家畜布魯氏菌病診斷方法與綜合防控研究進(jìn)展

姜子昕，蘭鄒然，邢林林，徐 聰，王建民，胡莉萍*，張 月*

（1.山東省動物疫病預(yù)防與控制中心/山東省人畜共患病流調(diào)監(jiān)測中心，山東 濟(jì)南 250100；2.山東新希望六和集團(tuán)有限公司，山東 青島）

布魯氏菌病（Brucellosis，簡稱“布病”）是由布魯氏菌引起的嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生的人畜共患傳染性疾病，《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定其為乙類傳染病。全世界有 170多個(gè)國家報(bào)道布病疫情的發(fā)生，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，并且布病易感動物高達(dá) 60余種，宿主范圍廣泛，極其不易清除。為了人類健康以及畜牧業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展，規(guī)范正確的診斷方法以及科學(xué)合理的防控措施是當(dāng)前防控工作的重中之重。

1 實(shí)驗(yàn)室診斷方法研究進(jìn)展

1.1 病原學(xué)診斷

1.1.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 布病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)菌分離培養(yǎng)[1]，培養(yǎng)后的布魯氏菌用科茲洛夫斯基染色法觀察，可見散在呈串鏈狀排布的紅色球狀小桿菌。值得注意的是布魯氏菌的分離培養(yǎng)需要在生物安全三級（BSL-3）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，由于病原分離率較低且條件要求嚴(yán)格，操作復(fù)雜，耗時(shí)長，有較大的感染風(fēng)險(xiǎn)，在診斷過程中并不常用[2]。

1.1.2 分子生物學(xué)診斷 分子生物學(xué)診斷是對布魯氏菌基因的深入研究，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）等。（1）PCR技術(shù)主要有普通 PCR、熒光定量 PCR以及多重PCR。普通PCR在1990年用于布病的定性檢測[3]。多重PCR在同一體系中加入兩對及以上的引物，可以快速鑒別布魯氏菌種屬。其中多重 AMOS PCR，因適用于“流產(chǎn)、羊種、綿羊、豬”物種而命名，可區(qū)分布魯氏菌屬物種以及疫苗和野生型菌株[4]。熒光定量PCR（qPCR）可對布魯氏菌核酸進(jìn)行定性定量分析，是目前最為精準(zhǔn)的檢測方法，但對實(shí)驗(yàn)設(shè)備以及人員技術(shù)有一定要求，成本較高，不適用于基層大批量檢測。布魯氏菌PCR技術(shù)采用的最常用目的基因包括IS711 插入序列、per 基因和bcsp31基因。臨床應(yīng)用主要針對保守的bcsp31基因，可避免由物種變化引起的假陰性結(jié)果[4]。董浩等對 3種序列qPCR檢測方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)IS711 qPCR敏感性最高，可用于低核酸量樣品的檢測[5]。（2）LAMP可在恒溫水浴條件下進(jìn)行，根據(jù)顏色變化進(jìn)行結(jié)果判定，不需要專業(yè)的儀器設(shè)備與實(shí)驗(yàn)條件，適合基層實(shí)驗(yàn)室的檢測應(yīng)用。Ohtsuki等[6]首次將LAMP應(yīng)用于布氏桿菌的檢測，該方法能檢測到 10 fg DNA，具有良好的靈敏性。張萌等[7]將建立的 LAMP和 PCR 2種方法比較，在實(shí)際樣品檢測中發(fā)現(xiàn)具有同樣的靈敏度和特異性。

1.2 血清學(xué)診斷

1.2.1 虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT） 虎紅平板凝集試驗(yàn)是一種抗原抗體體外結(jié)合的斑點(diǎn)凝集實(shí)驗(yàn)。該方法靈敏度較高，操作簡單，但由于特異性和準(zhǔn)確性較差，易出現(xiàn)假陽性或假陰性，所以只作為動物布魯氏菌的初篩實(shí)驗(yàn)，對于所測陽性血清需試管凝集實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確診。

