醌指紋法及其在環(huán)境微生物領(lǐng)域的應(yīng)用*

祝沖之 余 冉# 龍 濤 張曉東 羅默也 孫麗偉

(1.東南大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210096；2.生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇 南京 210019)

微生物是環(huán)境中的重要組成，通過分析微生物豐度和多樣性有助于了解環(huán)境因素的變化和環(huán)境污染的情況。研究微生物群落豐度和多樣性的方法種類繁多，其中生物標(biāo)記法受到廣泛關(guān)注。類異戊二烯醌(以下簡(jiǎn)稱“醌”)幾乎存在于所有生物體中，在呼吸和光合作用過程的電子傳輸中擔(dān)任重要作用。同時(shí)，醌的結(jié)構(gòu)具有多樣性，一種微生物通常主要含有一種醌，因此可以作為微生物化學(xué)分類的參數(shù)之一。本研究將綜述一種通過分析微生物菌群中電子傳遞體的種類和數(shù)量來表征其群落豐度和多樣性的方法——醌指紋法[1]95。醌指紋法在20世紀(jì)80年代創(chuàng)立，近年來，隨著化學(xué)分析技術(shù)的進(jìn)步和微生物特征醌數(shù)據(jù)的完善，醌指紋法在廢水處理、水環(huán)境分析、土壤監(jiān)測(cè)和堆肥處理等場(chǎng)景有所應(yīng)用[2]1,[3]393,[4]3,[5]1，但對(duì)研究結(jié)果缺乏系統(tǒng)的歸納總結(jié)。本研究重點(diǎn)探討醌指紋法的原理與作用及其在環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用情況。

1 醌指紋法的原理

醌是一類含共軛環(huán)狀二酮的母核連接異戊二烯側(cè)鏈的有機(jī)化合物。醌根據(jù)其極性環(huán)狀結(jié)構(gòu)通常分為苯醌和萘醌。苯醌含有一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，苯醌包括泛醌、質(zhì)體醌和紫醌等；萘醌含有兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，萘醌包括甲基萘醌、葉綠醌、去甲基萘醌和甲硫基萘醌等。

微生物細(xì)胞主要含有泛醌和甲基萘醌，它們?cè)谏锬は到y(tǒng)作為呼吸鏈中專一的電子和質(zhì)子載體[6]，也被稱為呼吸醌，并可以進(jìn)一步以其側(cè)鏈中的異戊二烯單元數(shù)和飽和度來分類。

甲基萘醌又稱維生素K2，是一類2-甲基-1-萘醌化合物，連接可變數(shù)量的異戊二烯鏈。甲基萘醌位于細(xì)胞的胞質(zhì)和類囊體膜中，或一些細(xì)菌的光合系統(tǒng)的反應(yīng)中心，在電子傳遞途徑中的蛋白質(zhì)復(fù)合物間轉(zhuǎn)移電子和質(zhì)子[7-8]。通常，將側(cè)鏈中含有n個(gè)異戊二烯單元的甲基萘醌記為MK-n，如果其側(cè)鏈中的異戊二烯雙鍵飽和，則記為MK-n(Hx)，x為飽和氫原子數(shù)。

泛醌又稱輔酶Q，是一類2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌的化合物，連接可變數(shù)量的異戊二烯側(cè)鏈。泛醌通常包含6～10個(gè)異戊二烯單元，很少能達(dá)到14個(gè)。大多數(shù)泛醌分布在革蘭氏陰性菌的細(xì)胞膜、真核細(xì)胞中線粒體的內(nèi)膜和葉綠體的類囊體膜上。泛醌在需氧呼吸電子傳輸鏈中起強(qiáng)制性輔因子的作用，充當(dāng)電子和質(zhì)子載體[9]。與甲基萘醌類似，側(cè)鏈中含有n個(gè)異戊二烯單元的泛醌通常記為UQ-n，含有x個(gè)飽和氫原子記為UQ-n(Hx)。

葉綠醌也稱維生素K1，它和質(zhì)體醌作為光系統(tǒng)Ⅰ中電子轉(zhuǎn)移輔助因子[10]，存在于光合細(xì)菌或真菌中。

一種微生物通常只有一種優(yōu)勢(shì)醌型[11]，醌種類的多樣性使其可作為一種有效的生物化學(xué)分類學(xué)指標(biāo)[12]247。醌指紋法利用這一特性，以樣品中的醌作為生物標(biāo)志物來表征微生物群落結(jié)構(gòu)和活性。典型醌的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。

