PIWI/piRNA在婦科惡性腫瘤中的研究進展

許瑞雪，毛奕文，馬洋洋，蔣學風

暨南大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510630

根據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示：宮頸癌(6.5%)、子宮體癌(4.5%)、卵巢癌(3.4%)在女性惡性腫瘤發(fā)病率排名中分別居第4、第6、第8位，同時宮頸癌(7.7%)在女性惡性腫瘤死亡率中居第4位[1]。預計2021年美國子宮體癌發(fā)病率約7%，占女性惡性腫瘤發(fā)病率第4名；卵巢癌死亡率為5%、子宮體癌死亡率為4%，分別居女性惡性腫瘤死亡率第5、6位[2]。卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤，特別是卵巢癌，因缺乏早期診斷方法，發(fā)現(xiàn)時多為晚期；盡管近幾年靶向藥、PARP抑制劑及免疫檢查點抑制劑為部分患者帶來獲益，但多數(shù)患者仍因治療手段有限而預后差、生存率低。

PIWI/piRNA參與轉(zhuǎn)座子沉默、精子發(fā)生、基因組重排、表觀遺傳調(diào)控、蛋白質(zhì)調(diào)控和生殖干細胞維持等生物學過程，并認為與多種惡性腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和預后不良密切相關。本文重點闡述PIWI/piRNA在婦科惡性腫瘤中作用機制及最新研究進展，為婦科惡性腫瘤的早期診斷、后續(xù)靶向治療及預測預后提供新的研究方向。

1 PIWI/piRNA的生物學特征

1.1 PIWI家族 PIWI(P-element-induced wimpy testes)最早在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，是果蠅生殖系中干細胞自我更新和維持所必需的一類保守基因；包含三個不同亞型：ago3、aubergine(aub)、和PIWI。aub和ago3可在細胞質(zhì)中切割其靶轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄，而PIWI可在細胞核的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控其靶轉(zhuǎn)座子；PIWI和aub對雄性和雌性的生育能力都是必需的，而ago3對雌性的生育能力是必不可少的[3-4]。小鼠PIWI蛋白家族包括三個成員：MIWI2、MILI和MIWI，均在精子發(fā)生的不同階段呈高度時空特異性表達；而雌性生殖細胞中只有MILI蛋白弱表達。人源PIWI基因位于人類第12號染色體長臂，首先在人類睪丸組織中被發(fā)現(xiàn)，目前已證實PIWI基因廣泛分布在前列腺、卵巢、小腸、心臟、大腦、肝臟、骨骼肌及腎臟在內(nèi)的很多組織中[5]。人類PIWI蛋白主要包括PIWIL1(HIWI)、PIWIL2(HIWLI)、PIWIL4(HIWI2)和PIWIL3(HIWI3)四種類型[6]。PIWIL在各種類型的人類癌癥中廣泛表達，與多種惡性腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和預后密切相關，見表1。

表1 PIWI在多種癌癥類型中的表達

1.2 piRNA的來源 piRNA最早在果蠅睪丸初級精母細胞中被發(fā)現(xiàn)，其與PIWI蛋白結(jié)合介導果蠅X染色體的串聯(lián)重復序列Stellate基因沉默，從而保證精母細胞正常減數(shù)分裂、維持雄性果蠅生殖能力；轉(zhuǎn)座子活化可引起基因組不穩(wěn)定性，導致精子發(fā)育異常[15]。截至2006年有研究發(fā)現(xiàn)在果蠅、小鼠、大鼠和人等多個物種生殖系細胞中，存在特異地與PIWI家族蛋白質(zhì)相互作用的小分子RNA而被命名[16]。piRNA主要來源于基因組中的piRNA簇或轉(zhuǎn)座子區(qū)域，與miRNA和siRNA不同，piRNA的前體為長單鏈轉(zhuǎn)錄物，且過程不需要Dicer酶參與，新生的piRNA進行額外的轉(zhuǎn)錄后修飾成為成熟piRNA。

