miR-196a及miR-1285在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及其診斷價(jià)值研究

任玉峰，段秀方，程鈺，孫柳青，張妍

1.安康市婦幼保健院病理科，陜西 安康 725000；

2.寧夏第五人民醫(yī)院病理科，寧夏 石嘴山 753000；

3.安康市中心醫(yī)院病理科，陜西 安康 725000；

4.北京理工大學(xué)珠海學(xué)院生物學(xué)教研室，廣東 珠海 519088；

5.棗莊市市立醫(yī)院病理科，山東 棗莊 277100

卵巢癌是臨床上常見的婦科疾病，是女性惡性腫瘤之一，對女性的生命健康造成了嚴(yán)重威脅[1]。上皮性卵巢癌是卵巢癌中最常見的類型，早期診斷比較困難，發(fā)現(xiàn)時(shí)多為晚期，目前尚沒有可用于上皮性卵巢早期診斷及治療和預(yù)后的特異性的生物學(xué)指標(biāo)[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(miRNA)表達(dá)水平的失調(diào)往往與癌癥具有密切關(guān)系，具有促癌基因和抑癌基因[3]。miR-196a是miRNA家族成員之一。以往研究證實(shí)，miR-196a可以促進(jìn)肝癌、胃癌及子宮內(nèi)膜癌等多種惡性腫瘤的形成，且在癌癥患者血清中表達(dá)水平顯著增加[4-5]。miR-1285可調(diào)控腫瘤抑制因子p53，研究顯示miR-1285在腎癌、肝癌及卵巢癌等多種癌癥中的表達(dá)水平顯著降低，其可能是腫瘤抑制因子[6-7]。但是miR-196a及miR-1285在上皮性卵巢癌中的表達(dá)水平及其對上皮性卵巢癌的診斷價(jià)值尚不明確，本文就此展開研究，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取安康市婦幼保健院于2019年7月至2021年4月收治的95例擬行手術(shù)治療的上皮性卵巢癌患者作為研究組。其中病理分期為Ⅰ期34例，Ⅱ期61例；病理類型：漿液性癌68例，透明細(xì)胞癌12例，黏液性癌8例，子宮內(nèi)膜樣癌5例及混合型細(xì)胞癌2例；病理分級(jí)：高分化癌(G1)5例、中分化癌(G2)18例和低分化癌(G3)72例；術(shù)后有殘余腫瘤40例，術(shù)后無殘余腫瘤55例。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均符合國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(FIGO)分類標(biāo)準(zhǔn)和世界衛(wèi)生組織(WHO)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，且均經(jīng)過病理診斷為上皮性卵巢癌；可以進(jìn)行手術(shù)者；術(shù)前均未接受放化療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠期患者；合并其他系統(tǒng)腫瘤者；無法手術(shù)者。另選取同期本院收治的110例上皮性卵巢良性腫瘤患者作為良性組，其中良性漿液性囊腺瘤56例，泡膜細(xì)胞瘤20例，黏液性囊腺瘤30例，成熟性畸胎瘤4例。選取本院同期登記的正常健康體檢女性110例作為對照組。研究組、良性組和對照組受檢者的平均年齡分別為(53.98±10.49)歲、(54.29±11.22)歲、(53.34±1.77)歲；絕經(jīng)患者分別有61例、70例、66例。三組受檢者的年齡和絕經(jīng)比例比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)安康市婦幼保健院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有受檢者均知情且自愿簽訂知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 血漿樣本采集 抽取受檢者清晨空腹靜脈血4 mL，放入加有EDTA抗凝劑的EP管中，3 000 r/min離心5 min，取上清備用。

1.2.2 總RNA的提取 將上述血清使用高速離心機(jī)14 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上層液體于無RNA酶的EP管中，加入Trizol，混勻；加入氯仿，混勻后室溫靜置，12 000 r/min離心15 min，吸取上層轉(zhuǎn)移至另一離心管中。加入異丙醇，混勻后室溫靜置，12 000 r/min離心10 min，倒掉液體，并向EP管中加入75%乙醇，用移液槍輕輕吹打，12 000 r/min離心5 min，倒掉液體。加入DEPC水溶解沉淀物，將樣本分為兩份，一份采用酶標(biāo)儀測定濃度，一份用于反轉(zhuǎn)錄cDNA。

