裙帶菜多糖體外和體內(nèi)降血脂活性

唐茹萌，焦文雅，桑亞新，李曉萌，龐曉宇，劉衛(wèi)華*，王向紅*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001）

高脂血癥是一種脂質(zhì)代謝障礙，是冠心病、心肌梗塞、心源性猝死和其他疾病的主要危險(xiǎn)因素[1]。它通過(guò)對(duì)身體造成隱匿性、進(jìn)行性、全身性和器質(zhì)性損傷而加速全身性動(dòng)脈粥樣硬化[2]。每年全球約有1 200萬(wàn) 人死于由高脂血癥引起的心血管疾病，心血管疾病已成為我國(guó)致死疾病首位[3-4]。因此，尋找預(yù)防和控制高脂血癥的藥物極為重要。目前，大多數(shù)治療高血脂癥的西藥為他汀類藥物，長(zhǎng)期服用會(huì)使人體產(chǎn)生很多副作用。因此，開(kāi)發(fā)天然食物中的降血脂功能性成分已成為研究熱點(diǎn)。相關(guān)研究表明，一些多糖或富含多糖的物質(zhì)具有降血脂作用[5]。

裙帶菜（Undaria pinnatifida）又稱裙帶、海芥菜，是海洋中的天然食材，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[6]。裙帶菜中含有大量的活性成分，被稱為天然海洋蔬菜之首，長(zhǎng)期食用可以有效預(yù)防冠心病、高血脂等疾病[7]。這些活性成分的存在為裙帶菜的深加工和高效利用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和基本條件。而多糖是裙帶菜的主要活性成分之一，它具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗氧化及降血脂等多種功效[8]。本實(shí)驗(yàn)以裙帶菜多糖（Undaria pinnatifidapolysaccharide，PUP）為研究對(duì)象，通過(guò)體外模擬胃腸環(huán)境對(duì)其結(jié)合?；悄懰猁}能力及抑制胰脂肪酶作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，以此評(píng)估其降血脂活性，通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)雄性C57BL/6J小鼠建立高脂血癥模型，以血清血脂、抗氧化及肝臟損傷等為檢測(cè)指標(biāo)，探究PUP干預(yù)對(duì)其降血脂作用，以期為PUP的功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

50 只雄性C57BL/6J小鼠，SPF級(jí)，6～8 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，由斯諾福生物科技有限公司提供。生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010，使用許可證號(hào)：SYXK（冀）2020-013。

裙帶菜 秦皇島市海東青食品有限公司；氯仿、正丁醇 天津福晨化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛磺膽酸鹽、胰脂肪酶 源葉（上海）有限公司；甘油三酯（triglycerides，TG）測(cè)定試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）測(cè)定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；以上試劑均為分析純。

高脂飼料（普通飼料73.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，后同）、豬油10%、膽固醇10%、蔗糖5%、蛋黃粉1%、膽酸鹽0.2%） 北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CP114電子天平 奧豪斯儀器（常州）有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海力辰邦西儀器科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；ECLPSE Ts2倒置顯微鏡 日本Nikon儀器公司；冷凍真空干燥機(jī) 美國(guó)SIM儀器有限公司；1500-28酶標(biāo)儀 美國(guó)賽默飛科技公司。

1.3 方法

1.3.1 裙帶菜多糖的提取

干燥裙帶菜葉片粉碎、除雜，裙帶菜樣品中加入蒸餾水，料液比為1∶30（m/V），90 ℃水浴5 h浸提，水浴后過(guò)濾、抽濾，重復(fù)一次上述操作；將兩次得到的濾液80 ℃旋蒸濃縮至原體積一半后加入等體積的Sevag試劑去除蛋白質(zhì)，劇烈振蕩20 min，4 000 r/min離心5 min，取上層水相，重復(fù)上述操作直至無(wú)變性蛋白產(chǎn)生；在合并后的上層水相中加入3 倍體積的無(wú)水乙醇，使體系中的乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到75%，靜置24 h，離心（4 000 r/min、20 min）取沉淀。將沉淀用適量水溶解，4 ℃冰箱蒸餾水靜置48 h透析（截留分子質(zhì)量8 000～14 000 Da），濃縮，真空冷凍干燥即得PUP。經(jīng)過(guò)多次提取，PUP的得率為3.2%。對(duì)其進(jìn)行化學(xué)成分分析，其中，總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為43.9%，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.18%，糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.96%，硫酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.76%。