1.2.2 試管凝集試驗(yàn)（SAT） 試管凝集試驗(yàn)是布病的確診實(shí)驗(yàn)之一，研究表明，通過用螯合劑如 EDTA處理血清可以增加試驗(yàn)特異性，減少由于IgM引起的交叉反應(yīng)結(jié)果[4]。SAT需眼觀判定，加入一種細(xì)胞染色染料有助于判斷。李翠等[8]將SAT改進(jìn)為微量試管凝集試驗(yàn)（MSAT），操作更為方便快捷，且抗原血清用量較少，相較于 SAT在實(shí)驗(yàn)室診斷中更為常用。

1.2.3 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT） 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)是OIE認(rèn)可的確診布病經(jīng)典方法，同時(shí)也是國際貿(mào)易中牛、羊、綿羊種的指定實(shí)驗(yàn)。雖然該方法靈敏性與特異性在血清學(xué)檢測中均較高，對于 RBT初篩陽性和SAT判定可疑的都可用CFT進(jìn)一步確診，但因?yàn)樵囼?yàn)很難標(biāo)準(zhǔn)化，逐漸被ELISA取代。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分為間接 ELISA（iELISA）和競爭ELISA（cELISA）兩類，iELISA作為布病的初篩實(shí)驗(yàn)，陽性及可疑血清通過 cELISA確診。目前布病iELISA試劑盒多選用O鏈的光滑性脂多糖（LPS-S）作為抗原。近年來利用基因工程技術(shù)，以外膜蛋白 Omp10、Omp16、Omp31、Bp26等作為抗原建立方法，可以達(dá)到診斷粗糙型布魯氏菌的目的。有研究表明，通過 OMP28蛋白抗體在體內(nèi)不同時(shí)期的表達(dá)，可以區(qū)分布病的感染抗體和免疫抗體[9]。基于單克隆抗體的競爭 ELISA 也可以區(qū)別自然感染和 Rev. 1 疫苗接種產(chǎn)生的抗體[10]。孫天浩等將Dps鐵蛋白作為布魯氏菌診斷蛋白建立的iELISA，是對診斷靶標(biāo)的進(jìn)一步探索[11]。ELISA靈敏性和特異性均較高，但易與其他革蘭氏陰性菌發(fā)生反應(yīng)，例如耶爾森氏菌O9和大腸桿菌O157，一定程度影響試驗(yàn)特異性[12]。ELISA是OIE推薦并且國際貿(mào)易指定的牛種布病檢測方法，但ELISA實(shí)驗(yàn)成本較高，步驟繁瑣，需要耗費(fèi)大量時(shí)間，適合實(shí)驗(yàn)室流調(diào)檢測和布病篩查，不適用于快速診斷。

1.2.5 熒光偏振技術(shù)（FPA） 熒光偏振技術(shù)是利用分子大小不同的螺旋特性進(jìn)行的同源性分析方法，常用牛種布氏桿菌 S1119. 3株的 O型脂多糖作為抗原，近年來，孫翠麗等提純了豬種布魯氏桿菌S2株OPS作為抗原，建立的方法經(jīng)檢驗(yàn)具有良好的特異性和敏感性[13]。任燕斌等對FPA、iELISA和cELISA進(jìn)行比較，F(xiàn)PA最佳臨界值95 mp時(shí)，特異性最高，達(dá)到100 %[14]。該方法是OIE指定的國際貿(mào)易中檢測方法之一，歐洲和北美將其作為布魯氏菌病根除檢測方法，其特異性和敏感性較高，操作便捷用時(shí)短，適合在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行應(yīng)用。

1.2.6 瓊脂擴(kuò)散 瓊脂擴(kuò)散（瓊擴(kuò)）試驗(yàn)是一種可溶性抗原與抗體在瓊脂凝膠中進(jìn)行的沉淀反應(yīng)。布魯氏菌瓊擴(kuò)實(shí)驗(yàn)抗原包含脂多糖LPS與野毒株表面的多糖類半抗原（NH）。將抗原滴加在瓊脂凝膠中央孔中，室溫靜置 24~48 h后，觀察加入血清的樣品孔與中央孔之間是否出現(xiàn)沉淀線。如果只出現(xiàn)LPS的沉淀線，則判斷動物很可能只經(jīng)過免疫，沒有感染；如果出現(xiàn)兩條沉淀線，則判斷被檢動物被野毒感染。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)根據(jù)布魯氏菌野毒株與疫苗株表面抗原的差異，可以檢測區(qū)分動物是否被野毒感染[15]。該試驗(yàn)成本較高，操作較為復(fù)雜，敏感度有限，不適用于篩查監(jiān)測以及實(shí)驗(yàn)室推廣。