圖1 典型醌的結(jié)構(gòu)示意圖

2 醌的提取和檢測(cè)

2.1 醌的提取

醌是一種中性脂質(zhì)，可以溶解于常見的脂溶性溶劑(如丙酮、甲醇、二氯甲烷和氯仿等)中。故萃取法是從環(huán)境樣品或凍干細(xì)胞中提取醌的最常用的方法[12]247。常用的萃取劑有氯仿/甲醇(體積比2∶1)或二氯甲烷/甲醇/磷酸鹽緩沖液(體積比2.0∶1.0∶0.8)。由于環(huán)境中的脂質(zhì)提取物可能含有磷脂或非脂質(zhì)的雜質(zhì)，所以需通過銀離子硅膠色譜或者反相薄層色譜對(duì)提取物進(jìn)一步分離和純化[13]，但回收率不高(<90%)。因此現(xiàn)在通常使用固相萃取柱(如Waters Sep-Pak硅膠柱)進(jìn)行純化，這種方法的回收率高于96%[3]393。

為了克服傳統(tǒng)萃取法耗時(shí)、繁瑣和溶劑有毒的缺點(diǎn)，最近研究者開發(fā)出一種應(yīng)用超臨界流體萃取(SFE)提取樣品中醌的方法[14-15]。這種方法在55 ℃和25 MPa下，以甲醇作為改性劑，使用超臨界CO2萃取活性污泥中的醌，發(fā)現(xiàn)萃取后沒有使用Sep-Pak柱和經(jīng)Sep-Pak柱純化的醌總量分別為390、410 μmol/kg，和傳統(tǒng)萃取法的回收量(420 μmol/kg)相當(dāng)。另有一種僅在凍干細(xì)胞中應(yīng)用的新型檢測(cè)技術(shù)，它不使用有機(jī)溶劑，僅通過脫水破壞細(xì)胞并將其中的醌轉(zhuǎn)移到氧化銦錫電極上進(jìn)行檢測(cè)[16]。

2.2 醌的檢測(cè)

提取出的醌通常用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)并定量，HPLC的流動(dòng)相可以是甲醇/異丙醚、甲醇/異丙醇或乙腈/異丙醇等混合物[3]394,[4]75。通常，在紫外光譜檢測(cè)器下甲基萘醌的檢測(cè)波長(zhǎng)是270 nm，泛醌是275 nm。然而，HPLC易受環(huán)境中雜質(zhì)的影響，靈敏度有限，無法鑒定醌結(jié)構(gòu)。因此，液相色譜(LC)與質(zhì)譜(MS)耦合技術(shù)在醌檢測(cè)中愈發(fā)被重視[17-18]。某些醌型(如MK-8(H4)和MK-9)在HPLC檢測(cè)下保留時(shí)間十分接近，LC—MS可以更好地分離這些醌[19]。其中MS主要使用的電離模式是正離子的大氣壓化學(xué)電離模式[20]。圖2為環(huán)境樣品中醌的主要檢測(cè)流程。

圖2 環(huán)境樣品中微生物醌的主要檢測(cè)流程

色譜檢測(cè)需要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，而目前部分醌型缺少市售的標(biāo)準(zhǔn)品(比如含有飽和氫原子的泛醌和甲基萘醌)，所以通常從已知醌型的微生物中分離獲得醌標(biāo)準(zhǔn)品[3]395。所選用的菌株需具備醌型單一、培養(yǎng)快速和簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[21-22]。此外，泛醌和甲基萘醌中異戊二烯單元數(shù)和色譜保留時(shí)間的對(duì)數(shù)具有線性關(guān)系，可以基于此計(jì)算未知醌組分的異戊二烯單元數(shù)目[23]455。

3 醌指紋法的作用

3.1 醌指示的環(huán)境微生物

環(huán)境樣品中的醌指紋可以推斷樣品的微生物種群結(jié)構(gòu)和對(duì)應(yīng)的種屬豐度與活性，表1列舉了已知所含醌型的微生物的種類。

表1 常見醌型指示的環(huán)境微生物

3.2 數(shù)據(jù)分析

醌指紋法可以檢測(cè)出樣品中醌的種類及數(shù)量的直接信息，為了比較樣品間的差異，通常要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。目前，分析醌指紋常用的指數(shù)有總醌指數(shù)(TQ)、多樣性指數(shù)(DQ)、均勻性指數(shù)(EQ)和非相似性指數(shù)(D)[45]，公式見表2。

表2 醌指紋法的常見指數(shù)1)

