中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究及SSR新標(biāo)記開(kāi)發(fā)

李 敏, 張丹麗, 李榮榮, 雷 廷, 宋鮮梅, 卜文俊

(1.太原師范學(xué)院生物系, 山西晉中 030619; 2.南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院昆蟲(chóng)學(xué)研究所, 天津 300071)

隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)蝽類昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序越來(lái)越多，截止2021年1月，美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)創(chuàng)建和維護(hù)的TSA(Transcriptome Shotgun Assembly)數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了105種蝽類昆蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，主要來(lái)自于陸生吸血和植食性種類，如長(zhǎng)紅獵蝽Rhodniusprolixus、騷擾錐獵蝽Triatomainfestans、吸血錐獵蝽Triatomadimidiata、溫帶臭蟲(chóng)Cimexlectularius、茶翅蝽Halyomorphahalys、豆莢草盲蝽Lygushesperus、美國(guó)牧草盲蝽Lyguslineolaris、稻綠蝽Nezaraviridula、南瓜緣蝽Anasatristis等。對(duì)于其基因功能的挖掘，也主要集中于這些種類。Nevoa等(2018)利用高通量測(cè)序技術(shù)組裝并描述了獵蝽科的錐蝽屬Panstrongyluslignarius的唾液腺和脂肪體轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)生的編碼序列，發(fā)現(xiàn)在唾液腺的蛋白質(zhì)家族中，脂鈣素是最豐富的；脂肪體轉(zhuǎn)錄組顯示了與代謝功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，提高了對(duì)血食性獵蝽的唾液腺和脂肪體功能的認(rèn)識(shí)，并發(fā)現(xiàn)了在病媒和脊椎動(dòng)物宿主之間相互作用中的重要分子。Denecke等(2020)以稻綠蝽N.viridula中腸為研究對(duì)象，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，建立了中腸4個(gè)部分的表達(dá)圖譜，表明中腸前段(M1-M3區(qū)域)在消化和異種生物代謝中發(fā)揮作用，而中腸最后段(M4區(qū)域)富含跨膜蛋白，為后續(xù)研究稻綠蝽的中腸分子生理奠定了基礎(chǔ)。對(duì)于水生、捕食性蝽類，目前只檢索到TSA數(shù)據(jù)庫(kù)中有絨盾大仰蝽N.glauca轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，但是并未有詳細(xì)的文獻(xiàn)報(bào)道。

同源異型基因(homeotic genes)是調(diào)控生物體型生長(zhǎng)發(fā)育的一類基因家族，該基因家族因含有一段長(zhǎng)約180 bp高度保守的DNA序列，即同源異型盒(homeobox)，也稱為Hox基因。Hox基因在真核生物中廣泛存在，通常成簇分布，在胚胎發(fā)育中對(duì)于體節(jié)和組織特征的決定以及器官的形成具有重要的調(diào)控作用(Erikssonetal., 2010; Feiner and Wood, 2019)。Hox基因最早在果蠅中發(fā)現(xiàn)，分為ANTP-C(antennapediacomplex)基因簇和BX-C(bithoraxcomplex)基因簇兩大類，ANTP-C基因簇包括labial(lab)，proboscipedia(pb)，Deformed(Dfd)，Sexcombsreduced(Scr)，Antennapedia(Antp)；BX-C基因簇包括Ultrabithorax(Ubx)，abdominal-A(abd-A)和abdominal-B(abd-B)等基因(McGinnis and Krumlauf, 1992; Gehringetal., 2009)。

本研究擬采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)中華大仰蝽進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，建立中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并通過(guò)本地ncbi-blast-2.1軟件對(duì)其Hox基因進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步研究其捕食行為及仰泳仿生學(xué)機(jī)制提供分子生物學(xué)依據(jù)；利用軟件MISA(Beieretal., 2017)基于中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組unigenes進(jìn)行SSR新標(biāo)記挖掘和篩選，通過(guò)毛細(xì)管電泳進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，為后期研究中華大仰蝽遺傳多態(tài)性及基因圖譜構(gòu)建提供一種方便而快捷的途徑，同時(shí)推動(dòng)中華大仰蝽種質(zhì)資源的保護(hù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

