外源有機物料添加對濱海鹽堿土細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

王艮梅，陳 捷，范之馨，張煥朝①，項 劍

(1.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

鹽堿土是鹽土和堿土的統(tǒng)稱，具有鹽堿含量較高、理化性質(zhì)差(土壤層結(jié)構(gòu)緊實，孔隙度低，土壤有機質(zhì)含量和肥力低)等特點，嚴(yán)重制約了鹽堿土的利用[1]。我國鹽堿地總面積達3 600萬hm2，占全國可利用土地面積的4.88%，而濱海地區(qū)又是鹽堿土集中分布地區(qū)之一。據(jù)估計，我國15 m等深線內(nèi)的淺海與灘涂有0.14億hm2[2]。鹽堿土是我國重要的后備土地資源，如何改良和合理開發(fā)利用一直是土壤學(xué)及農(nóng)林學(xué)科的研究熱點[3]。目前，常用的改良措施有物理改良、化學(xué)改良、生物改良以及多種改良措施的綜合，其中，添加有機物料作為綜合性改良措施，得到較多研究，如施用秸稈、有機肥和生物炭等措施，并取得了較好效果，在降低土壤鹽分、pH的同時，能夠提高土壤肥力、有機質(zhì)含量，增加土壤孔隙度，改善土壤理化性質(zhì)[4-5]。

土壤微生物在土壤有機物降解、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、碳氮循環(huán)以及維系土壤結(jié)構(gòu)、抗干擾能力等方面均發(fā)揮著重要作用[6-7]。有研究表明，受鹽離子濃度高、水熱條件差、碳氮源不足等因素的制約，濱海鹽堿土土壤微生物總量低于同生態(tài)區(qū)域非鹽堿土；在微生物結(jié)構(gòu)組成上，細菌是鹽堿土壤中的優(yōu)勢微生物，豐度顯著高于真菌和放線菌[8-9]。一般而言，有機物料在土壤中的分解轉(zhuǎn)化主要依賴于土壤中的不同微生物群落，且轉(zhuǎn)化過程及參與的微生物受到土壤環(huán)境條件的影響。因此，針對土壤鹽堿化程度高、理化性質(zhì)較差的濱海鹽堿土壤，添加外源有機物的改良過程極可能改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。

目前，有機物料改良濱海鹽堿土壤的研究主要針對土壤理化性質(zhì)[4,10]，雖有涉及不同有機物料添加對土壤微生物的影響研究，但研究材料多為單一的有機物料，研究對象鹽堿土壤也存在地域差異[11-13]，所獲得的研究結(jié)果可比性較差。

因此，以江蘇省鹽城市濱海鹽堿土為研究對象，采用高通量測序技術(shù)和生物信息分析相結(jié)合的方法，研究秸稈、生物炭和牛糞有機肥添加后土壤中細菌群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性變化，揭示細菌群落對不同有機物料改良濱海鹽堿土的響應(yīng)，可為濱海鹽堿地的改良和鹽堿地土壤生態(tài)學(xué)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于江蘇省鹽城市東川墾區(qū)(33°0′～33°01′ N， 120°48′～120°49′ E)的金海農(nóng)場。該地區(qū)圍墾于1999年，圍墾后主要種植小麥、水稻和油菜等經(jīng)濟作物，是江蘇省沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所下屬的沿海農(nóng)業(yè)科技示范基地。研究區(qū)位于北亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，具有明顯的海洋性、季風(fēng)性氣候，四季分明，寒暑顯著，日照充足，雨水充沛，多年平均氣溫為14.6 ℃，無霜期為220 d，日照時間為2 169.6 h，多年平均降水量為1 051.0 mm，主要集中在6—8月的雨季，多年平均蒸發(fā)量為827.5 mm。

