薇菜多糖的分離純化及體外抗氧化活性

胡彥波，翟麗媛，劉 揚(yáng)，趙偲如，趙 珺*

（長春大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130022）

多糖是由10 個及以上單糖通過糖苷鍵連接而成的聚合物[1]，多存在于動植物和微生物體內(nèi)，整體分為植物多糖、動物多糖和微生物多糖[2]。隨著工業(yè)的飛速發(fā)展，多糖已應(yīng)用于食品[3]、醫(yī)藥[4]和材料[5]等領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有免疫調(diào)節(jié)[6]、抗氧化[7]、抗腫瘤[8]和降低血糖活性[9]等多種功能。

薇菜學(xué)名紫萁（Osmunda japonicaThunb.），屬于紫萁科紫萁屬分株紫萁，是長白山地區(qū)常見的一種山野菜[10]。薇菜的主要營養(yǎng)成分包括多糖、黃酮、有機(jī)酸和蛋白質(zhì)等，具有抗病毒、抗菌、驅(qū)蟲、止血和抗炎鎮(zhèn)痛等作用[11-12]。薇菜作為大宗山野菜，因其獨(dú)特的生物活性被譽(yù)為“山菜之王”，遠(yuǎn)銷日本和韓國等多個國家。薇菜多糖是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖類物質(zhì)[13]，并且膳食纖維的含量在蕨菜、魚腥草和菊苣等9 種野菜中最高[14]。研究表明薇菜多糖除了對機(jī)體的生長發(fā)育和代謝有重要作用外，還具有抗氧化、抗菌和抗腫瘤等功能[15-16]。近年來對薇菜多糖的研究有了初步進(jìn)展，柯瓊?cè)A等[17]利用水提醇沉法從薇菜干中提取薇菜多糖，經(jīng)測定得到其單糖組成為甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸和葡萄糖等，經(jīng)體外抗氧化反應(yīng)測定薇菜多糖對2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸陽離子自由基具有良好的清除效果。Zhang Xueting等[18]利用薇菜多糖制備復(fù)合膜，有效提高了果蔬的保鮮效果，進(jìn)一步證明薇菜多糖具有良好的抗氧化和抗菌活性。

目前對于薇菜多糖的系統(tǒng)分離純化及結(jié)構(gòu)分析研究較少，限制了薇菜多糖相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用。因此，本實(shí)驗(yàn)對薇菜粗多糖進(jìn)行分離純化，并對其純化后的組分進(jìn)行成分分析和體外抗氧化活性的研究，以期為開發(fā)薇菜多糖功能性食品提供理論參考，同時，也為山野菜相關(guān)功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東北薇菜購自吉林省長白山露水河鎮(zhèn)地區(qū)。

苯酚、硫酸、葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、VC、硫酸亞鐵（FeSO4） 北京化工廠有限責(zé)任公司；二乙氨乙基（diethylaminoethyl，DEAE）-纖維素 上海源葉生物科技有限公司；氨基磺酸、半乳糖醛酸、間羥基聯(lián)苯 范德（北京）生物科技有限公司；三氯乙酸天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、氯化鈉（色譜純） 北京化工廠有限責(zé)任公司；牛血清白蛋白 北京索萊寶科技有限公司；考馬斯亮藍(lán) 北京鼎國盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；溴化鉀（KBr）（光譜純） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；1,1-二苯基-2-三硝基甲肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海麥克林生化科技有限公司；水楊酸天津市華東試劑廠；氯化硝基四氮唑藍(lán)（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）、還原型輔酶I（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate，PMS） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1901紫外-可見分光光度計(jì) 深圳億鑫儀器設(shè)備有限公司；Nicolet iS 5傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；3K15臺式高速離心機(jī)、BM312-B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；LC-10AT高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 薇菜粗多糖的提取