1.3 PIWI/piRNA的合成機制 PIWI/piRNA的生物發(fā)生包括兩條主要途徑：一級加工途徑和二級乒乓循環(huán)擴增途徑。首先在細胞核中，piRNA簇被轉(zhuǎn)錄生成正義、反義piRNA，反義piRNA轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)后被核糖核酸內(nèi)切酶Zuc切割成短片段，PIWI蛋白對piRNA的5'端尿嘧啶表現(xiàn)出強烈偏倚，被加載至5'末端；同時3'末端的2'-羥基被Hen1甲基化，再經(jīng)核酸外切酶修剪成成熟的PIWI-piRNA復合物(初級piRNA)。部分PIWI-piRNA復合物被運送回細胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)座子活性，另一部分PIWI-piRNA復合物與直接被轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中的正義piRNA一同進入乒乓循環(huán)啟動二級擴增[17]。在此循環(huán)中，與PIWI亞家族蛋白結(jié)合的反義piRNA通過堿基配對識別互補的正義轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄本，并切割產(chǎn)生10 nt距離的5'端；隨后裂解的產(chǎn)物與PIWI亞家族蛋白結(jié)合，最終在3'末端再次加工，產(chǎn)生次級正義piRNA。正義piRNA與其相應的PIWI蛋白偶聯(lián)，同樣識別其互補piRNA以產(chǎn)生次級反義piRNA。通過這個循環(huán)，piRNA在細胞質(zhì)擴增并積累[18-19]，見圖1。

圖1 PIWI/piRNA的生物合成：一級加工途徑和二級乒乓循環(huán)途徑

2 PIWI/piRNA在癌癥中的作用機制

盡管人們認為，PIWI/piRNA的主要作用是沉默生殖細胞中活躍的轉(zhuǎn)座子元素，從而保護基因組不受轉(zhuǎn)座子誘導的插入突變的影響，但越來越多的證據(jù)表明，在體細胞基因調(diào)控中，PIWI/piRNA同樣發(fā)揮積極的作用，包括序列特異性DNA甲基化等其他表觀遺傳學過程，調(diào)控癌癥的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平[20]。

2.1 沉默轉(zhuǎn)錄基因 在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)：piRNA-021285的過表達可促進促凋亡基因ARHGAP11A的5'非編碼區(qū)第一個外顯子甲基化，使mRNA的表達降低、乳腺癌細胞過度增殖、生長；認為其具有促進癌癥發(fā)生發(fā)展，并誘發(fā)腫瘤侵襲的潛在可能[21]。目前普遍認為肺癌、結(jié)腸癌、胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與DNA甲基化相關；而PIWI/piRNA可上調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)的表達，進而介導抑癌基因的DNA甲基化相關沉默，促使腫瘤發(fā)生[22-23]。

2.2 調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性 類似于miRNA機制，通過piRNA-RNA相互作用，piRNA可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后網(wǎng)絡從而抑制目標RNA，這些RNA包括mRNA、lncRNA。在前列腺癌中，piR-001773和piR-017184與PIWIL4結(jié)合形成PIWI/piRNA復合物，通過miRNA樣機制，介導PCDH9 mRNA的降解，下調(diào)原鈣黏蛋白9(PCDH9)的表達，從而促進腫瘤細胞的生長、侵襲和遷移[24]。有研究者觀察到piR-55490可抑制肺癌細胞中Akt/mTOR途徑的激活。同時發(fā)現(xiàn)piR-55490通過類似于miRNA的機制，結(jié)合mTOR信使RNA的3'非編碼區(qū)，并誘導其降解從而抑制肺癌細胞增殖。因此認為piRNA可通過直接靶向癌基因mRNA來抑制癌細胞表型[25]。

2.3 與蛋白質(zhì)相互作用 piR-823在結(jié)直腸癌組織中表達上調(diào)，并與熱休克因子1(HSF1)相互結(jié)合，促進其Ser326磷酸化和HSP1活化；通過影響細胞周期進程，抑制細胞凋亡、促進細胞增殖發(fā)揮腫瘤促進作用[26]。