本研究試蟲(chóng)中華大仰蝽采自山西省太原市尖草坪區(qū)上蘭村水文站(38°0′11″N, 112°26′28″E)，去掉腹部后置于RNAlater(索萊寶Solarbio)樣本保存液中，帶回實(shí)驗(yàn)室放-80℃低溫冰箱保存。中華大仰蝽地理種群信息見(jiàn)表1。

表1 中華大仰蝽地理種群樣本信息

1.2 總RNA提取、cDNA文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

用Trizol法提取中華大仰蝽的總RNA，總RNA質(zhì)量以紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。樣品檢測(cè)合格后合成cDNA第1鏈，隨后加入dNTPs、DNA Polymerase I、RNaseH和緩沖液合成cDNA第2鏈，并純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA，先進(jìn)行末端修復(fù)，加A尾并連接相應(yīng)的測(cè)序接頭，再用AMPureXP beads選擇其片段大小，最后通過(guò)橋式PCR擴(kuò)增，富集得到cDNA文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，使用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，文庫(kù)檢測(cè)合格后采用第2代測(cè)序技術(shù)，基于Illumina NextSeq500測(cè)序平臺(tái)，對(duì)文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)拼接和組裝

對(duì)中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到原始序列(raw reads)，通過(guò)接頭污染去除和質(zhì)量過(guò)濾獲得clean reads。同時(shí)計(jì)算Q20(堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在99%以上的堿基所占百分比)，Q30(堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在99.9%以上的堿基所占百分比)和GC含量?；贒BG(De Bruijn Graph)拼接原理，使用Trinity v2.0.2軟件(k-mer 25 bp)對(duì)高質(zhì)量序列(clean reads)進(jìn)行拼接，獲得轉(zhuǎn)錄本序列。

1.4 Unigenes的聚類與功能注釋

將Trinity v2.0.2拼接得到的每一條transcript與參考nr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blastx比對(duì)(E-value<1e-5)。將比對(duì)至相同GI號(hào)的transcript歸為同一unigene。對(duì)聚類得到的unigenes比對(duì)nr, NCBI, Swiss-Prot, GO, eggNOG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因功能注釋。

1.5 Hox基因的篩選和鑒定

通過(guò)NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Protein數(shù)據(jù)庫(kù)下載黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的Hox基因家族序列，利用本地軟件ncbi-blast-2.11.0中makeblastdb程序建立黑腹果蠅Hox蛋白序列參考數(shù)據(jù)庫(kù)。以中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組unigenes為查詢序列，利用ncbi-blast-2.11.0中blastx程序與所建本地參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)(E-value<1e-5)，然后使用perl腳本在結(jié)果中篩選相似度大于50%的序列，獲得中華大仰蝽的Hox基因序列。

同樣方法下載半翅目豌豆長(zhǎng)管蚜Acyrthosiphonpisum、鞘翅目赤擬谷盜Triboliumcastaneum和鱗翅目家蠶Bombyxmori的Hox蛋白序列，利用MEGA X(Kumaretal., 2018)軟件基于p-distance模型和最小進(jìn)化法(minimum evolution method, ME)構(gòu)建Hox蛋白序列的系統(tǒng)樹(shù)。

1.6 SSR引物設(shè)計(jì)與引物初篩

用MISA軟件對(duì)中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組unigenes進(jìn)行SSR位點(diǎn)掃描。選擇二核苷酸至六核苷酸不同重復(fù)序列的SSR位點(diǎn)，用SSRHunter v1.3軟件(Li and Wan, 2005)截取SSR位點(diǎn)上下游150 bp，利用Primer Premier 5.0(Lalitha, 2000)設(shè)計(jì)引物。引物設(shè)計(jì)遵循標(biāo)準(zhǔn)：引物序列長(zhǎng)度為18～25 bp，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在100～350 bp，GC含量為40%～60%之間，退火溫度為55～65℃，正反向引物的退火溫度值相差不大于3℃，引物末端禁用A和T(Blairetal., 2009)。共設(shè)計(jì)引物29對(duì)(表2)，由上海派森諾生物科技股份有限公司合成。

