制何首烏對CTLA-4抗體誘導(dǎo)的PD-1-/-小鼠肝損傷模型的改善作用

王昱 張春盼 王艷 劉立偉 李軻鑫 馬子坤 賈繼東 王伽伯 趙新顏

作為一種傳統(tǒng)的滋補中藥，制何首烏具有降血脂及抗動脈粥樣硬化、抗氧化及抗衰老、保肝、抗骨質(zhì)疏松、抗炎、增強免疫、抗腫瘤等藥理作用，在國內(nèi)乃至世界范圍內(nèi)廣泛使用[1]。近年來何首烏導(dǎo)致的肝損傷(polygonum multiflorum-associated drug induce liver injury, PM-DILI)在全球范圍內(nèi)逐漸升高，成為國內(nèi)外關(guān)注的熱點問題[2-5]。PM-DILI常見于30～60歲的患者，臨床表現(xiàn)主要為黃疸、納差、乏力、腹脹、惡心及嘔吐，病理表現(xiàn)以急性肝炎及急性淤膽性肝炎為主[6]。同時，PM-DILI病例好發(fā)于銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫功能紊亂的患者[7]。何首烏引起的肝損傷與免疫狀態(tài)有關(guān)，而與性別、服藥劑量無顯著相關(guān)，具有不可預(yù)測性，符合特異體質(zhì)性藥物性肝損傷的特征(Idiosyncratic drug-induced liver injury,iDILI)[8]。

為了減少PM-DILI的發(fā)病率，宋海波和沈傳勇[9]提出了何首烏的合理用藥和安全防控的建議。研究表明，不同的炮制方法可減輕何首烏的毒性，炮制后的何首烏能夠降低其特異質(zhì)肝損傷相關(guān)的易感成分：順式二苯乙烯苷和大黃素葡萄糖苷，而這兩種物質(zhì)是何首烏致特異質(zhì)肝損傷的主要成分[10-17]。

目前認(rèn)為PM-DILI具有特異質(zhì)肝損傷的特征，且與機體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)[18]。為此本研究采用基于免疫耐受缺陷的特異質(zhì)肝損傷動物模型觀察制何首烏的作用，從而更好地理解何首烏對肝臟的作用規(guī)律。然而，研究結(jié)果與預(yù)想的方向截然不同，未觀察到制何首烏對免疫耐受缺陷小鼠引起特異質(zhì)肝損傷，而觀察到制何首烏改善了模型小鼠的肝臟組織病理損傷，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

一、實驗材料

SPF級C57BL/6品系的PD-1-/-小鼠10只，體質(zhì)量為(18±2)g，購自上海南方模式生物科技股份有限公司。所有小鼠均在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院動物實驗中心SPF級動物房飼養(yǎng)。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)(19-2023)。

CTLA-4抗體(Bio X Cell, West Lebanon, 美國)。制何首烏配方顆粒購于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京市中醫(yī)醫(yī)院，經(jīng)液相質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測，結(jié)果表明該批次制何首烏未檢測出主要易感成分順式二苯乙烯苷，另一個易感成分大黃素葡萄糖苷的含量低于前期文獻(xiàn)報道的安全限度[17]。Premix Taq(Takara Bio, Kusatsu, 日本)。免疫組織化學(xué)抗體CD3、CD4、CD8、CD38、CD68、CTLA-4(Abcam, Cambridge, 英國)。所有流式熒光抗體購自(e Bioscience, San Diego, 美國)。

二、實驗方法

(一)小鼠基因鑒定 取小鼠尾尖0.5 cm置于0.6 mL EP管，加入A液(50 μL)、B液(50 μL)提取DNA，取2 μL DNA提取物加入10 μL Premix Taq、7 μL超凈水、1 μL引物混勻后，進(jìn)行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳，Bio Rad凝膠成像。

