漂洗對羅非魚魚糜凝膠特性的影響

姜鵬飛，于文靜，朱凱悅，趙文宇，鄭杰，孫娜*

（1.大連工業(yè)大學 食品學院，國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034；2.遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院，遼寧 大連 116023）

羅非魚（Oreochromis niloticus），通常生活于淡水中，適應性強，大多數(shù)是雜食性的。羅非魚因具有生長快、繁殖量大、容易養(yǎng)殖、產(chǎn)量高四大特點，已經(jīng)成為世界各國重要的淡水養(yǎng)殖魚類[1]。據(jù)聯(lián)合國糧農組織統(tǒng)計，2019年我國羅非魚產(chǎn)量為164.17萬噸[2]。我國主要出口羅非魚的初級加工產(chǎn)品，產(chǎn)品形式單一，價格低廉。因此，我國應發(fā)展消費者青睞的羅非魚產(chǎn)品，如魚糜制品[3]，以此來擴大國內市場，滿足不同群體的消費需求。

近年來，魚糜的營養(yǎng)價值被越來越多的消費者認可，在國際市場上的消費量不斷增加。隨著我國冷凍魚類食品行業(yè)的發(fā)展，魚糜制品取得了良好的進展。未漂洗魚糜生產(chǎn)技術既能保留魚肌肉中的營養(yǎng)和風味物質，又能實現(xiàn)節(jié)能減排。然而，我國淡水魚糜生產(chǎn)加工中存在著未漂洗魚糜凝膠強度差、凝膠易劣化等問題，所以漂洗工藝必不可少，漂洗可降低水溶性蛋白的含量，顯著提高鹽溶性蛋白相對含量，提高魚制品彈性和持水性。此外，漂洗可以去除污物、血液、脂質、無機鹽成分和一些含氮化物等雜質[4]，從而改善魚糜的顏色和風味，同時漂洗還可以改善魚糜的質構特性[5]。因此，以羅非魚為研究對象，將常規(guī)漂洗工藝魚糜與未漂洗魚糜進行比較，并利用物性學、流變學、低場核磁共振技術、顯微成像技術等研究方法，研究漂洗對羅非魚魚糜凝膠特性的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

冷凍羅非魚：海南翔泰漁業(yè)有限公司，于-18℃冷庫冷凍保存。

氯化鈉、無水乙醇、醋酸（均為分析純）：大連博諾有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒、十二烷基硫酸鈉（分析純）：北京寶希迪有限公司。

1.2 儀器與設備

斬拌機（MJ-LZ225）：美的集團股份有限公司；測色儀（UltraScan PRO）：美國 HunterLab公司；物性儀（TA.XT.plus）：英國 Stable Micro Systems公司；核磁共振成像分析儀（MesoQMR23-060H）：蘇州紐邁電子科技有限公司；流變儀（Discovery HR-1）：常州德杜精密儀器有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR-650S）：鉑金埃爾默儀器有限公司；熱場發(fā)射掃描電鏡（JSM-7800F）：日本電子株式會社；電泳儀（AE-8135）：日本ATTO公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理方法

1.3.1.1 未漂洗羅非魚魚糜的制備

冷凍羅非魚于4℃的冷藏冰箱緩化12 h，去頭、尾、皮，采肉，將魚肉洗凈并瀝干水分，使用斬拌機將羅非魚肉進行第一次斬拌5 min，加入3%的氯化鈉溶液，再進行第二次斬拌5 min，使魚肉中的鹽溶性蛋白充分溶出。控制制備溫度低于10℃。

1.3.1.2 漂洗魚糜的制備

使用絞肉機將未漂洗羅非魚魚糜斬拌5 min，用3倍體積的冰水漂洗3次，每次5 min（最后一次冰水中放入0.3%氯化鈉溶液），漂洗后倒掉廢液，向脫水后的碎肉中加入3%的氯化鈉溶液并斬拌5 min，使魚肉中的鹽溶性蛋白充分溶出。斬拌過程控制溫度低于10℃。