TQ能夠反映樣品中具有活性的微生物數(shù)量，因?yàn)轷谒兰?xì)胞內(nèi)會(huì)很快分解。在水環(huán)境和土壤中，TQ和細(xì)胞豐度呈線性關(guān)系[46-47]。在湖泊中，1 nmol醌約對(duì)應(yīng)0.67 mg微生物碳。然而，在不同水深下TQ與微生物碳含量的比例會(huì)變化，同時(shí)也會(huì)在一些深度中沒有明顯相關(guān)性[48]250。

醌的多樣性水平可以代表微生物群落的多樣性水平。最初曾用香農(nóng)指數(shù)來量化基于醌指紋法的微生物多樣性，但由于它對(duì)變化的敏感性不高，尤其是對(duì)摩爾占比較小的物種[23]455，所以目前通常使用DQ和EQ[1]96來量化。DQ越高表明微生物的多樣性越高。EQ越高，表明微生物的分布比例越接近，當(dāng)EQ達(dá)到最大值1時(shí)，表明所有含有不同醌型的微生物比例相同。此外，D可以比較兩個(gè)樣品間微生物群落的相似性，D值越小，兩組樣品越相似。

4 醌指紋法在環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用

4.1 廢水生物處理系統(tǒng)

醌指紋法能用于反映污泥系統(tǒng)中微生物的情況。當(dāng)BOD負(fù)荷為0.2～0.4 kg/(kg·d)時(shí)，活性污泥中甲基萘醌與泛醌的摩爾比(P)介于0.6～1.0，大部分在0.9～1.0；BOD較低或者保留時(shí)間較長(zhǎng)的活性污泥中P會(huì)提高到1.2～4.0[23]454。在穩(wěn)定的活性污泥系統(tǒng)中，UQ-8是最主要的泛醌類型[49]146,[50],[51]198,[52]，而在絲狀菌膨脹期間，UQ-9占主導(dǎo)地位[53]，UQ-10也是常見的類型。同時(shí)，MK-7是最主要的甲基萘醌[49]146，其他常見的甲基萘醌有MK-8、MK-6或MK-9。在循環(huán)生物流化床系統(tǒng)的生物膜中，UQ-8和UQ-10增加而UQ-9減少[54]，代表硝化細(xì)菌增加的同時(shí)變形細(xì)菌的γ亞類數(shù)量減少，生物膜中微生物種群均勻性變化較小。在膜生物反應(yīng)器(MBR)中，泛醌的種類通常比甲基萘醌少。此外，膜表面生物膜的UQ-9、MK-7、MK-8(H2)、MK-8(H4)和MK-10(H4)含量的增加可能與MBR膜污染有關(guān)[55]，MBR污泥的DQ可能會(huì)略低于懸浮微生物和生物膜中的DQ。

4.2 水環(huán)境和沉積物

河流、湖泊和海洋等水生系統(tǒng)中的醌含量往往不高，但通過醌指紋法可以推測(cè)水環(huán)境中有氧與無氧條件的變化情況。水系統(tǒng)中的醌以MK-6和UQ-8為主[48]250。醌分布受環(huán)境變量影響較大，但沒有季節(jié)性規(guī)律。BECKER等[2]7發(fā)現(xiàn)有氧區(qū)的醌濃度比有氧-缺氧化變層提高了7倍，最深的水柱樣品中醌濃度最低，并且缺氧區(qū)中不飽和甲基萘醌和泛醌的相對(duì)豐度較高。

醌種類和豐度分布可與沉積物的地理位置和深度關(guān)聯(lián)[56]。潮汐沉積物中主要的醌是UQ-10和UQ-8，而潮下沉積物中以MK-6和UQ-9為主，主要原因可能是溶解性有機(jī)碳、氨氮、溶解氧濃度的變化影響了微生物活動(dòng)[57]。LI等[58]發(fā)現(xiàn)在海灣冷滲流和可燃冰附近的沉積物中，泛醌含量相似(分別為51.7 pmol/g和55.0～57.3 pmol/g)，UQ-8含量最高，并隨深度增加而急劇下降；而冷滲流中甲基萘醌含量只有可燃冰的1/8～1/4，以MK-4和MK-6最為豐富。另外，還有研究表明海灣沉積物中DQ與總有機(jī)碳含量正相關(guān)，與鹽度和導(dǎo)電性負(fù)相關(guān)，與重金屬含量無顯著相關(guān)關(guān)系[59]。