采用水提醇沉法提取薇菜粗多糖。稱取新鮮薇菜4 kg，用蒸餾水在料液比1∶20、提取時間4 h的條件下提取薇菜多糖。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將多糖液濃縮至原體積的1/3，加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液過夜醇沉后，4 000 r/min離心20 min棄去上清液得到沉淀，在60 ℃水浴下不停地?cái)嚢韬娓?，除去乙醇后，加蒸餾水（dH2O）溶解，冷凍干燥得到薇菜粗多糖（water soluble polysaccharide ofOsmunda japonica，WOJP），WOJP得率按公式（1）計(jì)算。

1.3.2 薇菜多糖的分離純化

采用DEAE-纖維素對WOJP進(jìn)行分離純化。根據(jù)離子交換柱層析的原理，利用DEAE-纖維素經(jīng)dH2O和NaCl分別洗脫后，制備不帶電荷的中性糖和帶電荷的酸性糖。稱取WOJP粉末2 g，溶解于100 mL dH2O，離心后取上清液緩慢加到DEAE-纖維素層析柱中，待樣品完全進(jìn)入纖維素柱后，用dH2O壓樣兩次，保證樣品完全進(jìn)入纖維素柱，隨后用5 倍柱體積的dH2O洗脫中性糖，流速1.5 mL/min，收集洗脫液，即薇菜中性糖（neutral WOJP，WOJP-N）溶液。再用0～0.5 mol/L NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速2 mL/min，用自動收集器收集洗脫液，6.25 min收集一管。利用苯酚-硫酸法[19]在490 nm波長處測定收集液的吸光度，繪制洗脫曲線圖，確定薇菜酸性糖（acidic WOJP，WOJP-A）梯度洗脫的鹽離子濃度，根據(jù)洗脫曲線圖可得到具有良好對稱性的峰圖，將該峰對應(yīng)的洗脫液收集，即WOJP-A溶液。將WOJP-N溶液和WOJP-A溶液進(jìn)行旋蒸濃縮和透析，最后冷凍干燥，得到WOJP-N和WOJP-A。

1.3.3 薇菜多糖的化學(xué)成分測定

1.3.3.1 糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

采用苯酚-硫酸法[19]測定WOJP、WOJP-N和WOJP-A的糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，配制不同質(zhì)量濃度的葡萄糖溶液，在490 nm波長處測定吸光度。以質(zhì)量葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品配制成質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的多糖溶液，取樣600 μL，加400 μL的dH2O，其余步驟按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟進(jìn)行，做3 組平行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中的糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3.2 糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

采用間羥基聯(lián)苯法[20]檢測WOJP和WOJP-A的糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品；配制不同質(zhì)量濃度的半乳糖醛酸溶液，在525 nm波長處測定吸光度。以半乳糖醛酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品配制成質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的多糖溶液，取樣400 μL，其余步驟按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟進(jìn)行，做3 組平行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中的糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3.3 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

采用考馬斯亮藍(lán)法[21]檢測WOJP、WOJP-N和WOJP-A的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品；配制不同質(zhì)量濃度的牛血清白蛋白溶液，在595 nm波長處測定吸光度。以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的多糖溶液，取樣400 μL，其余步驟按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟進(jìn)行，做3 組平行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3.4 灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

采用馬弗爐灼燒法[22]測定WOJP、WOJP-N和WOJP-A的灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。灼燒坩堝8 h至其質(zhì)量恒定后，稱取待測多糖樣品50 mg，精準(zhǔn)至0.001 g，設(shè)置3 組平行實(shí)驗(yàn)，輕輕搖動振蕩坩堝，使多糖樣品在坩堝中均勻分布。打開馬弗爐爐門，將坩堝置于爐膛內(nèi)，馬弗爐加熱的溫度設(shè)置為550 ℃，灼燒樣品8 h，坩堝冷卻至室溫后稱取質(zhì)量。多糖樣品灼燒至恒質(zhì)量后，稱量并計(jì)算多糖樣品中的灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.4 薇菜多糖分子質(zhì)量的測定

采用高效液相凝膠滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）[23]分析多糖的均一性和分子質(zhì)量，高效液相色譜系統(tǒng)配備折射率檢測器（refractive index detector，RID）和超水凝膠線性凝膠過濾色譜柱。稱取1 mg多糖樣品置于1.5 mL微型離心EP管中，加入200 μL超純水（ddH2O），完全溶解多糖樣品。0.22 μm無機(jī)相濾膜過濾，然后進(jìn)行HPGPC檢測。