表2 基于中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定的SSR引物信息

利用通用型基因組提取試劑盒(康為世紀(jì))按照說(shuō)明書(shū)步驟提取中華大仰蝽浙江安期峰(ZJZT)、江蘇瓦屋山(JSCL)和安徽黃山(AHHH)3個(gè)地理種群(表1)總基因組DNA，然后用NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific)檢測(cè)基因組DNA濃度，將提取的基因組DNA在-20℃保存，用于SSR引物初篩。PCR反應(yīng)體系(20 μL): 基因組DNA模板(130 ng/μL)1 μL, 2×Taq Master Mix 10 μL,正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, 加ddH2O至20 μL。PCR擴(kuò)增程序: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s, 最佳退火溫度30 s, 72℃延伸30 s, 30次循環(huán); 72℃再延伸5 min, 4℃保存。PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳，采用PBR 322 DNA/Msp Ⅰ Maker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)的Image Lab軟件拍照，進(jìn)行結(jié)果分析。

1.7 SSR引物復(fù)選及基因分型

從16對(duì)SSR引物中選擇擴(kuò)增條帶單一且清晰的5對(duì)引物(NcAF/NcAR, NcCF/NcCR, NcKF/NcKR, NcLF/NcLR和NcQF/NcQR)(表2)，在其正向引物的5′端加FAM熒光標(biāo)記，用未加標(biāo)記的反向引物與5′ FAM的正向引物對(duì)選自代表中國(guó)大陸的遼寧得利寺(LNSD)、山東萊蕪(SDJL)、山西運(yùn)城(SXTF)、陜西少華山(SXXW)、陜西寶雞(SXXB)、湖北宜昌(HBWQ)、重慶彭水(CQPB)和廣東南嶺(GDGN)7個(gè)地理種群的樣本(表1)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行SSR引物復(fù)選、基因分型以及多態(tài)性驗(yàn)證。PCR反應(yīng)體系(20 μL): 基因組DNA模板(15 ng/μL)1 μL, dNTPs(2.5 mmol/L)0.5 μL, Taq 酶0.5 μL, 正向熒光引物(10 μmol/L)1 μL, 反向普通引物(10 μmol/L)1 μL, 10×Buffer 2 μL, ddH2O 14 μL。PCR擴(kuò)增程序: 95℃ 5 min; 95℃ 30 s, 62-52℃ 30 s, 10個(gè)循環(huán); 72℃ 30 s, 95℃ 30 s, 52℃ 30 s, 25個(gè)循環(huán); 72℃ 30 s, 72℃ 7 min, 4℃保存。擴(kuò)增PCR產(chǎn)物用3730XL DNA Analyzer(ABI，美國(guó))進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果用GeneMarker v2.2.0軟件讀取，獲得毛細(xì)管電泳的峰圖和每個(gè)信號(hào)峰的片段長(zhǎng)度。利用Cervus 3.0軟件分析各個(gè)SSR位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)。

2 結(jié)果

2.1 中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、拼接和組裝

運(yùn)用Illumina NextSeq500測(cè)序平臺(tái)對(duì)中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得36 675 702條原始reads；堿基錯(cuò)誤率為0.01%；Q20堿基比例為90.22%；Q30堿基比例為83.12%。數(shù)據(jù)過(guò)濾后，獲得的clean reads平均數(shù)為34 782 282條(NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào): SRR13259254)，組裝到37 801條unigenes，總長(zhǎng)度為25 517 069 bp，最大長(zhǎng)度為23 542 bp，平均長(zhǎng)度為675 bp。N50和N90分別為913 bp和304 bp，所對(duì)應(yīng)序列數(shù)分別為7 888條和27 612條。GC百分比含量為52.92%。所有37 801條unigenes序列用于后續(xù)的SSR搜索。

2.2 中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組unigenes的功能注釋

注釋到nr數(shù)據(jù)庫(kù)的unigenes最多，為36 474條，占96.49%；32 470條unigenes注釋到Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)，占85.89%；27 781條unigenes注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)，占73.49%；35 079條unigenes注釋到eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)，占92.80%；5 638條unigenes注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，占14.91%。在所有數(shù)據(jù)庫(kù)中都能被注釋到的unigenes為4 542條，占12.02%(表3)。

表3 中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組unigenes在5個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)