4.3 土 壤

醌指紋法可以間接反映土壤污染狀況及其變化。有研究發(fā)現(xiàn)，土壤在受碳?xì)浠衔镂廴竞?，TQ會(huì)顯著增加，其中MK-8(H4)、MK-9(H2)和UQ-9顯著增加，高濃度的碳?xì)浠衔飼?huì)使DQ有所降低，碳?xì)浠衔锉唤到馊コ?，TQ和DQ與未污染土壤的差異消失[60]。KATAYAMA等[61]報(bào)道了土壤在多種農(nóng)藥殺蟲劑施用下醌指紋的變化情況，其中殺螟松、利谷隆和西瑪津不影響醌的濃度和種類；而百菌清會(huì)降低DQ但不改變TQ；三氯硝基甲烷會(huì)降低醌的數(shù)量和多樣性。在重金屬污染土壤中，土壤酶活性與甲基萘醌種類有明顯的正相關(guān)關(guān)系，并且污染前后土壤中的泛醌含量變化較小，表明部分微生物對(duì)重金屬存在耐受機(jī)制[62]。

4.4 堆 肥

有研究發(fā)現(xiàn)，堆肥初期MK-7和UQ-9通常是優(yōu)勢(shì)醌型[4]88,[5]79,[63]，隨著堆肥的進(jìn)行，泛醌含量會(huì)有所下降，長(zhǎng)鏈(含有9個(gè)及以上異戊二烯單元)甲基萘醌含量會(huì)有所增加，醌的多樣性通常會(huì)下降，但有時(shí)候也會(huì)持續(xù)增加[5]73。隨著堆肥過程的進(jìn)行，微生物中變形菌綱的微生物會(huì)減少，而放線菌綱微生物會(huì)增加。

5 醌指紋法的優(yōu)缺點(diǎn)

目前，碳源利用法(如Biolog法)和生物標(biāo)記法(如磷脂脂肪酸分析法)已廣泛用于自然環(huán)境中微生物群落的表征[64-65]。首先，與碳源利用法等培養(yǎng)法相比，醌指紋法優(yōu)勢(shì)在于無需培養(yǎng)微生物，可以直接反映環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)。此外，醌指紋法可以有效指示古細(xì)菌，而磷脂脂肪酸分析無法檢測(cè)古細(xì)菌，因?yàn)樗鼈兊臉O性脂質(zhì)是醚鍵而不是酯鍵。

另外，分子生物學(xué)方法是鑒定微生物最常用的方法，它在微生物分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的研究中作用明顯。已有研究發(fā)現(xiàn)，醌指紋法表征微生物多樣性的結(jié)果與變形梯度凝膠電泳(DGGE)、熒光原位雜交(FISH)、16S rRNA克隆和測(cè)序的結(jié)果基本一致[23]456,[51]198,[66]。此外，醌是細(xì)胞呼吸作用中的活性物質(zhì)，所以它的濃度可以直接反映微生物的活度；同時(shí)醌指紋法更易于表征放線菌和古細(xì)菌[2]2，而這些微生物難以定量提取核酸來表征。

但是，醌指紋法也有局限性。首先，醌指紋法指示的分類水平較低，不能精確到物種的種屬層面。其次，尚未完全掌握環(huán)境中所有微生物醌，所以某些特定情況下醌指紋所包含的生物學(xué)意義尚未完全解讀。再次，在少數(shù)情況下，一種細(xì)菌的主要醌型也會(huì)發(fā)生變化，這會(huì)導(dǎo)致醌指紋的誤差。此外，醌會(huì)在光下氧化，也會(huì)在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿下發(fā)生分解，所以提取的過程可能會(huì)發(fā)生損失。

6 展 望

醌指紋法是研究環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度的有效方法，它無需培養(yǎng)微生物，能避免死亡細(xì)胞的干擾，加之化學(xué)檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步和微生物特征醌指紋數(shù)據(jù)庫的逐漸完善，使得分析環(huán)境樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)和活性更加便捷、高效和準(zhǔn)確。在環(huán)境治理領(lǐng)域，往往只需要了解功能微生物群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化情況，而非具體的微生物種屬，所以醌指紋法的這些特性預(yù)示它具有廣泛的應(yīng)用前景。

未來，醌指紋法的發(fā)展需要進(jìn)一步總結(jié)不同環(huán)境條件下醌指紋的變化規(guī)律，深入分析菌群的醌組成和分布與環(huán)境微生物的對(duì)應(yīng)關(guān)系，降低檢測(cè)成本。在微生物治理領(lǐng)域，醌指紋法可以和其他生物標(biāo)志物法或分子生物學(xué)方法結(jié)合，以提供更為全面的系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)和活性分析。