HPGPC分析：采用Shimadzu HPLC系統(tǒng)（配有CTO-20A泵和RID-20折射率檢測器），TSK-gel G-3000 PWXL色譜柱（7.8 mm×300 mm），流動相為NaCl（0.15 mol/L）-ddH2O，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，檢測波長245 nm。

1.3.5 薇菜多糖單糖組成測定

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生化和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測分析單糖組成[24]。稱取1 mg多糖樣品置于酸水解小瓶中，加入1 mL的2 mol/L鹽酸-甲醇溶液，充N2密封后，置于80 ℃金屬浴中水解10 h后用空氣泵吹干，再加入1 mL的2 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）溶液，于120 ℃金屬浴中水解1 h，用空氣泵吹干除去TFA溶液。分別吸取100 μL質(zhì)量濃度1 mg/mL的甘露糖（mannose，Man）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）、鼠李糖（rhamnose monohydrate，Rha）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）、葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）、木糖（xylose，Xyl）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）和巖藻糖（fucose，F(xiàn)uc）標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)品混合液，置于酸水解小瓶中備用。

向完全酸水解后得到的干燥樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中加入500 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，使樣品充分溶解，再加入500 μL的PMP-甲醇溶液，使其混合，取200 μL混合液于1.5 mL EP管中。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品在70 ℃條件下水浴反應(yīng)0.5 h，分別加入100 μL 0.3 mol/L HCl溶液，充分混勻后加入700 μL CH3Cl，充分振蕩后，棄去CH3Cl層，保留水層，重復(fù)操作萃取3 次。0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾，然后進(jìn)行HPLC檢測。

HPLC分析：采用HPLC系統(tǒng)（配有CTO-20A泵和SPD-20AVD紫外光檢測器），DIKMA Inertsil ODS-3色譜柱（4.6 mm×150 mm），流動相為磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.2 mol/L、pH 7.0）-乙腈（81∶19，V/V），流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，檢測波長245 nm。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

將1 mg樣品粉末和180 mg KBr混合研磨，壓片機(jī)壓片。樣品測試前進(jìn)行背景掃描去除干擾，在4 000～500 cm-1的條件下，測定多糖的有機(jī)官能團(tuán)[25]。

1.3.7 薇菜多糖抗氧化活性的測定

考慮到結(jié)果的全面性，將樣品質(zhì)量濃度分別設(shè)定為0.5、1、2、5 mg/mL和10 mg/mL[26]，以期得到較完整的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，達(dá)到分析薇菜多糖體外抗氧化活性的目的。

1.3.7.1 還原力測定

還原力的測定根據(jù)文獻(xiàn)[27]稍作修改，配制5 個質(zhì)量濃度梯度的多糖樣品溶液，分別取1 mL樣品溶液，加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的PBS和2.5 mL 體積分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀溶液混合，于50 ℃下恒溫水浴20 min，迅速冰浴冷卻，加入1 mL的體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液混合均勻后8 000 r/min離心5 min，取1.5 mL上清液加入1.5 mL dH2O、1.5 mL體積分?jǐn)?shù)0.1%的FeCl3溶液混勻，靜置10 min，在700 nm波長處測定吸光度，以VC為陽性對照，每個樣品測定3 次取其平均值，通過比較樣品和VC的吸光度，判斷多糖的還原能力。

1.3.7.2 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除率的測定根據(jù)文獻(xiàn)[28]稍作修改。分別取0.6 mL不同質(zhì)量濃度的多糖樣品溶液和2.4 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液混合均勻，避光反應(yīng)30 min后，在517 nm波長處測定混合溶液的吸光度A1，同時測定用dH2O作空白對照的吸光度A0以及無水乙醇代替DPPH溶液作對照的吸光度A2，以VC為陽性對照，每個樣品測定3 次取其平均值，按公式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A0為0.6 mL dH2O+2.4 mL DPPH的吸光度；A1為0.6 mL樣品溶液+2.4 mL DPPH的吸光度；A2為0.6 mL樣品溶液+2.4 mL無水乙醇的吸光度。