1.2.7 膠體金免疫層析技術(shù)（GICA） 膠體金免疫層析技術(shù)血清用量少，操作簡單，適合基層臨床檢測。王海麗等[16]將 GICA應(yīng)用到羊種布氏桿菌病的診斷，敏感性和特異性均大于95 %。李巧玲[17]將GICA與cELISA和RBPT 3種方法進(jìn)行比較，GICA檢測效果高于 RBT試驗(yàn)，與cELISA也具有較高符合率，適合作為快速的初篩方法。

2 布魯氏菌病的防控措施

布病的防控關(guān)鍵在于做好生物安全管理措施，包括防控政策支持、動物疫情防控以及傳染病的防控。（1）做到依法防控、科學(xué)防控。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于 2022年印發(fā)了《畜間布魯氏菌病防控五年行動方案（2022-2026年）》，要求積極防御，系統(tǒng)治理。最大限度利用公共資源，使實(shí)施方案有保障。（2）做好動物疫情防控首先要及時(shí)開展流行病學(xué)調(diào)查，摸清底數(shù)，抓住布病的流行特征，針對最易突破環(huán)節(jié)采取措施。同時(shí)加強(qiáng)監(jiān)測，采集樣品主動進(jìn)行監(jiān)測，對發(fā)現(xiàn)的疫情進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)和總結(jié)布病流行規(guī)律，進(jìn)行預(yù)測預(yù)警。加強(qiáng)檢疫的監(jiān)督監(jiān)管工作，外來的牛、羊、豬等易感動物要隔離檢測后再入場。同時(shí)加強(qiáng)相關(guān)畜產(chǎn)品檢疫，檢疫合格后方可上市，對于布病患病畜禁止買賣。發(fā)生疫情時(shí)，按照“早快嚴(yán)小”原則，及時(shí)控制和撲滅疫情，將損失減小到最低[18]。（3）在養(yǎng)殖過程中，對于布病免疫區(qū)加大布病的疫苗接種工作實(shí)施力度，做到應(yīng)免盡免。做好消毒工作，定期開展常規(guī)消毒，發(fā)生疫情時(shí)制定消毒規(guī)范進(jìn)行緊急消毒。做好養(yǎng)殖場的糞污處理，防止環(huán)境污染以及布病的傳播。各地進(jìn)行動物劃區(qū)管理，對各地家畜進(jìn)行歸檔，有利于追根溯源。動物疫控部門定期開展風(fēng)險(xiǎn)評估工作，確定潛在風(fēng)險(xiǎn)，加強(qiáng)管理。對檢測到的陽性病畜予以撲殺淘汰，及時(shí)按照處置規(guī)范進(jìn)行無害化處理。加強(qiáng)宣傳培訓(xùn)工作，提高群眾對布病的防范觀念，尤其是從業(yè)人員的生物安全意識，要提高工作人員素質(zhì)，對從業(yè)人員定期培訓(xùn)，增強(qiáng)個(gè)人防護(hù)能力與意識。布病作為人畜共患病，要注意人病獸防，關(guān)口前移，獸醫(yī)和衛(wèi)生部門密切協(xié)作，建立多部門的聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制，做到人畜同步。

3 小結(jié)

目前布魯氏菌實(shí)驗(yàn)室診斷方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，雖靈敏度、特異性較高，卻時(shí)常有假性結(jié)果的出現(xiàn)，需要兩種以上方法聯(lián)合使用，例如 RBT、iELISA適用于布病初篩，SAT、cELISA用于確診試驗(yàn)。cELISA與瓊擴(kuò)等方法據(jù)報(bào)道能夠區(qū)分野毒感染和疫苗免疫，但仍需進(jìn)一步的開發(fā)研究。通過快速鑒別診斷方法及時(shí)監(jiān)測，并結(jié)合科學(xué)合理的防控措施是目前布病防治的重點(diǎn)。