2.4 維持腫瘤細胞的干性 粒細胞髓樣抑制細胞(G-MDSCs)通過促進多發(fā)性骨髓瘤(MM)細胞上調(diào)piR-823表達；可激活(DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B)DNMT3B從而增強MM干細胞(MMSC)的干性、提高MM細胞的存活率[27]。另外發(fā)現(xiàn)PIWIL2、piR-932在乳腺癌干細胞中表達增加，兩者免疫沉淀形成piR-932-PIWIL2復合物；可能通過促進Latxin基因的異常甲基化，參與乳腺癌干細胞的維持，并可能成為阻斷乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在靶標[28]。

3 PIWI/piRNA與宮頸癌

研究發(fā)現(xiàn)PIWIL2在宮頸癌及癌前病變中表達過度；通過經(jīng)體內(nèi)及體外實驗證實，在PIWIL2敲除后，癌細胞的生長被有效抑制，初步揭示其可能具有促進宮頸癌發(fā)生發(fā)展的能力。同時PIWIL2轉(zhuǎn)染后，HaCaT細胞系呈現(xiàn)E-鈣黏蛋白下調(diào)和N-鈣黏蛋白、波形蛋白增多；這一表型變化與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化一致，進一步驗證其在宮頸癌細胞中潛在促進增殖、遷移和侵襲的能力。并且PIWIL2表達可通過高危HPV E6、E7的組合重新激活、并誘導H3K9乙?；?，激活c-Myc、Nanog、Oct4、Sox2和Klf4等核心體細胞重編程因子，啟動細胞重編程，從而促進腫瘤起始細胞的形成[29]。另一研究轉(zhuǎn)染PIWIL2后，檢測到典型的Wnt信號異常激活；通過阻斷下游β-catenin和CREB結(jié)合蛋白，可顯著下調(diào)重編程因子，從而在PIWIL2過表達的HaCaT細胞中導致細胞分化并防止致瘤性；表明PIWIL2激活的β-catenin/CREB結(jié)合蛋白介導的轉(zhuǎn)錄對腫瘤起始細胞的維持至關重要，有助于宮頸癌發(fā)生的進展[30]。PIWIL2的表達除了可能與宮頸癌發(fā)生有關以外，還參與宮頸病變的多個階段。一項研究在癌性病變相鄰的一些化生上皮細胞、惡性病變周圍組織學顯示正常但分子水平存在隱匿癌前病變的組織也檢測出PIWIL2表達，而均檢測不到p16表達；認為PIWIL2基因激活可能早于p16激活。另外p16陰性宮頸癌、非HPV感染的宮頸癌、脫落的異常宮頸上皮細胞也檢測出PIWIL2，進一步證實PIWIL2在宮頸病變中的表達比p16更為廣泛。這項研究為宮頸病變早期階段的診斷識別以及疾病的進展監(jiān)測提供了新的視角，提示PIWIL2有潛力成為HR-HVP和p16的互補生物標志物[31]。PIWIL4也在一項18對宮頸癌組織和鄰近正常組織的qRT-PCR實驗中被檢測到差異表達增多，其可能通過抑制p14ARF/p53阻止宮頸癌細胞凋亡，從而促進細胞生長和增殖[32]。另有研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌細胞中piR-651的表達增加，表明piR-651可能在致癌中發(fā)揮關鍵作用，并可能是潛在的癌基因[33]。