1.3.7.3 羥自由基清除能力測定

羥自由基清除率的測定根據(jù)文獻(xiàn)[29]稍作修改，分別取500 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液與1 mL FeSO4、1 mL水楊酸、1 mL過氧化氫（H2O2）混合，25 ℃室溫下靜置避光反應(yīng)30 min，測定其在510 nm波長處的吸光度A1，以dH2O代替H2O2測得吸光度A2，以dH2O代替樣品測得吸光度A0，以VC為陽性對照。每個樣品測定3 次取其平均值，按公式（3）計(jì)算羥自由基清除率。

式中：A0為500 μL dH2O+1 mL水楊酸+1 mL H2O2的吸光度；A1為500 μL樣品溶液+1 mL水楊酸+1 mL H2O2的吸光度；A2為500 μL樣品溶液+1 mL水楊酸+1 mL dH2O的吸光度。

1.3.7.4 超氧陰離子自由基清除能力測定

超氧陰離子自由基清除率的測定根據(jù)文獻(xiàn)[30]稍作修改，分別取50 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液與50 μL 300 μmol/L NBT、50 μL 936 μmol/L NADH、50 μL 120 μmol/L PMS混合均勻后，避光反應(yīng)30 min，測定其在570 nm波長處的吸光度A1，以dH2O代替樣品測得吸光度A0，以dH2O代替PMS測得吸光度A2，以VC為陽性對照。每個樣品測定3 次取其平均值，超氧陰離子自由基清除率按公式（4）計(jì)算。

式中：A0為50 μL dH2O+50 μL NBT+50 μL NADH+50 μL PMS的吸光度；A1為50 μL樣品溶液+50 μL NBT+50 μL NADH+50 μL PMS的吸光度；A2為50 μL樣品溶液+50 μL NBT+50 μL NADH+50 μL dH2O的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，使用SPSS 24.0數(shù)據(jù)處理軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用多重比較法進(jìn)行顯著性分析（以P＜0.05表示差異顯著），使用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 薇菜多糖的分離純化

2.1.1 陰離子交換柱層析法分離純化薇菜多糖

通過水提醇沉法對薇菜粗多糖WOJP進(jìn)行提取，測定WOJP的得率為9.3%。進(jìn)一步利用陰離子交換柱層析法對WOJP進(jìn)行分離純化，薇菜多糖的梯度洗脫結(jié)果如圖1所示。薇菜粗多糖經(jīng)過分離純化得到2 個多糖組分，分別為dH2O洗脫獲得的中性糖WOJP-N和0.2 mol/L NaCl洗脫獲得的酸性糖WOJP-A。收集樣品，濃縮、透析、凍干后分別得到棕色和白色粉末。進(jìn)一步測定WOJP-N的得率為23.4%，WOJP-A的得率為26.3%。WOJP-N和WOJP-A的得率均在25%左右，作為WOJP的主要組成成分，兩者均具有一定的研究應(yīng)用價(jià)值，因此對兩者進(jìn)行進(jìn)一步的分析測定。

圖1 薇菜多糖的梯度洗脫圖Fig.1 Gradient elution curve of polysaccharides from Osmunda japonica

2.1.2 薇菜多糖的化學(xué)成分分析結(jié)果

對WOJP、WOJP-N和WOJP-A的化學(xué)成分進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示，WOJP、WOJP-N和WOJP-A的糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為73.2%、38.5%和49.0%，WOJP-A的糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于WOJP-N，說明在薇菜多糖組分中，酸性糖中的可溶性多糖含量高于中性糖。WOJP和WOJP-A的糖醛酸含量差異不明顯，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在68%左右，說明薇菜多糖中的糖醛酸含量集中于酸性糖組分中，中性糖中含有微量或幾乎沒有游離糖醛酸成分。WOJP-N和WOJP-A的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯低于WOJP，鑒于接下來的抗氧化實(shí)驗(yàn)主要研究薇菜多糖不同組分體外抗氧化活性之間的關(guān)系，蛋白質(zhì)的存在對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響不起決定性因素，因此，不進(jìn)行進(jìn)一步的脫蛋白處理。WOJP、WOJP-N和WOJP-A的灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)略高，證明薇菜多糖中含有少量無機(jī)鹽等雜質(zhì)。