1.3.1.3 羅非魚魚糜的制備

將斬拌好的肉泥擠入腸衣中，用棉線封口后采用兩段加熱法進行熟制。首先在40℃下加熱30 min，使魚糜蛋白充分凝膠化，然后90℃下加熱20 min。將加熱完成的魚糜取出，置于冰水中冷卻至室溫（25℃），4℃冰箱中放置12 h，以備后續(xù)試驗。

1.3.2 白度的測定

采用測色儀對直徑2.5 mm、高2.5 mm的樣品色度進行測定，計算其白度值，每組樣品平行測定3次[6]，計算公式如下。

式中：L*為明暗度；a*為紅綠度；b*為黃藍度。

1.3.3 持水率（water holding capacity，WHC）測定

參照Mao等[7]方法，稱取樣品5 g，用濾紙將其包裹，在6 500 r/min、10℃條件下離心10 min，每組樣品測定4次，取平均值。計算公式如下。

式中：W0為樣品的原始質量，g；W1表示樣品離心后的質量，g。

1.3.4 低場核磁共振（low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）測定

LF-NMR測定參考Pan等[8]的方法進行修改，大約4 g樣品放入直徑40 mm核磁管，而后放入儀器中。自旋-自旋弛豫時間T2用Carr-Purcell-Mebiboom-Gill（CPMG）序列進行測量，所使用參數(shù)：90℃脈沖時間所對應的P1為23 μs，180℃脈沖時間所對應的P2為44 μs，采樣帶寬SW為100 kHz，重復采樣等待時間TW為3 000，回波個數(shù)NECH為10 000，利用核磁共振弛豫時間反演擬合軟件得到T2圖像。

1.3.5 核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）測定

MRI測定參考臧秀等[9]方法進行修改，采用變溫核磁共振成像分析儀，利用多層自旋回波（spin echo，SE）序列對羅非魚魚糜進行核磁共振成像，弛豫時間T1和橫向弛豫時間T2加權成像。參數(shù)設置：層數(shù)為6，視野Fov為100 mm×100 mm，層厚為0.9 mm，層間隙為1.9 mm，尺寸為256，像素為192，掃描次數(shù)為 2，T1加權成像的重復時間為200 ms，回波時間為20 ms，T2加權成像的重復時間為2 000 ms，回波時間為200 ms。1.3.6 質地剖面分析（texture profile analysis，TPA）

TPA參考Jiao[10]的方法稍作修改，樣品直徑2.5 cm、高2.5 cm，選用P50探頭，測試參數(shù)為測前速度1 mm/s，測試速度1 mm/s，測后速度1 mm/s，下壓比例50%，觸發(fā)力5 g，2次壓縮間隔時間5 s，每個樣品測6次，取平均值。

1.3.7 凝膠強度測定

將樣品切成直徑2.5 cm、高2.5 cm的圓柱形，選取P/5S球形探頭進行測試，設置測試條件為測前速度1 mm/s，測試速度 1 mm/s，測后速度 1 mm/s，下壓比例50%。每組試驗重復6次，取平均值。

1.3.8 流變特性測定

流變特性測定參照黃穎等[11]的方法，夾具直徑選擇20 mm，平板之間間距2.0 mm。采用變溫掃描：設置溫度從25℃升溫到40℃，在40℃保持30 min，然后從40℃升溫到90℃，在90℃保持20 min，升溫速率為1℃/min，測定頻率掃描過程中儲能模量（G′）和損耗模量（G″）的變化。

1.3.9 傅里葉紅外光譜（Fourier infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析

FTIR分析根據(jù)Moreno等[12]的方法，使用傅里葉紅外光譜儀，收集400 cm-1～4 000 cm-1之間的光譜。測試后，對光譜數(shù)據(jù)進行傅里葉去卷積，并使用多重高斯曲線擬合及二階導數(shù)計算。根據(jù)其相應峰面積的相對百分比，計算出不同二級結構的組成，使用軟件OMNIC 8.2.0.387分析記錄光譜。