1.3.2 裙帶菜多糖結(jié)合?；悄懰猁}能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9]配制模擬胃液和腸液，參照文獻(xiàn)[10]配制?；悄懰猁}溶液，PUP與?；悄懰猁}結(jié)合能力測(cè)定及溶液配制參照張玲等[10]的方法。取1 mL不同質(zhì)量濃度的PUP水溶液于玻璃具塞試管中，加入1 mL模擬胃液，渦旋混勻，37 ℃水浴消化1 h，取出，調(diào)pH值至6.3，再加入4 mL模擬腸液，37 ℃水浴消化1 h。每支試管分別加入4 mL?；悄懰猁}溶液，37 ℃水浴反應(yīng)1 h后，4 000 r/min離心10 min，取2.5 mL上清液，加入3 倍體積的硫酸溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%），混勻后70 ℃水浴20 min，取出立即冰浴5 min，反應(yīng)體系中以水代替牛磺膽酸鹽溶液作為空白，測(cè)定387 nm波長(zhǎng)處吸光度，按式（1）計(jì)算?；悄懰猁}結(jié)合率。

式中：Ai為樣品組的吸光度；A0為空白組的吸光度。

1.3.3 裙帶菜多糖胰脂肪酶活力抑制率測(cè)定

胰脂肪酶活力抑制測(cè)定參考周菲等[11]的方法。將胰脂肪酶用Tri-HCl緩沖液（0.01 mol/L、pH 8.0）配制為0.5 mg/mL酶液。取10 μL 2,4-二硝基苯酚丁酸酯（2,4-dinitrophenyl butanoate，PNPB）并用乙腈定容至5 mL。胰脂肪酶溶液離心（2 000 r/min、5min）取上清液進(jìn)行后續(xù)操作。取300 μL不同質(zhì)量濃度PUP溶液與胰脂肪酶上清液等體積混合，37 ℃孵育30 min后，加入20 μL PNPB溶液，37 ℃反應(yīng)10 min，反應(yīng)體系中以不加入酶溶液作為空白，以不加入PUP溶液作為正常組。反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定405 nm波長(zhǎng)處吸光度，按式（2）計(jì)算抑制率。

式中：A為正常組吸光度；A0為空白組吸光度；Ai為樣品組吸光度。

1.3.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)和分組

50 只C57BL/6J小鼠入動(dòng)物飼養(yǎng)室，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)條件：室溫（23±2）℃、相對(duì)濕度40%～50%的清潔級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室，基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，墊料定期更換。期間觀察小鼠行為狀態(tài)，包括外表、毛發(fā)狀態(tài)、行為、攝食情況等。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行分組。

將小鼠隨機(jī)分為5 組，即正常對(duì)照組（NC）、高脂模型組（HF）、陽(yáng)性對(duì)照組（PC）及低劑量PUP（L-PUP）、高劑量PUP（H-PUP）組，每組10 只進(jìn)行后續(xù)4 周灌胃干預(yù)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design and animal grouping

1.3.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)

灌胃4 周后稱量各組小鼠的體質(zhì)量，禁食不禁水12 h后，摘眼球取血，頸椎脫臼處死，解剖，取出心、肝、脾、腎等臟器，測(cè)定質(zhì)量后于-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.1 小鼠體質(zhì)量的測(cè)定

開(kāi)始干預(yù)后每天記錄小鼠的飲食情況和排泄?fàn)顩r，每3 d記錄小鼠的體質(zhì)量。

1.3.5.2 小鼠血清的收集

干預(yù)4 周后，小鼠禁食12 h，摘除眼球取血，收集血液于1.5 mL離心管中，4 ℃靜置30 min后4 000 r/min離心15 min，吸取上層血清，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.5.3 肝臟組織勻漿液的制備

準(zhǔn)確稱取0.2 g小鼠肝臟組織，加入0.8 mL勻漿介質(zhì)，低溫下用組織勻漿機(jī)研磨，充分研磨后，收集研磨液，于-80 ℃冰箱保存。

1.3.5.4 血清及肝臟血脂的測(cè)定

血清中的TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平以及肝臟組織勻漿液中TG濃度根據(jù)相應(yīng)試劑盒測(cè)定。

