發(fā)育過(guò)程中SOD 活性變化

由單因素方差分析可知，雌、雄花芽的SOD 活性在S1 到S4 時(shí)期均有顯著差異，在S5 時(shí)期沒(méi)有顯著差異，總體雌性花芽SOD 活性高于雄性花芽，推測(cè)雌性花芽代謝能力較強(qiáng)，連香樹(shù)雌花芽的分化比雄花芽分化需要更多的SOD。

2.3 連香樹(shù)花芽發(fā)育過(guò)程中可溶性蛋白質(zhì)含量的變化

由圖3 可知，在連香樹(shù)雌、雄花芽形成過(guò)程中，可溶性蛋白質(zhì)含量呈先輕微下降再上升再下降的變化過(guò)程。分化發(fā)育初期、分化完成期和休眠期花芽?jī)?nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量逐漸波動(dòng)升高，雌、雄花芽中可溶性蛋白質(zhì)含量在休眠期積累至最大值，分別為144.86、132.54 mg/g。表明該段時(shí)期連香樹(shù)花芽中可溶性蛋白質(zhì)合成活躍并逐漸積累，到休眠期含量積累達(dá)最大值，花芽準(zhǔn)備越冬；而春季快速發(fā)育期和開(kāi)花期花芽?jī)?nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量急劇下降，說(shuō)明高含量的蛋白質(zhì)可能有利于花芽的分化與形成。

圖3 連香樹(shù)花芽發(fā)育過(guò)程中可溶性蛋白質(zhì)含量的變化

由單因素方差分析可知，分化發(fā)育初期和分化完成期雌株和雄株間可溶性蛋白質(zhì)含量無(wú)顯著性差異，而休眠期、春季快速發(fā)育期及開(kāi)花期雌性花芽的可溶性蛋白質(zhì)含量顯著高于雄性，這可能與雌株和雄株間對(duì)環(huán)境適應(yīng)的差異以及連香樹(shù)天然繁殖困難的原因有關(guān)。

2.4 連香樹(shù)花芽發(fā)育過(guò)程中可溶性糖含量的變化

由圖4 可知，在連香樹(shù)雌、雄花芽的形成過(guò)程中，可溶性糖含量在分化過(guò)程中均呈先上升再下降的趨勢(shì)。連香樹(shù)花芽分化發(fā)育初期及快速完成期可溶性糖合成活躍并逐漸積累，S3 時(shí)期可溶性糖含量達(dá)到最大值，在雌、雄花芽中分別為17.82、21.19 mg/g，花芽進(jìn)入休眠期；而從休眠期到春季快速發(fā)育期及開(kāi)花期花芽?jī)?nèi)可溶性糖含量急劇下降，說(shuō)明連香樹(shù)花芽在春季快速發(fā)育期和開(kāi)花期可溶性糖的消耗量較大。

圖4 連香樹(shù)花芽發(fā)育過(guò)程中可溶性糖含量的變化

由單因素方差分析可知，分化發(fā)育初期及快速完成期連香樹(shù)雌株可溶性糖含量顯著高于雄株，而休眠期、春季快速發(fā)育期和開(kāi)花期表明連香樹(shù)可溶性糖含量雌株卻顯著低于雄株，表明在連香樹(shù)春季快速發(fā)育期和開(kāi)花期雌株可溶性糖的消耗高于雄株。

2.5 連香樹(shù)花芽發(fā)育過(guò)程中丙二醛含量的變化

由圖5 可知，連香樹(shù)雌、雄花芽發(fā)育過(guò)程中丙二醛含量呈先增加再減少的趨勢(shì)，雌性花芽丙二醛含量在S3 時(shí)期達(dá)到最大，為1.66 μmol/（g·FW），雄性花芽在S4 時(shí)期達(dá)到最大，為1.27 μmol/（g·FW），而在S5 時(shí)期雌、雄花芽丙二醛含量分別下降到1.40、0.93 μmol/（g·FW）。這可能是隨著時(shí)間進(jìn)入冬季，連香樹(shù)花芽逐漸進(jìn)入休眠期，丙二醛含量增加，進(jìn)入3月，連香樹(shù)花芽發(fā)育完成并進(jìn)入開(kāi)花期，丙二醛含量下降。表明丙二醛含量的變化可能與連香樹(shù)的花芽分化過(guò)程的抗逆性有關(guān)。

圖5 連香樹(shù)花芽發(fā)育過(guò)程中丙二醛含量的變化

由單因素方差分析可知，同一時(shí)期，連香樹(shù)雌、雄花芽的丙二醛含量均有顯著性差異，且雌性花芽丙二醛含量顯著高于雄性花芽。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是在連香樹(shù)雌、雄花芽發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)性別偏移，表明連香樹(shù)雌、雄花芽在發(fā)育過(guò)程中對(duì)環(huán)境的抗逆性不同，推測(cè)連香樹(shù)雌花芽分化比雄花芽分化需要更多的丙二醛。

3 小結(jié)與討論

過(guò)氧化物酶與呼吸作用、光合作用等有關(guān)，其活性的不斷變化，反映其水解過(guò)氧化物的程度［18］。雄性花芽POD 活性要高于雌性花芽POD 活性，這與溫偉慶等［19］對(duì)銀杏花芽研究相符。陶應(yīng)時(shí)等［20］研究發(fā)現(xiàn)，連香樹(shù)雌、雄個(gè)體的光合特性在生理和生態(tài)方面可能不同，雄性花芽的光合作用與呼吸作用可能強(qiáng)于雌性花芽。POD 被認(rèn)為參與成花信號(hào)誘導(dǎo)因子乙烯的生物合成［21］，POD 活性高時(shí)，參與雌、雄花芽的分化相關(guān)代謝，有助于花芽分化，并且高活性的POD 能有效清除過(guò)氧化物，維持細(xì)胞內(nèi)氧自由基平衡，避免連香樹(shù)花芽受到傷害［18］。