1.2.3 miRNA逆轉(zhuǎn)錄 采用PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒完成miRNA的逆轉(zhuǎn)錄過程。反應(yīng)體系：5×PrimeScript Buffer(for Real Time)(2μL)、Prime Script RT Enzyme MixⅠ(0.5μL)、Gene specific primer(2μmol/L，0.5μL)、Total RNA(0.5μL)和RNase Free dH2O(5μL)，總量為10μL。反轉(zhuǎn)錄條件為：16℃30 min，42℃反轉(zhuǎn)錄15 min，85℃失活5 s，4℃保存。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 根據(jù)TB Green Premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒操作步驟完成。反應(yīng)體系：TB Green Premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×，12.5μL)、PCR Forward Primer(10μmol/L，1 μL)、PCRReverse Primer(10μmol/L，1μL)、RT反應(yīng)液(cDNA溶液)(2μL)、滅菌水(8.5μL)，總體系25μL。PCR擴(kuò)增程序如下：預(yù)變性95℃30 s，PCR循環(huán)：95℃5 s，60℃30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因?yàn)閁6，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，見表1。每個(gè)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)達(dá)到所設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)即為Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA的相對表達(dá)水平，其中△Ct=Ct目的基因－CtU6。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間兩兩比較采用成組t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)法；多因素分析采用多元Logistic回歸模型分析；繪制受檢者工作特征曲線(ROC)評(píng)價(jià)血漿miR-196a及miR-1285對上皮性卵巢癌的診斷價(jià)值。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組受檢者的血漿miR-196a及miR-1285表達(dá)水平比較 三組受檢者的血漿miR-196a及miR-1285表達(dá)水平比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；研究組患者血漿miR-196a表達(dá)水平明顯高于對照組和良性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中研究組患者的血漿miR-1285表達(dá)水平明顯低于對照組和良性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而良性組和對照組的血漿miR-196a及miR-1285表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 三組受檢者的血漿miR-196a及miR-1285表達(dá)水平比較(±s)

表2 三組受檢者的血漿miR-196a及miR-1285表達(dá)水平比較(±s)

注：與對照組比較，aP<0.05；與良性組比較，bP<0.05。

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2.2 上皮性卵巢癌患者血漿miR-196a及miR-1285表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 上皮性卵巢癌患者的血漿miR-196a及miR-1285表達(dá)水平與病理分期有關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、病理類型、病理分級(jí)、術(shù)后是否有腫瘤殘余等因素均無關(guān)(P>0.05)，見表3。

表3 上皮性卵巢癌患者的血漿miR-196a及miR-1285表達(dá)水平與臨床病理特征關(guān)系(±s)

表3 上皮性卵巢癌患者的血漿miR-196a及miR-1285表達(dá)水平與臨床病理特征關(guān)系(±s)

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2.3 血漿miR-196a及miR-1285對上皮性卵巢癌的診斷價(jià)值 將研究組定義為1，對照組和良性組定義為0，見圖1，采用ROC曲線評(píng)估血漿miR-196a及miR-1285表達(dá)水平對上皮性卵巢癌患者預(yù)后評(píng)估的效能。結(jié)果顯示，上皮性卵巢癌患者血漿miR-196a的Cut off值為1.37，miR-1285的Cut off值為0.81時(shí)，上皮性卵巢癌患者血漿miR-196a的AUC及95%CI分別為0.839(0.785~0.894，P<0.001)，miR-1285的AUC及95%CI分別為0.858(0.810~0.905，P<0.001)，提示血漿miR-196a及miR-1285表達(dá)水平對上皮性卵巢癌患者診斷具有一定的價(jià)值。

圖1 血漿miR-196a及miR-1285對上皮性卵巢癌的診斷價(jià)值

2.4 血漿miR-196a及miR-1285與上皮性卵巢癌的關(guān)系 將研究組和對照組作為二分變量，以血漿miR-196a、miR-1285為自變量，以研究組為1，良性組和對照組為0，采用多元Logistic回歸模型對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果如表4所示，血漿miR-196a表達(dá)水平的升高是上皮性卵巢癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，miR-1285表達(dá)水平的降低是上皮性卵巢癌的獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05)。

表4 血漿miR-196a及miR-1285與上皮性卵巢癌的關(guān)系

2.5 上皮性卵巢癌血漿miR-196a與miR-1285的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血漿miR-196a與miR-1285呈負(fù)相關(guān)(r=-0.658，P=0.039)。