表1 薇菜多糖的化學(xué)成分分析Table 1 Chemical composition analysis of polysaccharides from Osmunda japonica

2.2 薇菜多糖的分子質(zhì)量分析結(jié)果

采用HPGPC測定WOJP-N和WOJP-A的分子質(zhì)量。由圖2可知，兩種多糖的色譜圖均主要存在一個明顯的特征峰，經(jīng)過計(jì)算可知，WOJP-N的主要分子質(zhì)量分布在31.8 kDa左右，WOJP-A則主要分布在15.7 kDa左右。但同時二者均存在若干響應(yīng)值較低的雜峰，說明WOJP-N和WOJP-A均不是均一多糖。

圖2 WOJP-N和WOJP-A的高效凝膠滲透色譜Fig.2 Determination of molecular mass of WOJP-N and WOJP-A by high performance gel permeation chromatography

2.3 薇菜多糖的單糖組成分析結(jié)果

進(jìn)一步通過HPLC測定薇菜多糖的單糖組成，以9 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品為對照，結(jié)果表明，WOJP、WOJP-N和WOJP-A的單糖組成存在明顯差異。經(jīng)過計(jì)算各單糖的物質(zhì)的量比，結(jié)果如表2所示，WOJP中的主要單糖組分及其物質(zhì)的量比是GalA∶Glc∶Gal∶Ara＝41.0∶15.5∶23.7∶5.8；WOJP-N中的主要單糖組分及其物質(zhì)的量比是Rha∶GalA∶Glc∶Gal∶Xyl∶Ara＝9.1∶5.7∶13.3∶37.6∶5.6∶11.8；WOJP-A中的主要單糖組分及其物質(zhì)的量比是Rha∶GalA∶Gal∶Ara＝7.0∶56.4∶26.1∶5.2。分析各單糖組成的結(jié)果可知，WOJP主要由GalA、Glc和Gal組成；WOJP-N主要由Glc、Gal和Ara組成，推測其可能由阿拉伯半乳聚糖（arabinogalactan，AG）型果膠（主要含有β-Galp和α-Araf）和葡聚糖組成[31]；而WOJP-A的組成成分中則主要含有GalA和Gal，推測其可能由半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonan，HG）型果膠（主要含有α-1,4-GalpA）和半乳聚糖（主要含有β-Galp）組成[32]。

表2 薇菜多糖的單糖組成Table 2 Monosaccharide composition of polysaccharides from Osmunda japonica

2.4 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

利用傅里葉變換紅外光譜對薇菜多糖進(jìn)行分析，如圖3所示，WOJP、WOJP-N和WOJP-A在3 400 cm-1附近的吸收峰為多糖O—H伸縮振動特征峰；在2 930 cm-1附近的吸收峰為多糖類物質(zhì)C—H伸縮振動所產(chǎn)生，這是糖類物質(zhì)的兩個特征吸收峰[33]；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，WOJP-A在1 740 cm-1處具有明顯的酯化糖醛酸特征吸收峰，且在1 410 cm-1附近處有COO—對稱伸縮振動吸收峰[34]，說明WOJP-A中含有較多的糖醛酸，且存在部分酯化修飾；此外，還可以觀察到WOJP和WOJP-A在1 100 cm-1和1 020 cm-1附近具有C—O—C和C—O—H中C—O的伸縮振動吸收峰，是吡喃環(huán)的特征吸收峰[35]，說明WOJP和WOJP-A均含有吡喃糖環(huán)，其中WOJP-A含量最多；在890 cm-1附近的吸收峰可以歸屬于β-糖苷鍵的振動[36]，表明WOJP-N中主要含有β-糖苷鍵。結(jié)合單糖組成分析結(jié)果可以推斷：WOJP-N主要由β-構(gòu)型的半乳糖組成，WOJP-A主要由吡喃半乳糖醛酸組成，且存在部分酯化修飾。