4 PIWI/piRNA與卵巢癌

早期有研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌的piRNA通路基因表達增加，與鄰近正常組織相比，PIWIL1、PIWIL2、PlWlL3和PIWIL4蛋白在晚期卵巢癌原發(fā)灶、腹膜、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中表達均上調(diào)，且可能與轉(zhuǎn)移相關[34]。一項實驗針對25例晚期漿液性卵巢癌、8例正常卵巢組織、19例卵巢良性腫瘤進行半定量RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌組織中PIWIL1和MAEL的表達明顯增多，同時在鄰近腫瘤組織的間質(zhì)細胞中MAEL和PIWIL2也存在強表達，提示其可能在卵巢癌中發(fā)揮作用，并參與癌細胞周圍組織細胞組成且可能發(fā)生了變化；而令人驚訝地是，在體外實驗中卻發(fā)現(xiàn)PIWIL1和MAEL的過表達降低了卵巢癌細胞的侵襲性，這表明piRNA途徑參與腫瘤發(fā)生過程的復雜性[35]。另外發(fā)現(xiàn)PIWIL2表達增加與卵巢癌的順鉑耐藥密切相關，Piwil2在細胞染色質(zhì)乙酰化和松弛中起作用，可能通過防止異染色質(zhì)促進染色質(zhì)松弛，從而增強DNA修復[36]。因此，抑制PIWIL2表達減少腫瘤細胞的修復為人類癌癥的治療干預提供了一種新的手段。有研究者在卵巢正常組織和上皮性卵巢癌全基因組piRNA分析中鑒定出子宮內(nèi)膜樣卵巢癌(ENOCa)和漿液性卵巢癌(SOCa)樣本中分別有159、143個piRNA存在差異表達。其中piR-52207在ENOCa中被上調(diào)，通過有效靶向下調(diào)NUDT4、MTR、EIF2S3和MPHOSPH8基因的表達，表明此種piRNA通過調(diào)節(jié)這些基因發(fā)揮作用，且可能是促進ENOCa腫瘤細胞增殖、遷移以及致癌性增強的原因。此外，在SOCa中上調(diào)的PIR-33733通過靶向抑制LIAS的表達以調(diào)節(jié)SOCa的腫瘤發(fā)生；而同樣上調(diào)的piR-52207靶向降低了ACTR10、PLEKHA5的表達，可能導致細胞骨架和細胞黏附基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常，從而引起癌癥進展[37]。因此認為，差異表達的piRNA介導的基因調(diào)控網(wǎng)絡，可能參與調(diào)節(jié)卵巢癌發(fā)生中涉及的關鍵過程和途徑，并且piNRA途徑介導腫瘤發(fā)展過程存在復雜性。

5 PIWI/piRNA與子宮內(nèi)膜癌

在子宮內(nèi)膜癌中，相關的研究仍在發(fā)展階段，近年來已有研究表明遺傳表觀變化，如DNA異常甲基化，在Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮重要作用，這也為進一步研究PIWL/piRNA在子宮內(nèi)膜癌中的可能機制及診治提供了思路。有研究將PILWL1轉(zhuǎn)染到Ishikawa細胞，發(fā)現(xiàn)PILWL1可以使PTEN基因啟動子甲基化，抑制Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌組織中PTEN的表達，并且發(fā)現(xiàn)DNMT1可能是PILWL1的下游靶標；進一步表明PILWL1可能通過DNMT1介導的PTEN高甲基化，導致PTEN表達的下調(diào)，從而介導Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌的增殖與發(fā)展[38]。PILWL1在子宮內(nèi)膜癌組織中過度表達，可導致癌組織中干細胞標志物(如CD44和ALDH1)表達增加，上皮標志物E-鈣黏蛋白下調(diào)、間質(zhì)標志物波形蛋白和N-鈣黏蛋白上調(diào)，從而調(diào)節(jié)腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及干細胞樣特性的獲得，并參與維持莖樣特征作用；表明PILWL1具有增強子宮內(nèi)膜癌的增殖、遷移及侵襲潛能[39]。PIWIL1在子宮內(nèi)膜癌細胞113中高表達，且伴有血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血管生成素(Ang)/Tie-2信號顯著表達，提示PIWIL1在子宮內(nèi)膜癌的血管生成中可能也起到重要作用[40]。由此可見，PIWI/piRNA在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，且可能參與包括影響基因甲基化、腫瘤血管形成的多個生物學過程。

6 結(jié)語

目前關于PIWI/piRNA在人類各種癌癥中的研究已經(jīng)取得了一定的成果，在婦科惡性腫瘤領域，PIWI/piRNA同樣存在異常表達，涉及多種基因表觀遺傳學變化，與腫瘤的增殖、侵襲和遷移存在廣泛聯(lián)系，但與其他生物通路之間存在的交叉聯(lián)系有待進一步研究。一些PIWI/piRNA可能作為致癌或者抑癌因子，為腫瘤的診斷、治療以及預后判斷提供新型生物標志物和治療靶點。目前PIWI/piRNA參與婦科惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展相關機制的研究仍較少，有待進一步深入研究及探討。