超氧化物歧化酶能夠清除植物體內(nèi)因代謝或其他行為而產(chǎn)生的自由基和活性氧，是一種重要的抗氧化劑，可清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的O2-生成H2O2，保護(hù)暴露在氧氣中的細(xì)胞。雌性花芽SOD 活性高于雄性花芽SOD 活性，但是對(duì)于銀杏與栝樓的研究中雄株的SOD 和POD 活性高于雌株［19，22］。高活性的SOD可維持細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平，保護(hù)花芽免受活性氧的毒害作用，有利于花蕊原基的分化［14］。

可溶性蛋白質(zhì)在植物的生命活動(dòng)中發(fā)揮著供能、免疫、控制生長(zhǎng)分化等功能［23］。蛋白質(zhì)影響著細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂和分化，決定著植物的生長(zhǎng)發(fā)育［24］。本試驗(yàn)中，連香樹(shù)花芽分化發(fā)育初期、分化完成期可溶性蛋白質(zhì)合成活躍并逐漸積累，當(dāng)其含量達(dá)到最高值后花芽休眠，準(zhǔn)備越冬并進(jìn)行春化作用，表明高含量的可溶性蛋白質(zhì)有利于花芽分化。連香樹(shù)花芽在春季快速發(fā)育期及開(kāi)花期可溶性蛋白質(zhì)的消耗量大，表明可溶性蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞的分化與形成有重要作用。胡靜等［14］對(duì)西紅花花芽研究結(jié)果也驗(yàn)證了此觀點(diǎn)。雌株花芽的可溶性蛋白質(zhì)含量高于雄株，這可能與雌株和雄株對(duì)環(huán)境適應(yīng)的差異有關(guān)。雌、雄異株植物種群性別間的偏倚可能直接影響種群的繁育［25］，這可能與造成連香樹(shù)天然繁殖困難的原因有關(guān)。

花芽?jī)?nèi)貯藏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可轉(zhuǎn)化為花芽發(fā)育生長(zhǎng)所需要的養(yǎng)分和能量［26］。可溶性糖是植物生長(zhǎng)發(fā)育及性別分化的主要營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)［27，28］。在本試驗(yàn)中，可溶性糖在連香樹(shù)花芽中的含量呈先輕微下降再上升再下降的變化過(guò)程，表明在連香樹(shù)花芽分化發(fā)育初期及分化完成期可溶性糖消耗與合成基本持平，隨花芽的進(jìn)一步發(fā)育，花芽中可溶性糖合成加快并逐漸積累，從而支持連香樹(shù)花芽在春季快速發(fā)育期及開(kāi)花期可溶性糖的大量消耗。與胡靜等［14］對(duì)西紅花研究中得出的可溶性糖含量可能限制花芽形成的結(jié)論相同。

丙二醛可對(duì)直接影響細(xì)胞膜上的各結(jié)合酶的數(shù)目比例和活性強(qiáng)弱，加劇膜脂過(guò)氧化，通常過(guò)量的丙二醛會(huì)使代謝失去調(diào)節(jié)作用，細(xì)胞則會(huì)失去正常的調(diào)節(jié)功能，因而會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生巨大的傷害［15，29］。陳麗麗等［30］對(duì)5 種植物進(jìn)行升溫處理發(fā)現(xiàn)，其葉片在升溫過(guò)程中丙二醛含量均有所降低。李玉舒等［31］研究表明低溫脅迫下木槿丙二醛含量上升。連香樹(shù)雌性花芽在分化階段丙二醛含量上升并在休眠期達(dá)到最高，其變化可能與溫度降低有關(guān)，此時(shí)正值寒冬，連香樹(shù)花芽受低溫脅迫，故丙二醛含量上升。之后，丙二醛含量下降，可能與溫度回升有關(guān)。

花芽分化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，分為形態(tài)分化和生理分化［31，32］。總體來(lái)看，連香樹(shù)雌性花芽的超氧化物歧化酶活性、可溶性蛋白質(zhì)和丙二醛含量顯著高于雄性，表明連香樹(shù)雌、雄花芽分化過(guò)程中出現(xiàn)性別偏移，這可能與連香樹(shù)瀕危有關(guān)。研究連香樹(shù)雌、雄花芽分化過(guò)程中抗逆性指標(biāo)的變化，可對(duì)連香樹(shù)花芽分化過(guò)程有更好的了解，對(duì)于指導(dǎo)瀕危物種的保護(hù)具有重要意義。

通過(guò)對(duì)連香樹(shù)生理生化指標(biāo)的綜合分析，發(fā)現(xiàn)連香樹(shù)花芽分化過(guò)程中雄性花芽總體POD 活性要高于雌性花芽總體POD 活性?；ㄑ糠只^(guò)程中POD 活性的變化可能是連香樹(shù)花芽為了維持細(xì)胞中氧自由基濃度的平衡，保護(hù)花芽免受活性氧的毒害作用的一種響應(yīng)。花芽發(fā)育過(guò)程中可溶性糖與可溶性蛋白質(zhì)含量總是在花芽分化期前積累到最高值并在花芽分化期急劇下降，表明其含量可能與連香樹(shù)花芽的發(fā)育形成具有密切相關(guān)性。不同時(shí)期雌性花芽的可溶性蛋白質(zhì)、丙二醛含量均高于雄性花芽，這可能與連香樹(shù)雌、雄花芽性別分化以及雌株和雄株間對(duì)環(huán)境適應(yīng)的差異有關(guān)。