1.3.5.5 小鼠抗氧化能力相關(guān)物質(zhì)的測(cè)定

小鼠血清中的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、總抗氧化活性（total antioxidant capacity，T-AOC）及MDA水平根據(jù)相應(yīng)測(cè)定試劑盒測(cè)定。

1.3.5.6 血清中肝酶活力的測(cè)定

血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（asparate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活力根據(jù)相應(yīng)測(cè)定試劑盒測(cè)定。

1.3.5.7 肝臟染色觀察

小鼠取血后，頸椎脫臼處死解剖，取出肝臟后去除表面脂肪，測(cè)量質(zhì)量后投入6～10 倍體積分?jǐn)?shù)4%甲醛溶液中固定。固定7 d后進(jìn)行切片，采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用Excel 2019軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，采用SPSS 24軟件進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，通過(guò)t檢驗(yàn)比較組間差異，P＜0.05表示組間差異顯著，P＜0.01表示組間差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 裙帶菜多糖的體外?；悄懰猁}結(jié)合率

膽酸鹽主要存在于人和動(dòng)物的膽汁中，它是由膽固醇衍生而來(lái)的具有甾核結(jié)構(gòu)的一類兩性大分子，對(duì)脂肪和膽固醇的代謝和脂溶性維生素的消化吸收起重要作用，膽固醇以膽汁酸形式排出體外，膽汁酸可與?；撬峤Y(jié)合形成?；悄懰猁}[12]。減少腸道內(nèi)的膽酸鹽，對(duì)降膽固醇、降血脂有著重要作用。

PUP結(jié)合?；悄懰猁}的能力結(jié)果見(jiàn)圖1，PUP有一定的?；悄懰猁}結(jié)合能力，隨著PUP質(zhì)量濃度的增加牛磺膽酸鹽的結(jié)合率逐漸增加，且與PUP的質(zhì)量濃度之間有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，在PUP質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，對(duì)牛磺膽酸鹽的結(jié)合率可達(dá)到52.3%。相關(guān)研究表明，相同質(zhì)量濃度黑木耳多糖體外對(duì)?；悄懰猁}的結(jié)合率為38.91%[13]，說(shuō)明PUP對(duì)?；悄懰猁}的結(jié)合能力較強(qiáng)。

圖1 不同質(zhì)量濃度PUP結(jié)合?；悄懰猁}能力Fig.1 Tauriine cholate-binding capacity of PUP

2.2 裙帶菜多糖的體外胰脂肪酶活力抑制率

胰脂肪酶可將膳食脂肪逐步水解為甘油和脂肪酸進(jìn)而被機(jī)體吸收，若能抑制其生理活性，則能在一定程度上減少膳食中脂肪的水解吸收，減少體內(nèi)TG的蓄積，在一定程度上可以起到調(diào)節(jié)血脂的作用[4]。研究表明，多糖可與胰脂肪酶及底物結(jié)合，形成三元復(fù)合物，但三元復(fù)合物不能進(jìn)一步分解，以此減少其對(duì)脂肪的水解作用[14]。

如圖2所示，PUP對(duì)胰脂肪酶有一定的抑制能力，隨著PUP濃度的增加胰脂肪酶的抑制率逐漸增加，且與PUP的濃度之間有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，在PUP質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)胰脂肪酶的抑制率可達(dá)31.9%。高于同質(zhì)量濃度的石菜花多糖[15]，說(shuō)明PUP的體外降血脂能力較強(qiáng)。

圖2 不同質(zhì)量濃度PUP胰脂肪酶活力抑制率Fig.2 Inhibitory effect of PUP on lipase activity

2.3 動(dòng)物一般狀態(tài)觀察結(jié)果

實(shí)驗(yàn)期間，各劑量組動(dòng)物狀態(tài)良好。PC組及L-PUP、H-PUP組小鼠給藥過(guò)程及其后均未見(jiàn)明顯相關(guān)的異常表現(xiàn)。