1.3.10 掃描電子顯微鏡 （scanning electron microscope，SEM）

樣品切成1 cm×1 cm×5 mm，將其浸入2.5%戊二醛溶液，在4℃條件下固定24 h，固定好后將樣品放入真空冷凍干燥機凍干24 h，干燥后將樣品固定在樣品臺上，表面噴金，最后在×5 000倍數(shù)掃描電子顯微鏡下觀察并成像。

1.3.11 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

準確稱取2.0 g樣品，加入18 mL的5%十二烷基硫酸鈉溶液，10 000 r/min均質1 min，置于85℃水浴鍋加熱 1 h，離心（10 000×g，室溫 25℃，30 min）提取上清液，然后用雙縮脲溶液將蛋白濃度調為5 mg/mL，備用。采用15%分離膠和4%濃縮膠進行電泳試驗，全程電壓310 V。染色液采用考馬斯亮藍-R250，采用500 mL乙醇和90 mL醋酸定容到1 L為脫色液[13]。

1.4 統(tǒng)計分析

使用軟件Origin 8.6作圖，通過軟件SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 漂洗對羅非魚魚糜白度的影響

未漂洗魚糜和漂洗魚糜的白度值如圖1所示。

圖1 漂洗對羅非魚魚糜白度的影響Fig.1 Effect of rinsing on the whiteness of tilapia surimi

白度是評價魚糜的一項重要指標，由圖1所示，未漂洗魚糜和漂洗魚糜在L*值和b*值上沒有顯著差異，未漂洗魚糜的a*值略微高于漂洗魚糜，白度值結果表明漂洗魚糜（52.95±7.07）和未漂洗魚糜（47.81±8.06）有顯著差異（P＜0.05）。原因是漂洗可以盡可能去除魚糜中的肌紅蛋白、血紅素和脂質等物質，因此漂洗魚糜的白度值優(yōu)于未漂洗魚糜。也可能因為未漂洗魚糜中的色素發(fā)生熱變性，進一步導致渾濁[14]，而漂洗后可以去除有色物質，從而獲得色白、富有彈性的魚糜制品[15]。另一方面，可能因為漂洗魚糜凝膠強度好，形成較好的網(wǎng)絡結構，增加了光的散射，因此白度較大[5]。

2.2 漂洗對羅非魚魚糜持水力的影響

未漂洗魚糜與漂洗魚糜持水率的比較結果如圖2所示。

圖2 漂洗對羅非魚魚糜持水率的影響Fig.2 Effect of rinsing on water holding capacity of tilapia surimi

持水率可以反映魚糜凝膠保持水分的能力，是魚糜和魚糜制品的一個重要參數(shù)。持水率越高，表示更多的水被結合或者保留在魚糜凝膠網(wǎng)絡中[16]。由圖2所示，漂洗之后可以使魚糜凝膠的持水率得到明顯的改善，達到了91.06%，與未漂洗組魚糜凝膠的持水率（88.13%）相比差異顯著（P＜0.05）。其原因可能是漂洗魚糜的凝膠網(wǎng)絡結構較致密，能夠捕獲更多的水分，其持水性更好[17]。

2.3 漂洗對羅非魚魚糜水分分布和組成的影響

未漂洗魚糜與漂洗魚糜的T2弛豫特性和魚糜水分分布如圖3所示。

圖3 漂洗對羅非魚魚糜水分分布和組成的影響Fig.3 Effect of rinsing on water distribution and composition of tilapia surimi gel

利用低場核磁共振技術觀察魚糜水分分布從而預測魚糜的保水性和凝膠強度[18]。由圖3所示，經(jīng)過反演之后試驗結果顯示共有3個峰，包括T21、T22和T23，分別對應著結合水、不易流動水和自由水。結合水的弛豫時間最短，范圍在0.02 ms～1.5 ms；不易流動水的弛豫時間范圍在20 ms～500 ms，并且氫質子的振幅最高；自由水的弛豫時間范圍在800 ms～1 500 ms。