(二)使用CTLA-4抗體聯(lián)合PD-1-/-小鼠建立特異體質(zhì)性肝損傷模型 將小鼠隨機分為對照組和制何首烏組。使用磷酸緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)與CTLA-4抗體進(jìn)行配置，兩組小鼠均于藥物干預(yù)前3 d、前1 d以300 μg/只進(jìn)行腹腔注射，并在給藥期間每周進(jìn)行1次CTLA-4抗體腹腔注射[19]。制何首烏組小鼠以制何首烏溶液灌胃(制何首烏與0.9% NaCl溶液1∶1進(jìn)行配制，濃度為20 g/kg)，對照組小鼠以同等劑量0.9% NaCl溶液灌胃，持續(xù)6周。

(三)動物處理 于實驗第43天使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后處死，取部分肝臟組織保存于4%多聚甲醛溶液中固定, 其余肝臟進(jìn)行組織解離并于酶液 (含0.01%IV型膠原酶, 0.02%BSA, 0.001%DNase I和1 mmol CaCl2)中37℃消化30 min, 經(jīng)密度梯度離心去除雜質(zhì)并純化肝內(nèi)非實質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)行流式抗體染色及檢測。

(四)血漿轉(zhuǎn)氨酶水平測定 使用ALT、AST試劑盒(南京建成生物研究所)進(jìn)行轉(zhuǎn)氨酶水平測定。

(五)病理切片制作 肝組織經(jīng)過脫水、浸蠟、石蠟包埋后制作病理切片。蘇木素-伊紅染色，光鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變。

(六)免疫組織化學(xué)染色 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)免疫組織化學(xué)染色方案[20]：CD4、CD8、CD38、CD56、CD68染色。

(七)流式細(xì)胞檢測 CD4+T細(xì)胞 (NK1.1-CD3+TCRb+CD4+) 、CD8+T細(xì)胞 (NK1.1-CD3+TCRb+CD8+) 、CD4+T細(xì)胞活化(NK1.1-CD3+CD4+CD69+) 、CD8+T細(xì)胞活化 (NK1.1-CD3+CD8+CD69+) 、CD8+T細(xì)胞分泌GZMB (NK1.1-CD3+CD8+GZMB+)、巨噬細(xì)胞(CD45+Ly6G-CD11bhiF4/80mid)、中性粒細(xì)胞(CD45+CD11b+Ly6G+)。

三、數(shù)據(jù)分析軟件

結(jié) 果

一、動物基本狀況

經(jīng)基因鑒定確認(rèn)所選小鼠均為純合PD-1基因敲除小鼠。實驗過程中，對照組小鼠出現(xiàn)倦怠、動作遲緩，制何首烏組小鼠癥狀顯著減輕，反應(yīng)靈敏且動作迅速。兩組小鼠飲食無顯著差異，體質(zhì)量均穩(wěn)定上漲，實驗過程中1只制何首烏組小鼠意外死亡。對照組和制何首烏組(n=5)小鼠的ALT、AST和炎癥壞死灶比較見表1。

表1 兩組小鼠ALT、AST、炎癥壞死灶比較

二、肝組織形態(tài)學(xué)觀察

對照組肝組織可見多個大小不等的炎癥壞死灶，制何首烏組肝組織僅見散在幾個炎癥壞死灶，炎癥壞死灶數(shù)量相比對照組顯著減少(圖1A)。說明了使用制何首烏可以有效治療小鼠肝損傷。

三、肝組織免疫組織化學(xué)染色

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果提示小鼠炎癥壞死灶內(nèi)主要以巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞為主(圖1B、1C、1D)，與對照組相比，制何首烏組肝組織浸潤的巨噬細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞數(shù)量均減少。

注：A為小鼠肝組織HE染色；B為小鼠肝組織CD4免疫組化染色；C為小鼠肝組織CD8免疫組化染色；D為小鼠肝組織CD68免疫組化染色

四、肝組織流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

與對照組相比，制何首烏組小鼠的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α、CD4+T細(xì)胞活化(CD69+)比例、CD8+T細(xì)胞分泌GZMB比例均降低。提示制何首烏能夠通過抑制巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的募集、CD4+T細(xì)胞的活化、抑制顆粒酶B的釋放以及中性粒細(xì)胞分泌TNF-α，從而阻斷小鼠的肝損傷。見表2。

表2 肝組織流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果(%，±s)