GO注釋結(jié)果表明，27 781條unigenes共得到279 368條功能注釋，分為三大類，即生物學(xué)過(guò)程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)。其中生物學(xué)過(guò)程注釋的序列數(shù)最多為119 086條，包括24個(gè)功能條目，其次是細(xì)胞組分注釋的序列為118 137條，包括21個(gè)功能條目，注釋序列最少的是分子功能為41 425條，包括17個(gè)功能條目(圖1)。在生物學(xué)過(guò)程分類中，注釋到細(xì)胞進(jìn)程(cellular process)和單有機(jī)體進(jìn)程(single-organism process)的序列數(shù)最多，分別為19 242和17 044條。在細(xì)胞組分中，注釋到細(xì)胞(cell)和細(xì)胞部分(cell part)的序列占主導(dǎo)地位，分別為20 834和20 832條。在分子功能分類中，注釋到結(jié)合(binding)和催化活性(catalytic activity)的序列數(shù)最多，分別為19 959和11 556條。注釋的序列超過(guò)10 000條的功能條目共有11個(gè)，分別是細(xì)胞、細(xì)胞部分、結(jié)合、細(xì)胞進(jìn)程、細(xì)胞器(organelle)、單有機(jī)體進(jìn)程、代謝進(jìn)程(metabolic process)、生物調(diào)節(jié)(biological regulation)、細(xì)胞器部分(organelle part)、催化活性和細(xì)胞膜(membrane)。

圖1 中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組unigenes的GO功能注釋

eggNOG的注釋結(jié)果如圖2所示。37 801條unigenes共得到41 259條注釋，分為25類，數(shù)量最多的是注釋到S類未知功能(function unknown)，有6 205條；其余依次是T類信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(signal transduction mechanisms)，有6 159條；R類僅一般功能預(yù)測(cè)(general function prediction only)，有6 035條；K類轉(zhuǎn)錄(transcription)，有3 840條；O類翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶(posttranslational modification, protein turnover, chaperones)有3 147條；U類細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸(intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport)有2 183條；其余的都低于2 000條；X類未定義的(undetermined)為0條。

圖2 中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組unigenes的eggNOG功能注釋分類圖

KEGG代謝通路富集分析結(jié)果表明，共有5 638條unigenes參與到新陳代謝(metabolism)、遺傳信息處理(genetic information processing)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)、細(xì)胞進(jìn)程(cellular process)、人類疾病(human disease)和有機(jī)系統(tǒng)(organism system)這六大類生化代謝通路中(圖3)。其中有機(jī)系統(tǒng)通路中基因最多(2 009條)，它們主要參與內(nèi)分泌系統(tǒng)(endocrine system)和免疫系統(tǒng)(immune system)等過(guò)程，分別為551條和410條。在這38組代謝通路子類別中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)通路的基因最多，為1 142條。這些代謝通路相關(guān)的基因分布于已知的245個(gè)代謝通路，其中富集最多的10條通路分別是核糖體(ribosome)、RNA運(yùn)輸(RNA transport)、內(nèi)吞作用(endocytosis)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工(protein processing in endoplasmic reticulum)、嘌呤代謝(purine metabolism)、剪接體(spliceosome)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用(ubiquitin-mediated proteolysis)和嘧啶代謝(pyrimidine metabolism)。

圖3 中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組unigenes的KEGG通路分析

2.3 Hox基因家族的歸類

中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組中共注釋到17條Hox基因序列，包含了所有主要的8種Hox基因：lab1條(unigene: c23840_g1_i2)，pb2條(unigenes: c57238_g1_i1, c14084_g1_i1)，Dfd1條(unigene: c48312_g1_i1)，Scr1條(unigene: c25114_g7_i1)，Antp3條(unigenes: c25114_g1_i5, c25114_g6_i1, c25114_g3_i3)，Ubx1條(unigene: c25114_g2_i1)，abd-A1條(unigene: c25114_g5_i1)和abd-B7條(unigenes: c17276_g1_i1, c2333_g1_i1, c7432_g1_i2, c22062_g1_i1, c7763_g1_i1, c76858_g1_i1, c22143_g1_i1)(圖4)。

圖4 最小進(jìn)化法構(gòu)建的基于氨基酸序列的Hox蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