2.4 裙帶菜多糖干預(yù)對(duì)高脂飲食小鼠體質(zhì)量的影響

肥胖是高脂血癥發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素已被廣泛接受和證實(shí)[16]，干預(yù)4 周后分別測(cè)定各組小鼠體質(zhì)量，結(jié)果如圖3所示，HM組小鼠體質(zhì)量顯著高于NC組，說(shuō)明小鼠食用高脂飼料能顯著增加體質(zhì)量；同時(shí)，各劑量組小鼠體質(zhì)量顯著低于HM組（P＜0.05），由此可知，PUP能有效抑制高脂飲食小鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)。

圖3 PUP對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響Fig.3 Effect of PUP on body mass in mice

2.5 裙帶菜多糖干預(yù)對(duì)高脂飲食小鼠肝體比的影響

臟體比又稱臟器系數(shù)，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某臟器的質(zhì)量與其體質(zhì)量的比值[17]。正常情況下各臟器與體質(zhì)量的比值比較恒定。小鼠高脂飲食后，肝臟等臟器的質(zhì)量會(huì)發(fā)生改變，故臟器系數(shù)也隨之而改變。

PUP對(duì)小鼠肝體比的影響如圖4所示，HM組的肝體比極顯著高于NC組，說(shuō)明高脂飲食使小鼠肝臟質(zhì)量占比增加，表明高脂飲食已經(jīng)引起小鼠肝臟脂肪堆積。與HM組相比，PUP干預(yù)組小鼠的肝體比顯著降低，表明PUP的攝入可顯著降低高脂飲食小鼠肝臟內(nèi)部的脂肪蓄積，PUP可加速小鼠對(duì)體內(nèi)脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、排泄，其中高劑量效果更為顯著。

圖4 PUP對(duì)小鼠肝體比的影響Fig.4 Effect of PUP on liver/body mass ratio in mice

2.6 裙帶菜多糖干預(yù)對(duì)高脂飲食小鼠血清血脂的影響

血清血脂檢測(cè)包括血清TG、TC、LDL-C、HDL-C濃度的測(cè)定，對(duì)該4 項(xiàng)的檢測(cè)結(jié)果可判斷高脂血癥模型是否建立成功，并可根據(jù)結(jié)果估計(jì)患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[18]。

PUP干預(yù)對(duì)高脂飲食小鼠血清TG水平的影響如圖5A所示，HM組小鼠血清TG濃度極顯著高于NC組（P＜0.01）。與HM組相比，L-PUP、H-PUP組小鼠血清TG水平顯著下降，下降率分別為17.2%、23.9%，說(shuō)明一定劑量的PUP能較好調(diào)節(jié)小鼠血清TG水平。PUP干預(yù)對(duì)高脂飲食小鼠血清TC水平的影響如圖5B所示，HM組小鼠血清TC水平極顯著高于NC組（P＜0.01）。與HM組相比，L-PUP、H-PUP組小鼠血清TC濃度顯著下降，下降率分別為9.6%、16.2%，說(shuō)明一定劑量的PUP能抑制小鼠血清TC水平的增高。PUP干預(yù)對(duì)高脂飲食小鼠血清LDL-C水平的影響如圖5C所示，HM組小鼠血清LDL-C水平極顯著高于NC組（P＜0.01）。與HM組相比，L-PUP、H-PUP組小鼠血清LDL-C水平顯著下降，下降率分別為14.3%、18.3%，說(shuō)明一定劑量的PUP能有效降低小鼠血清LDL-C水平，其中，高劑量PUP的效果更為顯著。PUP干預(yù)對(duì)高脂飲食小鼠血清HDL-C的影響如圖5D所示，HM組小鼠血清HDL-C水平極顯著低于NC組（P＜0.01）。與HM組相比，L-PUP、H-PUP組小鼠血清HDL-C水平顯著升高，上升率分別為11.8%、16.7%，說(shuō)明PUP能有效增加小鼠血清HDL-C水平。

圖5 PUP對(duì)小鼠血清TG（A）、TC（B）、LDL-C（C）、HDL-C（D）濃度的影響Fig.5 Effect of PUP on the concentrations of serum TG (A), TC (B),LDL-C (C) and HDL-C (D) in mice