3種水分狀態(tài)分別對應弛豫峰P21、P22和P23的峰面積比例，結果如表1所示。

表1 羅非魚魚糜的T2弛豫峰峰面積比例變化Table 1 Ratio of T2relaxation peak area of tilapia surimi

由表1可得這兩種試驗組的P21弛豫峰峰面積不存在顯著性差異，并且P21弛豫峰所占的比例幾乎可以忽略，對魚糜凝膠水分分布的影響極小。變化最明顯的是P22弛豫峰峰面積，漂洗試驗組的不易流動水含量較高，表明漂洗組的凝膠網(wǎng)絡更致密、有序。P23弛豫峰峰面積顯示未漂洗組的自由水含量較高，可能是因為部分不易流動水轉化為自由水。

2.4 漂洗對羅非魚魚糜凝膠水質子密度（偽彩色圖像）的影響

未漂洗魚糜與漂洗魚糜的T1和T2加權成像圖如圖4所示。

MRI具有快速、無損、結果準確的優(yōu)點[19]，利用核磁共振成像觀察魚糜的水質子密度，可以為食品原料選擇和加工提供參考。紅色區(qū)域越大，說明水分含量越多，相反水分含量越少藍色區(qū)域越明顯。由圖4所示，在T1和T2加權成像中均顯示未漂洗魚糜比漂洗魚糜的紅色區(qū)域減少，并且可以由圖4C看出未漂洗魚糜的體積減小，圖像中呈現(xiàn)的孔洞越大，說明未漂洗魚糜水分散失越多，水分保持較差。

圖4 漂洗對羅非魚魚糜水質子密度（偽彩色圖像）的影響Fig.4 Effect of rinsing on seed density（false color image）of tilapia surimi

2.5 漂洗對羅非魚魚糜質構的影響

未漂洗魚糜與漂洗魚糜質構測定結果如表2所示。

表2 漂洗對羅非魚魚糜質構的影響Table 2 Effect of rinsing on texture of tilapia surimi

質構特性是魚糜制品中感官評價標準之一，可以表示魚糜品質的鮮度，也是重要的感官評價指標之一。硬度是指樣品第一次擠壓后的最大變形值，咀嚼性代表魚糜凝膠咀嚼的難易程度，一般可作為硬度值的補充參數(shù)[20]，彈性代表受擠壓的樣品去掉擠壓力后恢復原樣的能力，黏聚性是指樣品經(jīng)過第一次擠壓形變后抵抗第二次擠壓的能力[21]。凝膠回復性是指樣品經(jīng)第一次擠壓后回彈的能力。如表2所示，在硬度和咀嚼度方面，未漂洗魚糜[（3 615.5±129.81）g和2 199.9±182.07]顯著高于漂洗魚糜[（2 469.78±87.18）g和1 824.63±81.25]。在彈性方面，漂洗魚糜和未漂洗魚糜有顯著差異。在黏聚性和回復性方面，漂洗魚糜均高于未漂洗魚糜。一般來說黏聚性越強，則魚糜抵抗能力越強，魚糜產(chǎn)品的內聚性越好[5]，其內部凝膠結構結合更強。質構是一個較為綜合的參數(shù)，通過質構儀中的探頭來模擬人類口腔咀嚼食物，從而減少在進行感官評價時產(chǎn)生的個體差異，因此綜合5個指標來看，漂洗魚糜能夠較好地提升羅非魚魚糜的質構特性。