3 討論

上皮性卵巢癌是卵巢癌中常見的病理類型，惡性度較高，易發(fā)生盆腹腔廣泛轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[8]。另外卵巢癌位于盆腔深部，早期不易診斷，而中晚期患者手術(shù)治療及放化療效果不佳，具有較高的死亡率，嚴(yán)重威脅女性生命健康[9]。上皮性卵巢癌多發(fā)于絕經(jīng)后女性，女性絕經(jīng)年齡約50歲，因此將50歲作為年齡劃分節(jié)點(diǎn)。

miRNA是高度保守的內(nèi)源性非編碼的RNA分子，在人類生理過程及發(fā)育過程中可以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，但同時(shí)基因表達(dá)的失調(diào)在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中也具有重要的作用[10-11]。癌癥中miRNA的異常表達(dá)具有促進(jìn)或抑制癌癥發(fā)展的作用[12]。miR-196a是由HOX家族基因轉(zhuǎn)錄而來。研究顯示位于不穩(wěn)定位點(diǎn)的人類miRNAs與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程具有密切關(guān)系，HOX家族的基因即位于不穩(wěn)定位點(diǎn)，因此miR-196a的表達(dá)水平在腫瘤的發(fā)生發(fā)展也起到關(guān)鍵作用[13-14]。

本研究分別選取上皮性卵巢癌患者、上皮性卵巢良性腫瘤患者及健康者為受檢者，研究各組受檢者學(xué)血漿中miR-196a及miR-1285表達(dá)水平的差異，結(jié)果顯示研究組患者血漿miR-196a表達(dá)水平明顯高于對照組和良性組，miR-1285表達(dá)水平明顯低于對照組和良性組，對照組和良性組血漿中miR-196a及miR-1285表達(dá)水平組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且在病理學(xué)分期中，隨著分期的增加，患者血漿中miR-196a表達(dá)水平顯著增加，miR-1285表達(dá)水平顯著降低，提示上皮性卵巢癌中，miR-196a可能發(fā)揮促癌基因的作用，而miR-1285發(fā)揮抑癌基因的作用，進(jìn)而對上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程進(jìn)行調(diào)節(jié)。以往研究顯示miR-196a在多種癌癥患者血漿呈現(xiàn)高表達(dá)水平，可以通過PI3K/Akt、wnt-βcatenin等通路促進(jìn)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及侵襲，且會(huì)使癌細(xì)胞對化療藥物的耐藥性增加[15]。miR-1285可表達(dá)于多種惡性腫瘤患者，且與癌癥的發(fā)生發(fā)展過程具有密切的關(guān)系[16]。沉默的miR-1285對腫瘤抑制因子P53的表達(dá)具有促進(jìn)作用，提示miR-1285可能是腫瘤抑制因子。有文獻(xiàn)報(bào)道顯示卵巢癌患者組織及血漿中miR-1285表達(dá)水平與健康受試者比較顯著降低，提示miR-1285在卵巢癌的進(jìn)展過程中具有重要的參與作用，且miR-1285表達(dá)水平與患者惡性腫瘤的癌變程度關(guān)系密切[17]。

采用ROC曲線分析血漿中miR-196a及miR-1285對上皮性卵巢癌的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示，上皮性卵巢癌患者血漿miR-196a的AUC及95%CI分別為0.839(0.785~0.894，P<0.001)，miR-1285的AUC及95%CI分別為0.858(0.810~0.905，P<0.001)，提示血漿miR-196a及miR-1285表達(dá)水平對上皮性卵巢癌患者預(yù)后評(píng)估具有一定的價(jià)值。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-196a與miR-1285表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)；多元Logistic分析結(jié)果顯示，miR-196a是上皮性卵巢癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，miR-1285是上皮性卵巢癌的獨(dú)立保護(hù)因素。提示檢測血漿miR-196a及miR-1285表達(dá)水平可以提高上皮性卵巢癌早期診斷的準(zhǔn)確性，可獨(dú)立作為上皮性卵巢癌早期診斷的新型腫瘤標(biāo)志物。文獻(xiàn)報(bào)道顯示miR-1285的表達(dá)水平隨著卵巢癌惡化程度的增加而降低，提示低表達(dá)的miR-1285參與了卵巢癌的進(jìn)展，可作為卵巢上皮性癌的預(yù)后因素。

綜上所述，上皮性卵巢癌患者血漿中miR-196a表達(dá)水平升高，miR-1285表達(dá)水平降低，且miR-196a和miR-1285對上皮性卵巢癌中均具有一定的診斷價(jià)值，可獨(dú)立作為上皮性卵巢癌早期診斷的新型腫瘤標(biāo)志物。