2.7 裙帶菜多糖干預(yù)對(duì)高脂飲食小鼠肝臟脂肪濃度的影響

肝細(xì)胞內(nèi)的脂肪堆積會(huì)導(dǎo)致脂肪肝，甚至?xí)鸸谛牟『蛣?dòng)脈硬化疾病的發(fā)作，治療拖延時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起肝硬化和肝癌[19]。為了評(píng)估小鼠肝臟中的脂肪蓄積情況，測(cè)定了小鼠肝勻漿TG濃度。

如圖6所示，與NC組相比，HM組肝臟TG濃度上升，且差異極顯著（P＜0.01），表明小鼠經(jīng)高脂飲食后，肝臟產(chǎn)生大量脂肪蓄積，大量脂肪在肝臟中蓄積可破壞肝臟細(xì)胞的完整性，使肝臟中的炎癥反應(yīng)增加，脂質(zhì)氧化應(yīng)激反應(yīng)增加。而在PUP低、中劑量干預(yù)組肝臟中的TG濃度較HM組極顯著下降（P＜0.01），下降率分別為29.7%、40.9%。表明PUP可降低脂質(zhì)在小鼠肝臟中的蓄積，提高小鼠體內(nèi)的脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)、排泄，從而在一定程度上保護(hù)肝臟，減少體內(nèi)的脂肪蓄積。

圖6 PUP對(duì)小鼠肝臟TG濃度的影響Fig.6 Effect of PUP on liver TG content in mice

2.8 裙帶菜多糖干預(yù)對(duì)高脂飲食小鼠血清生化指標(biāo)的影響

血清中AKP活力可用來(lái)判斷高脂飲食動(dòng)物的肝臟損傷；AST主要分布在肝臟、肌肉等組織中；LDH活力可用來(lái)判斷肝炎、脂肪肝、酒精性肝病及心臟疾病等的發(fā)病情況，正常狀態(tài)下血清中含量極少，這些都是臨床上肝功能檢查的重要指標(biāo)[20]。

如圖7所示，HM組血清肝功能的3 個(gè)指標(biāo)均極顯著高于NC組（P＜0.01），提示高脂飲食可能會(huì)導(dǎo)致一定程度的肝損傷，與HM組相比，PUP干預(yù)組的血清三項(xiàng)指標(biāo)均顯著降低，其中H-PUP組LDH、AKP、AST的活力降低率依次為31.6%、18.6%、11.7%。說(shuō)明PUP在具有一定降血脂作用的基礎(chǔ)上能較好地修復(fù)肝損傷，H-PUP組降低AKP和AST的效果優(yōu)于PC組，說(shuō)明PUP對(duì)肝臟的保護(hù)作用可能優(yōu)于辛伐他汀。

圖7 PUP對(duì)小鼠血清LDH、AKP、AST活力的影響Fig.7 Effect of PUP on the activity of serum LDH, AKP and AST in mice

2.9 裙帶菜多糖干預(yù)對(duì)高脂飲食小鼠抗氧化指標(biāo)的影響

高脂血癥會(huì)使生物機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增加，從而導(dǎo)致機(jī)體抗氧化體系紊亂，對(duì)抗氧化酶的消耗增加，同時(shí)產(chǎn)生過(guò)氧化產(chǎn)物MDA，而MDA在機(jī)體內(nèi)的堆積會(huì)加速生物膜的損傷[2]。有研究表明抗氧化系統(tǒng)的紊亂會(huì)導(dǎo)致高脂血癥進(jìn)一步發(fā)展，形成脂肪肝，并導(dǎo)致肝臟的進(jìn)一步脂肪病變[21]。測(cè)定小鼠血清和肝臟的SOD和GSH水平以及非酶體系T-AOC水平來(lái)評(píng)估小鼠體內(nèi)的抗氧化體系。

由圖8A～C可知，與NC組相比，HM組血清GSH質(zhì)量濃度極顯著降低（P＜0.01），血清SOD活力極顯著減弱（P＜0.01），血清T-AOC極顯著降低（P＜0.01）。說(shuō)明高脂飲食在形成高脂血癥的同時(shí)，由于脂質(zhì)在體內(nèi)的過(guò)度蓄積，會(huì)導(dǎo)致小鼠的抗氧化體系失調(diào)。PUP不同劑量組血清SOD活力顯著高于HM組，血清GSH質(zhì)量濃度、血清T-AOC水平顯著升高，其中，H-PUP組的SOD活力、GSH質(zhì)量濃度和T-AOC水平較HM組分別提高了78.1%、69.4%和18.6%。說(shuō)明PUP可通過(guò)增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的活性保護(hù)小鼠抗氧化體系，使小鼠抗氧化能力加強(qiáng)。