2.6 漂洗對羅非魚魚糜凝膠強度的影響

未漂洗魚糜與漂洗魚糜的破斷力、破斷距離和凝膠強度的試驗結果如圖5所示。

凝膠強度是破斷力和破斷距離的乘積，反映了蛋白質的聚集能力，是衡量魚糜制品凝膠特性的重要指標[22]。由圖5所示，漂洗魚糜的破斷力、破斷距離和凝膠強度分別為（304.57±10.28）g、（12.6±0.26）mm 和（3 839.3±184.28）g·mm，顯著高于未漂洗魚糜（237.51±2.6）g、（6.68±0.05）mm 和（1 585.54±45.85）g·mm（P＜0.05），證明經(jīng)過漂洗后，魚糜凝膠的凝膠性能得到了明顯改善，漂洗魚糜肉質更嫩，富有彈性，咀嚼時更加細膩。

圖5 漂洗對羅非魚魚糜凝膠強度的影響Fig.5 Effect of rinsing on gelation properties of tilapia surimi

2.7 漂洗對羅非魚魚糜流變性質的影響

羅非魚魚糜流變性質如圖6所示。

圖6 漂洗對羅非魚魚糜流變性質的影響Fig.6 Effect of rinsing on rheological properties of surimi of tilapia

對未漂洗魚糜與漂洗魚糜在40℃～90℃區(qū)間內魚糜樣品進行溫度掃描。魚糜凝膠的流變學評價主要包括魚糜儲能模量（G′）、損耗模量（G″），G′代表魚糜凝膠的彈性特性，G″代表魚糜的黏性特性。它是食物蛋白熱誘導凝膠形成能力的良好指標，可以較好地評價在升溫過程中魚糜肌原纖維蛋白的動態(tài)流變行為。如圖6A所示，主要變化為：第一階段在25℃～40℃，G′迅速增加，隨后在40℃～60℃急速下降，之后在60℃～90℃未漂洗魚糜上升，漂洗魚糜在70℃～90℃又呈現(xiàn)下降趨勢。剛開始損耗模量G′上升可能是由受熱展開的蛋白與水的作用增強而導致的[23]。由圖6B所示，在40℃恒溫30 min時，漂洗魚糜與未漂洗魚糜G′均呈上升趨勢，且未漂洗魚糜要高于漂洗魚糜，這可能是由于在相對較低的加熱溫度范圍內，魚糜蛋白處于溶膠狀態(tài)，蛋白質結構保持的較為完整，很少聚合成網(wǎng)絡結構，之后升高溫度，在90℃保持20 min時，漂洗魚糜的G′開始緩慢升高，而未漂洗魚糜的G′開始下降，并在恒溫第15 min時交叉，最終未漂洗的損耗模量G′為3 959.41 Pa，而漂洗之后變?yōu)? 867.94 Pa，提高了22.95%，說明漂洗之后可能加強了魚糜蛋白與水的作用力，促進了蛋白分子的交聯(lián)和內部網(wǎng)絡結構的形成，從而提高了魚糜的流變特性[24]。而未漂洗魚糜損耗模量下降可能是因為蛋白分子展開與聚集程度增強，結構發(fā)生重排，形成凝膠結構，因而增強了其剛性與強度，減弱了流動性，最終使得損耗模量下降[25]。

2.8 漂洗對羅非魚魚糜二級結構的影響

未漂洗魚糜與漂洗魚糜的二級結構如圖7所示。

圖7 漂洗對羅非魚魚糜二級結構的影響Fig.7 Effect of rinsing on secondary structure of tilapia surimi

利用傅里葉紅外光譜儀分析漂洗對羅非魚魚糜凝膠蛋白構象的影響，通過計算測定二級結構中α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲結構的含量。如圖7B所示，漂洗魚糜的α-螺旋含量比未漂洗魚糜低，而其β-轉角、β-折疊以及無規(guī)則卷曲結構均比未漂洗魚糜的含量高，表明漂洗使魚糜蛋白的二級結構發(fā)生變化，在凝膠化過程中魚糜蛋白的緊密的螺旋結構向其他狀態(tài)轉變，有利于蛋白質疏水性基團的暴露，從而提高魚糜的凝膠強度[26]。Zhou等[27]研究證明α-螺旋結構的減少和β-折疊結構的含量的增加，可以使魚糜凝膠的凝膠強度增加。這可能是由于β-折疊結構的表面積較大，而水化強度較弱，有利于蛋白質-蛋白質交聯(lián)，形成凝膠網(wǎng)絡結構[28]。