2.4 SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證

中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組unigenes序列經(jīng)MISA軟件搜索，得到3 124個(gè)SSR位點(diǎn)，占總unigenes數(shù)量的8.26%，分布于2 671條unigenes序列中，發(fā)生頻率(含有SSR位點(diǎn)的unigenes數(shù)量與總unigenes數(shù)量的比值)為7.07%。含1個(gè)以上SSR位點(diǎn)的unigenes序列350條，含不同重復(fù)類型SSR位點(diǎn)的unigenes序列171條。長(zhǎng)度大于20 bp的SSR位點(diǎn)有245個(gè)，占總數(shù)的7.84%，長(zhǎng)度在12～20 bp的SSR位點(diǎn)有1 859個(gè)，占總數(shù)的59.51%，其中20 bp以上的低級(jí)重復(fù)基元有237個(gè)，占20 bp以上SSR位點(diǎn)數(shù)的96.73%。從分布情況看，中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組unigenes中每8 168 bp就出現(xiàn)一個(gè)SSR位點(diǎn)，即平均距離。從中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組中共搜索到6種核苷酸重復(fù)類型，不同重復(fù)類型差異較大，重復(fù)基元主要以單、二和三核苷酸為主，有3 095個(gè)，占中華大仰蝽SSR位點(diǎn)總數(shù)的99.07%。出現(xiàn)數(shù)量最多的是單核苷酸重復(fù)類型，占總SSR位點(diǎn)的53.49%，其次是三核苷酸重復(fù)類型，占總SSR位點(diǎn)的33.00%，數(shù)量最少的是六核苷酸重復(fù)類型，只占總SSR位點(diǎn)的0.03%。不同核苷酸重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)有所差異，單核苷酸重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)主要集中在10～13次，二核苷酸重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)主要集中在6～8次，三核苷酸重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)主要集中在5～7次，四、五、六核苷酸重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)主要以5次為主(表4)。共有33種重復(fù)基元出現(xiàn)，單、二、三、四、五以及六核苷酸重復(fù)基元的種類分別是2, 4, 10, 14, 2和1種。其中出現(xiàn)頻率最多的重復(fù)基元是A/T，其次是AGG/CCT。單核苷酸重復(fù)基元中，A/T為優(yōu)勢(shì)基元，占單核苷酸重復(fù)的88.51%;二核苷酸重復(fù)基元中，出現(xiàn)頻率最多的是AC/GT，占二核苷酸重復(fù)的37.15%，其次是AG/CT，占二核苷酸重復(fù)的36.39%;三核苷酸重復(fù)基元中，出現(xiàn)頻率最高的為AGG/CCT，占三核苷酸重復(fù)的24.25%;四、五和六核苷酸重復(fù)基元類型數(shù)量最少，總計(jì)占總SSR數(shù)量的0.91%(表5)。

表4 中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)的數(shù)量與分布

表5 中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)基元的分布特征

PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，29對(duì)SSR引物中有16對(duì)可以成功擴(kuò)增出目的條帶，擴(kuò)增效率為55.17%，有13對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期產(chǎn)物片段不符。隨機(jī)選取2對(duì)引物對(duì)3個(gè)地理種群進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示引物NcB1F/NcB1R和NcAF/NcAR均可以擴(kuò)增出目的條帶(圖5)。毛細(xì)管電泳及GeneMarker v2.2.0軟件分析顯示，在7個(gè)群體中擴(kuò)增5個(gè)位點(diǎn)(NcAF/NcAR, NcCF/NcCR, NcKF/NcKR, NcLF/NcLR和NcQF/NcQR)，除NcQF/NcQR外，均有明確且符合預(yù)期的等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物。位點(diǎn)NcAF/NcAR等位基因數(shù)(Na)為2，多態(tài)信息含量(PIC)為0.375，在群體分析中所能提供的遺傳信息較少；NcCF/NcCR, NcKF/NcKR和NcLF/NcLR等位基因數(shù)分別為13, 18和14，多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.870, 0.902和0.857，均大于0.5(表6)，說(shuō)明中華大仰蝽微衛(wèi)星的等位基因分布較豐富，可以用于種群差異性分析(Botsteinetal., 1980)。