圖8 PUP對(duì)小鼠血清GSH（A）、SOD（B）、T-AOC（C）、MDA（D）水平的影響Fig.8 Effect of PUP on the levels of serum GSH (A), SOD (B),T-AOC (C) and MDA (D) in mice

圖8D顯示了各組小鼠血清MDA濃度的變化，HM組MDA相較于NC組升高25.7%（P＜0.01），說(shuō)明高脂飲食導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增加，降低了生物機(jī)體的抗氧化能力。與HM組相比，L-PUP、H-PUP組MDA濃度顯著降低，下降率為12.1%和23.8%。由于MDA是機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物，表明PUP能抑制機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而降低體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。綜合來(lái)看，PUP能有效抑制生物機(jī)體內(nèi)高脂飲食引起的過(guò)氧化作用，提高機(jī)體抗氧化能力，減少機(jī)體內(nèi)過(guò)氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累。

2.10 小鼠肝臟病理學(xué)觀察

小鼠的肝組織HE染色結(jié)果如圖9所示。NC組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索排列整齊，細(xì)胞質(zhì)染色均勻，細(xì)胞核清晰，未見(jiàn)明顯病理學(xué)變化。HM組小鼠肝臟呈現(xiàn)彌散性脂肪變性，肝細(xì)胞索排列紊亂，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂滴，個(gè)別細(xì)胞細(xì)胞核被擠在邊緣，肝小葉結(jié)構(gòu)較為模糊，伴隨有肝臟組織的氣球樣變性，細(xì)胞排列不緊密，細(xì)胞邊界模糊，間隙變大[22]。這種現(xiàn)象在多糖或藥物干預(yù)后顯著改善，PC組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝組織較為緊密，肝細(xì)胞脂肪變性程度明顯減輕，未見(jiàn)細(xì)胞氣球樣變性。PUP干預(yù)組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)完整、清晰，L-PUP組與H-PUP組相比，細(xì)胞間隙較大，H-PUP組肝臟與NC組相差不大。

圖9 小鼠肝組織病理學(xué)變化（×400）Fig.9 Pathological changes of liver tissues in mice (× 400)

3 討 論

高脂血癥是指由于體內(nèi)脂肪代謝或轉(zhuǎn)運(yùn)途徑異常導(dǎo)致機(jī)體血清TC、TG、LDL-C水平升高，亦或伴有HDL-C的降低[23]。而高血脂癥又是冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病的根本原因，可對(duì)人體造成系統(tǒng)傷害，嚴(yán)重時(shí)這種傷害是不可逆的。據(jù)調(diào)查，目前中國(guó)患心血管疾病人數(shù)約2.9億，致死率高居首位[24]。機(jī)體內(nèi)是通過(guò)血液將脂類物質(zhì)運(yùn)輸至各個(gè)器官與組織之間，通過(guò)檢測(cè)血液中的脂質(zhì)含量可以直接反映生物體的脂肪代謝情況。高脂飲食會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)含量增加，血清TC、TG及LDL-C水平增高，HDL-C水平降低[25]。本研究結(jié)果表明，PUP干預(yù)可減少高脂飲食小鼠體內(nèi)的脂質(zhì)蓄積，降低因高脂飲食導(dǎo)致的體質(zhì)量增加，并降低血清中TC、TG和LDL-C的水平，增加HDL-C的水平。具有調(diào)節(jié)機(jī)體血脂水平的作用，對(duì)高脂血癥的防治有重要作用。