2.9 漂洗對羅非魚魚糜微觀結構的影響

未漂洗魚糜與漂洗魚糜的微觀結構如圖8所示。

圖8 漂洗對羅非魚魚糜微觀結構的影響Fig.8 Effect of rinsing on the microstructure of tilapia surimi

利用熱場掃描電鏡放大5 000倍，得到漂洗魚糜與未漂洗魚糜凝膠表層的掃描電鏡結果。掃描電鏡應用廣泛，常用在食品科學、生物學、植物學等領域，用于研究各類樣品的表面型貌，從而輔助內在機理的探究觀察。由圖8所示，未漂洗魚糜凝膠表面網(wǎng)格結構疏松，粗糙不平，孔隙大小不一，分布不均勻。漂洗之后魚糜凝膠網(wǎng)絡結構變得完整減少了斷裂，蛋白質之間相互交聯(lián)起來，表面變得光滑平整，使得魚糜凝膠的網(wǎng)絡結構得到加強，從而使得凝膠強度得到提升。Priyadarshini等[14]研究結果表明漂洗魚糜的致密性可以解釋為鹽溶性魚糜蛋白的展開可能暴露了反應基團，導致加熱變性，這些反應基團主要通過疏水相互作用形成了致密的三維網(wǎng)絡結構，從而增強其凝膠強度。

2.10 漂洗對羅非魚魚糜SDS-PAGE電泳圖譜的影響

未漂洗魚糜與漂洗魚糜SDS-PAGE電泳圖譜如圖9所示。

圖9 漂洗對羅非魚魚糜SDS-PAGE圖譜的影響Fig.9 Effect of rinsing on SDS-PAGE pattern of tilapia surimi

蛋白質主要為肌球蛋白重鏈 [myosin heavy chain，MHC（200 kDa）]和肌動蛋白（Actin，48 kDa）[29-30]。由圖 9可以觀察到漂洗魚糜與未漂洗魚糜Actin帶未發(fā)生明顯變化，可能是因為肌動蛋白（Actin）的構象相對穩(wěn)定。與未漂洗魚糜相比，漂洗魚糜的肌球蛋白重鏈（MHC）顯示出更輕的條帶，這是因為洗滌后可減少可溶性肌球蛋白的數(shù)量，可以去除洗滌后的魚糜中的可溶性肌球蛋白。此外35kDa以下蛋白質條帶較少，說明漂洗魚糜蛋白以較大分子聚集交聯(lián)為主[31]。因此，漂洗處理會導致羅非魚魚糜肌原纖維蛋白分子之間發(fā)生一定程度的交聯(lián)和聚集，形成分子質量大的聚集體。

3 結論

漂洗能夠有效地改善羅非魚魚糜的凝膠特性。與未漂洗魚糜相比，漂洗魚糜的白度值由原來的47.81提高到52.95，持水率提高到91.06%，凝膠強度達到了3 839.3 g·mm。流變特性中表明漂洗魚糜使最終儲能模量達到4 867.94 Pa，提高了22.95%。蛋白質二級結構表明漂洗之后魚糜蛋白的α-螺旋降低，β-折疊增加，有利于形成凝膠網(wǎng)絡結構，并且漂洗之后的微觀結果顯示結構較致密，孔隙較少且光滑均勻，凝膠強度得到較好的提升。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜中表明經(jīng)過漂洗之后肌球蛋白重鏈條帶變淡，說明漂洗工藝可使魚糜蛋白之間發(fā)生交聯(lián)與聚集。綜上，漂洗工藝可用于改善羅非魚魚糜凝膠品質。