討 論

近年來，藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)的檢出率逐年上升且呈地域性差異，西方國家的DILI發(fā)病率為13.9～19.1/10萬[21,22]，而中國DILI的發(fā)病率約為23.8/10萬[23]，明顯高于西方國家。有研究表明，中藥是國內(nèi)DILI重要的致病藥物大類[24]，而在這些引起肝損傷的中藥中，何首烏所占的比例位于前列。

胡錫琴等[25]發(fā)現(xiàn)，長期使用二苯乙烯苷會導(dǎo)致大鼠轉(zhuǎn)氨酶水平升高，停用后可恢復(fù)。李婷婷等[14]通過使用類器官3D培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞中順式二苯乙烯苷的毒性高于反式二苯乙烯苷。李娜等[26]研究認(rèn)為，反式二苯乙烯苷在LPS易感模型中并不會引起肝損傷。本研究結(jié)果顯示，與對照組小鼠相比，制何首烏組小鼠的轉(zhuǎn)氨酶水平有一定程度降低、肝組織炎癥壞死灶顯著減少、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤顯著減少。同時本研究使用的制何首烏成分中未檢測出何首烏主要肝毒性成分順式二苯乙烯苷，這與上述研究的結(jié)論相符。有研究認(rèn)為，二苯乙烯苷能夠降低小鼠體內(nèi)TNF-α的水平[27]。本研究結(jié)果顯示，制何首烏組中性粒細(xì)胞分泌的TNF-α顯著降低，同時制何首烏中反式二苯乙烯苷成分在正常范圍內(nèi)，提示反式二苯乙烯苷可能參與抑制中性粒細(xì)胞分泌TNF-α。本研究的模型為免疫活化模型，結(jié)果顯示對照組小鼠的炎癥程度、CD4+T淋巴細(xì)胞活化和CD8+T淋巴細(xì)胞分泌GZMB均顯著高于制何首烏組，提示制何首烏可能通過抑制效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的活化阻斷小鼠肝臟的炎癥進(jìn)展。

如何避免何首烏引起的肝毒性已成為國內(nèi)外的研究熱點。國內(nèi)一些學(xué)者研究出不同的炮制方法加工生何首烏，能夠有效減少生何首烏內(nèi)的肝毒性成分[28,29]。因此提高何首烏的炮制工藝能夠有效減少肝毒性事件發(fā)生。有研究認(rèn)為，HLA-B*35:01等位基因是何首烏引起藥物性肝損傷事件的高危因素，因此對于檢出該等位基因的人群應(yīng)避免使用何首烏[30]。

本研究的結(jié)果與研究前的假設(shè)截然不同，制何首烏不但沒有加重免疫活化小鼠的肝損傷，反而起到了治療作用。通常認(rèn)為，正常狀態(tài)下機體可能具有更強的耐受力，而病理狀態(tài)下機體可能耐受力較低。但是，有一種理論描述的現(xiàn)象與其相反，這就是“有故無殞”?！坝泄薀o殞”出自《黃帝內(nèi)經(jīng)》，其指出藥物毒與不毒，不僅在于藥物本身，還在于是否對證(病)使用，換句話說就是“有病則病當(dāng)之，無病則體受之”，這是中藥傳統(tǒng)毒理理論的重要內(nèi)容，也是中醫(yī)辯證用藥的重要思想之一。龐晶瑤等[31]的研究結(jié)果顯示，高劑量何首烏對于正常大鼠有肝毒性作用，而對于慢性肝損傷大鼠則有保護和治療作用。這與本研究的結(jié)果相似，這更加支持了何首烏對肝臟的作用具有“有故無殞”的現(xiàn)象。

本研究發(fā)現(xiàn)制何首烏可通過抑制炎癥發(fā)揮治療作用，但樣本量較少，仍需在更大的樣本中進(jìn)行驗證。研究中炎癥壞死灶內(nèi)的巨噬細(xì)胞是M1或M2型巨噬細(xì)胞、制何首烏通過何種途徑抑制巨噬細(xì)胞的募集、中性粒細(xì)胞和效應(yīng)性T細(xì)胞的活化，以及制何首烏中某一種成分參與了治療作用，亟待進(jìn)一步研究。