圖5 中華大仰蝽3個(gè)地理種群SSR引物NcB1F/NcB1R(A)和NcAF/NcAR(B)的PCR檢測(cè)結(jié)果

表6 中華大仰蝽7個(gè)地理種群轉(zhuǎn)錄組5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性

3 討論

3.1 中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組

由于目前中華大仰蝽全基因組尚未公布，其各相關(guān)基因信息無(wú)法得知，導(dǎo)致中華大仰蝽基因功能研究進(jìn)展緩慢。本研究通過(guò)RNA-seq技術(shù)對(duì)中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行denovo組裝與分析，共獲得34 782 282條clean reads，樣本Q30堿基比例不低于83.12%，unigenes 37 801條，N50為913 bp。據(jù)報(bào)道，樣本數(shù)據(jù)的Q30堿基比例不小于80%，測(cè)序質(zhì)量較好；N50值越大說(shuō)明序列拼接的完整性越好?？梢?jiàn)本試驗(yàn)獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，保證了轉(zhuǎn)錄組分析的準(zhǔn)確性及重要功能基因挖掘的可能性。

根據(jù)與nr和Swiss-Prot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果，36 474條unigenes(96.49%)比對(duì)至nr數(shù)據(jù)庫(kù)，85.89%的unigenes被比對(duì)至Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)(表3)，說(shuō)明本次Illumina測(cè)序獲得了大量在中華大仰蝽中表達(dá)的不同基因。GO數(shù)據(jù)庫(kù)可以全面描述中華大仰蝽基因和基因產(chǎn)物的屬性。本研究在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中共得到279 368條功能注釋，分為三大類，其中注釋到生物學(xué)過(guò)程的unigenes數(shù)目最多、其次為注釋到細(xì)胞組分的，注釋到分子功能的unigenes最少(圖1)，這與已報(bào)道的蠋蝽Armachinensis(Zouetal., 2013)、大墊尖翅蝗Epacromiuscoerulipes(金永玲等, 2015)、綠豆象Callosobruchuschinensis(鄭海霞等, 2018)、中國(guó)真龍虱Cybisterchinensis(Hwangetal., 2018)以及麥紅吸漿蟲(chóng)Sitodiplosismosellana(蔣月麗等, 2020)等相同。而黃曲條跳甲的轉(zhuǎn)錄組GO分類結(jié)果則是注釋到分子功能的unigenes數(shù)目最多，其次為注釋到生物學(xué)過(guò)程的，注釋到細(xì)胞組分的unigenes最少(賀華良等, 2012),這可能與不同的昆蟲(chóng)有關(guān)。利用eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)中華大仰蝽unigenes進(jìn)行基因功能分類(圖2)，可從組學(xué)水平上找尋直系同源體，預(yù)測(cè)未知ORF的生物學(xué)功能。研究表明基于Nanopore長(zhǎng)讀段測(cè)序數(shù)據(jù)在全長(zhǎng)ORF預(yù)測(cè)和鑒定新基因方面具有顯著優(yōu)勢(shì)(杜宇等, 2020)，為下一步完善中華大仰蝽的組學(xué)信息、提高基因功能注釋的準(zhǔn)確性，提供了可靠思路。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述unigenes進(jìn)行代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)涉及245個(gè)具體的代謝通路分支，參與到中華大仰蝽的核糖體、RNA運(yùn)輸、內(nèi)吞、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、嘌呤代謝、剪接體、氧化磷酸化、PI3K-Akt信號(hào)通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用和嘧啶代謝等過(guò)程中(圖3)。同時(shí)鑒定出了所有主要的8種Hox基因(lab,pb,Dfd,Scr,Antp,Ubx,abd-A和abd-B)，為進(jìn)一步大量挖掘中華大仰蝽生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的重要表達(dá)基因，開(kāi)展中華大仰蝽的基因克隆及功能驗(yàn)證等研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