圖3 薇菜多糖的傅里葉變換紅外光譜Fig.3 FTIR spectra of polysaccharides from Osmunda japonica

2.5 薇菜多糖的體外抗氧化活性

2.5.1 還原能力分析結(jié)果

薇菜多糖對Fe3+的還原能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。隨著薇菜多糖質(zhì)量濃度增加，F(xiàn)e3+還原力均呈上升趨勢。在相同質(zhì)量濃度下，WOJP對Fe3+的還原力明顯高于WOJP-N和WOJP-A，其中WOJP-A對Fe3+的還原力最弱。研究表明，多糖的還原能力是其判斷抗氧化活性的一個重要指標(biāo)，其抗氧化活性與單糖組成密切相關(guān)[37-38]。與WOJP-A相比，WOJP和WOJP-N單糖組成中Glc的含量相近，且高于WOJP-A中Glc的含量；同時，WOJP-A中GalA的含量明顯高于WOJP-N，略高于WOJP。這幾種糖組成的差異可能是導(dǎo)致WOJP和WOJP-N還原Fe3+能力相當(dāng)，且高于WOJP-A的主要原因。此外，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/mL時，WOJP-N對Fe3+還原力與VC相當(dāng)，而WOJP在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時對Fe3+的還原力已經(jīng)與VC相當(dāng)。因此，在進(jìn)行WOJP的還原能力分析時可將樣品質(zhì)量濃度控制在5 mg/mL，以達(dá)到節(jié)省樣品的目的。結(jié)果表明WOJP對Fe3+的還原能力的主要活性多糖組分為WOJP-N。

圖4 不同質(zhì)量濃度薇菜多糖的Fe3＋還原能力Fig.4 Fe3+-reducing power of polysaccharides from Osmunda japonica

2.5.2 DPPH自由基清除能力分析結(jié)果

薇菜多糖對DPPH自由基的清除能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。薇菜多糖是多羥基化合物，具有很強(qiáng)的還原性，極易與DPPH發(fā)生氧化反應(yīng)生成醌類物質(zhì)。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度從0.5 mg/mL增加到10 mg/mL時，WOJP的DPPH自由基清除能力逐漸增強(qiáng)。在10 mg/mL下，WOJP對DPPH自由基的清除能力達(dá)到100%，與VC的清除能力相當(dāng)。WOJP-A隨著質(zhì)量濃度的提高，其DPPH自由基清除能力增強(qiáng)。在10 mg/mL下，WOJP-A的DPPH自由基清除率為72.46%。WOJP-N的DPPH自由基清除能力從2 mg/mL提高到10 mg/mL，清除能力增長較為緩慢。而在10 mg/mL濃度下，WOJP-N的DPPH清除率為86.39%，其清除率接近WOJP。由此可以推斷，對于薇菜多糖的DPPH自由基清除能力，WOJP-N為主要活性多糖組分。與冬棗多糖[38]、茶粕多糖[39]和刺五加果多糖[40]等多數(shù)植物多糖相比，薇菜多糖具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基能力，可作為新型的天然抗氧化劑。

圖5 不同質(zhì)量濃度薇菜多糖的DPPH自由基清除能力Fig.5 DPPH radical-scavenging capacity of polysaccharides from Osmunda japonica

2.5.3 羥自由基清除能力分析結(jié)果

通過測定薇菜多糖對羥自由基的清除能力，分析薇菜多糖的抗氧化活性，結(jié)果如圖6所示。薇菜多糖對羥自由基具有一定的清除能力。隨著質(zhì)量濃度的增加，薇菜多糖清除羥自由基的能力也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，WOJP的羥自由基清除能力為75.50%，WOJP-A的羥自由基清除能力為73.60%，而WOJP-N的羥自由基清除能力為49.17%，說明WOJP和WOJP-A的羥自由基清除能力相當(dāng)且強(qiáng)于WOJP-N。研究表明多糖清除羥自由基的機(jī)制可能是通過糖醛酸與亞鐵離子耦合，從而抑制羥自由基的產(chǎn)生[41-42]。由于WOJP-A和WOJP中半乳糖醛酸含量較高，即含有的糖醛酸較高，而WOJP-N中含有的糖醛酸極低，因此，WOJP中清除羥自由基的主要活性多糖組分為WOJP-A。