大量研究表明了活性氧（reactive oxygen species，ROS）引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)在血脂異常相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用。ROS可改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，攻擊DNA并引起脂質(zhì)過(guò)氧化，加劇高脂血癥發(fā)展[26]。而機(jī)體內(nèi)血脂水平升高會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生并釋放自由基，動(dòng)脈血管的抗氧化體系被再次破壞，機(jī)體的高血脂會(huì)導(dǎo)致自由基增加，自由基則又加速高血脂的發(fā)生，如此循環(huán)往復(fù)，機(jī)體內(nèi)生物膜的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)遭到破壞[27]。同時(shí)，ROS氧化并修飾LDL-C和MDA形成MDA-LDL-C，導(dǎo)致內(nèi)膜中膽固醇的積累和泡沫細(xì)胞的形成[28]。脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物MDA促進(jìn)機(jī)體TC的積累[29]。MDA含量是反映脂質(zhì)過(guò)氧化水平的重要指標(biāo)，一般將其作為高脂血癥患者氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物。GSH可以降低自由基的活性，抑制機(jī)體內(nèi)過(guò)氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生[30]。SOD主要負(fù)責(zé)清除氧自由基，是機(jī)體內(nèi)抗氧化體系的重要組成部分。T-AOC主要是對(duì)機(jī)體中非酶抗氧化劑防御系統(tǒng)的能力起作用[22]。自由基可以通過(guò)體內(nèi)的抗氧化體系更好地轉(zhuǎn)化為H2O和CO2，從而抑制體內(nèi)過(guò)氧化產(chǎn)物的生成[21]。在本研究中，HM組SOD、T-AOC和GSH的水平顯著低于NC組，而MDA水平則顯著升高。這表明高脂飲食使小鼠體內(nèi)的抗氧化體系失衡。PUP干預(yù)組小鼠的SOD、T-AOC和GSH水平升高，而MDA水平降低，表明PUP可增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)抗氧化酶體系和非酶體系，增加機(jī)體的抗氧化活性，降低脂質(zhì)過(guò)氧化物的含量，從而起到減少氧化應(yīng)激、防止氧化損傷，進(jìn)而達(dá)到降血脂作用。

脂質(zhì)在機(jī)體內(nèi)的蓄積還會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞膜的通透性增加，損害肝細(xì)胞的線粒體，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生極大的傷害。AKP活力一般作為肝?。ㄖ饕獮槟懼俜e）的敏感指標(biāo)，可用來(lái)判斷高脂飲食動(dòng)物的肝臟損傷[31]。LDH活力是肝功檢查中的一項(xiàng)指標(biāo)，其檢測(cè)結(jié)果可用來(lái)判斷脂肪肝、肝炎、酒精性肝病等的發(fā)病情況[32]。AST是主要分布在肝臟細(xì)胞的轉(zhuǎn)氨酶，正常狀態(tài)下血清中含量極少，是臨床上肝功能檢查的指標(biāo)之一[1]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PUP干預(yù)可顯著降低小鼠血清的AKP、LDH、AST的活力，說(shuō)明PUP可以很大程度上減輕由高脂飲食造成的肝臟損傷。

大量研究表明，多糖及富含多糖的化合物具有較好的降血脂作用，其影響機(jī)體脂質(zhì)代謝的機(jī)制主要包括抑制胰腺脂肪酶活力、結(jié)合膽汁酸，減少機(jī)體對(duì)脂質(zhì)類化合物的過(guò)量吸收[33]；促進(jìn)機(jī)體血液中過(guò)量的膽固醇進(jìn)入肝臟，由肝臟代謝后排出體外，由此加速血液中的脂質(zhì)代謝；增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化水平，降低脂質(zhì)過(guò)氧化損傷[34]。本研究結(jié)果顯示，PUP有較強(qiáng)的?；悄懰猁}結(jié)合能力和胰脂肪酶抑制作用，PUP可減少高脂飲食小鼠體內(nèi)的脂質(zhì)蓄積，其中，H-PUP組對(duì)小鼠各項(xiàng)指標(biāo)的改善效果均更為顯著。PUP降血脂機(jī)制可能與抑制胰脂肪酶活力，減少脂質(zhì)攝入；減少膽固醇在肝臟中的積累有關(guān)。此外，減少機(jī)體內(nèi)的過(guò)氧化損傷、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物的形成也能降低高脂飲食對(duì)機(jī)體損傷。但具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的探討。

本研究以PUP為對(duì)象，從體外模擬實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩方面檢測(cè)PUP的降血脂作用，并對(duì)其降血脂機(jī)制進(jìn)行探討。結(jié)果表明，PUP有一定的體內(nèi)外降血脂活性，能明顯提高高脂飲食小鼠的抗氧化水平，且能明顯改善因脂質(zhì)攝入而受損的肝臟。