3.2 中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組SSR引物設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)并進(jìn)行PCR擴(kuò)增的29對(duì)引物中，16對(duì)可以擴(kuò)增出目的條帶，但部分目的條帶不是很清楚，且出現(xiàn)非特異性條帶。雖然目前無(wú)法確定它們多態(tài)性的高低，但是說(shuō)明用于多態(tài)性檢測(cè)和分析的SSR位點(diǎn)的數(shù)量相當(dāng)可觀。SSR位點(diǎn)擴(kuò)增失敗可能是由于本研究所設(shè)計(jì)引物的SSR序列在基因組中的覆蓋率很低，造成擴(kuò)增產(chǎn)物很少以至于無(wú)法被檢測(cè)到，而對(duì)于一些引物的擴(kuò)增產(chǎn)物具有大量非特異性條帶的情況，很可能是因?yàn)檫@些SSR位于同源基因序列上的緣故(魏丹丹等, 2014)。

3.3 中華大仰蝽SSR的特性

通過(guò)生物信息學(xué)方法，從中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)37 801條unigenes中發(fā)掘出3 124個(gè)SSR位點(diǎn)，位點(diǎn)出現(xiàn)頻率為8.26%，比黃粉蟲(chóng)Tenebriomolitor(1.67%)(Zhuetal., 2013)、云南切梢小蠹Tomicusyunnanensis(1.29%)(袁遠(yuǎn)等, 2014)、桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis(4.23%)(魏丹丹等, 2014)和扶桑綿粉蚧Phenacoccussolenopsis(5.79%)(羅梅等, 2014)出現(xiàn)頻率要高，比灰飛虱Laodelphaxstriatellus(16.67%)(Zhangetal., 2010)和黑翅土白蟻Odontotermesformosanus(9.98%)(Huangetal., 2012)出現(xiàn)頻率要低。分析原因，除了由于SSR搜索方法或標(biāo)準(zhǔn)有所差異外，最根本的原因可能是物種本身的差異。

中華大仰蝽轉(zhuǎn)錄組SSR的種類較多，一至六核苷酸重復(fù)都有出現(xiàn)，重復(fù)類型主要為單核苷酸重復(fù)，其次是三核苷酸重復(fù)(表4)，這與扶桑綿粉蚧、黃粉蟲(chóng)和褐飛虱Nilaparvatalugens(劉玉娣和侯茂林, 2010)SSR重復(fù)類型是一樣的。而在粘蟲(chóng)Mythimnaseparata(胡艷華等, 2015)及近緣的蠋蝽(Zouetal., 2013)轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)類型主要為單核苷酸重復(fù)，其次是二核苷酸重復(fù)；黑翅土白蟻O.formosanus轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)類型主要為二核苷酸重復(fù)，其次是三核苷酸重復(fù)；齒緣刺獵蝽Sclominaerinacea(黎東海和趙萍, 2019)轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)類型主要為三核苷酸重復(fù)，其次是二核苷酸重復(fù)。由此可見(jiàn)不同物種間SSR的重復(fù)類型存在差異。

中華大仰蝽SSR重復(fù)基元主要以單、二和三核苷酸為主，有3 095個(gè)，占中華大仰蝽SSR位點(diǎn)總數(shù)的99.07%。Dreisigacker等(2004)認(rèn)為低級(jí)基元，包括單、二、三核苷酸重復(fù)基元普遍比高級(jí)基元的SSR多態(tài)性高。Temnykh等(2001)的研究表明，SSR的長(zhǎng)度是影響多態(tài)性的重要因素。當(dāng)SSR長(zhǎng)度在20 bp及20 bp以上時(shí)多態(tài)性較高，在12～20 bp之間的SSR多態(tài)性中等，長(zhǎng)度在12 bp以下時(shí)多態(tài)性極低。本研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)度大于20 bp的SSR位點(diǎn)有245個(gè)，占SSR位點(diǎn)總數(shù)的7.84%，長(zhǎng)度在12～20 bp的SSR位點(diǎn)有1 859個(gè)，占SSR位點(diǎn)總數(shù)的59.51%。此外，本研究中20 bp以上的低級(jí)重復(fù)基元較多，共237個(gè)，占20 bp以上SSR位點(diǎn)數(shù)的96.73%。

等位基因數(shù)和雜合度與SSR位點(diǎn)的多態(tài)性成正相關(guān)。多態(tài)信息含量(PIC)是衡量微衛(wèi)星位點(diǎn)基因多態(tài)性高低的重要指標(biāo)。PIC>0.5具高度多態(tài)性，0.25