圖6 不同質(zhì)量濃度薇菜多糖的羥自由基清除能力Fig.6 Hydroxyl radical-scavenging capacity of polysaccharides from Osmunda sinensis

2.5.4 超氧陰離子自由基清除能力分析結(jié)果

通過測定薇菜多糖清除超氧陰離子自由基的能力，分析薇菜多糖的抗氧化活性，結(jié)果如圖7所示。隨著質(zhì)量濃度的增加，WOJP和WOJP-N清除超氧陰離子自由基的能力增強(qiáng)顯著（P＜0.05），呈現(xiàn)明顯的質(zhì)量濃度依賴性，而WOJP-A對質(zhì)量濃度的依賴性較低。此外，隨著質(zhì)量濃度的升高，WOJP和WOJP-N的清除超氧陰離子自由基的能力相當(dāng)，且均高于WOJP-A，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/mL時，WOJP的超氧陰離子自由基清除率為91.09%，WOJP-N的超氧陰離子自由基清除率為93.59%，而WOJP-A的超氧陰離子清除率為61.05%。由此可以推斷，WOJP清除超氧陰離子自由基的主要活性多糖組分為WOJP-N。研究表明，不同分子質(zhì)量、糖苷鍵類型以及單糖組成的多糖清除超氧陰離子自由基能力不同，其中含有β-糖苷鍵的多糖清除自由基能力較強(qiáng)[43-44]。比較WOJP-N和WOJP-A中糖苷鍵的構(gòu)型可知，WOJP-N中含有較多的β-糖苷鍵，這可能是導(dǎo)致WOJP-N具有較高清除超氧陰離子自由基能力的主要原因。

圖7 不同質(zhì)量濃度薇菜多糖的超氧陰離子自由基清除能力Fig.7 Superoxide anion radical-scavenging capacity of polysaccharides from Osmunda japonica

綜上所述，根據(jù)薇菜多糖的4 種體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：WOJP-N和WOJP-A在清除自由基以及還原Fe3+能力方面表現(xiàn)出不同活性。其中WOJP-N清除DPPH自由基和超氧陰離子自由基的能力以及還原Fe3+的能力與WOJP基本相當(dāng)，而WOJP-A相對較弱；WOJP-A清除羥自由基的能力與WOJP基本相當(dāng)，而WOJP-N相對較弱。在4 種體外抗氧化活性中，WOJP均表現(xiàn)出較好的活性，其主要原因是兩者在WOJP的體外抗氧化活性中起協(xié)同作用，從而使WOJP發(fā)揮抗氧化作用。因此，WOJP-N和WOJP-A均是WOJP抗氧化能力的主要活性組分。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過水提醇沉技術(shù)對薇菜多糖進(jìn)行提取，利用DEAE-纖維素離子交換柱層析對其進(jìn)行分離純化，獲得2 種多糖組分WOJP-N和WOJP-A，并對其組成成分和體外抗氧化活性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，WOJP-N和WOJP-A的分子質(zhì)量分別為31.8 kDa和15.7 kDa，化學(xué)成分分析表明2 種多糖存在一定差異，傅里葉變換紅外光譜測定發(fā)現(xiàn)WOJP-N主要由β-構(gòu)型的半乳糖組成，WOJP-A主要由吡喃半乳糖醛酸組成，且存在部分酯化修飾。4 種體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，WOJP具有很好的抗氧化活性，其抗氧化活性與VC相當(dāng)。進(jìn)一步明確了在WOJP發(fā)揮抗氧化活性時，WOJP-N和WOJP-A具有協(xié)同作用。上述研究結(jié)果可為薇菜多糖的應(yīng)用提供理論依據(jù)，對薇菜綜合開發(fā)利用具有一定意義。