大豐區(qū)為典型的淤積平原，有大面積沿海灘涂資源，是我國重要的后備土地資源。土壤為沖積鹽土類潮鹽土亞類，質(zhì)地為由海相沉積物發(fā)育而成的砂質(zhì)壤土，屬輕、中度鹽漬化土壤。試驗開展前測得供試土壤平均pH為8.53，EC為862.5 μS·cm-1，w(總有機碳)為9.35 g·kg-1，w(全氮)為1.03 mg·kg-1，w(有效磷)為19.56 mg·kg-1，w(速效鉀)為177.67 mg·kg-1，供試樣地曾于試驗開展前1 a種植田菁。

1.2 供試材料與試驗設(shè)計

1.2.1供試材料

供試有機物料包括小麥秸稈、生物炭和牛糞有機肥。小麥秸稈為農(nóng)場當(dāng)年種植小麥的籽粒收獲后的地上部分，有機碳含量為 4.02 g·kg-1，全氮含量為 0.072 g·kg-1，pH為 7.2，C/N比為 55.8，全磷、全鉀含量小于0.1 g·kg-1，小麥秸稈曬干、切碎至2～5 cm小段備用；生物炭為小麥秸稈在400 ℃條件下高溫裂解制成，購自湖北金日生態(tài)能源股份有限公司，有機碳含量為 5.51 g·kg-1，全氮含量為0.112 g·kg-1，pH 為 9.96，C/N 比為49.2，全磷、全鉀含量小于0.1 g·kg-1；牛糞有機肥購自東臺田娘農(nóng)業(yè)生態(tài)有機肥有限公司，有機碳含量為3.04 g·kg-1，全氮含量為0.204 g·kg-1，pH 為 7.87，C/N比為14.9，全磷含量為0.168 g·kg-1，全鉀含量為0.134 g·kg-1。供試土壤為海相沉積物發(fā)育而成的砂質(zhì)壤土。

1.2.2試驗設(shè)計

在研究區(qū)選擇土壤性質(zhì)基本一致的約800 m2樣地用于布置試驗小區(qū)。試驗共設(shè)牛糞有機肥處理(C)、生物炭處理(B)、小麥秸稈處理(S)和空白對照(CK)4個處理，每個處理設(shè)3個重復(fù)小區(qū)，共12個小區(qū)，每個小區(qū)面積為32 m2(4 m×8 m)。試驗小區(qū)之間用寬100 cm、深30 cm的隔離帶隔開，以減少不同處理樣地間的干擾。有機物料添加量為30 t·hm-2，即每個小區(qū)添加96 kg物料。

2019年7月6日按照預(yù)先設(shè)計好的處理布置田間試驗。供試有機物料均勻地覆蓋在試驗小區(qū)土壤表面，然后使用旋耕機將其與耕層(0～20 cm)土壤混勻。試驗樣地上不種植任何植物。

1.3 土壤樣品采集與分析

1.3.1土壤樣品采集

有機物料施用3個月后(2019年10月6日)在各試驗小區(qū)內(nèi)按照S形進行布點，采集0～20 cm表層土壤樣品，每個試驗小區(qū)采集6個點(采集過程注意無菌操作，防止樣品污染)，混勻，去除根系、礫石等雜物后，分成兩份。一份土壤樣品立即裝入無菌管，置于冷藏箱中帶回實驗室，存放于-80 ℃冰柜中，并盡快用干冰保存送至廣州基迪奧生物科技有限公司，用于PCR擴增測序；另一份土壤樣品置于自封袋中帶回實驗室，風(fēng)干、研磨、過篩，用于測定土壤理化性質(zhì)。

1.3.2土壤理化性質(zhì)分析

土壤pH采用電位法(雷磁PHSJ-3F)測定；土壤鹽分采用電導(dǎo)法(雷磁DDS-307A)測定；土壤全氮(TN)含量采用半微量凱氏定氮法測定；土壤有效磷(AP)含量采用碳酸氫鈉浸提法測定；土壤有效鉀(AK)含量采用乙酸銨浸提-火焰光度法測定；土壤總有機碳(TOC)含量采用重鉻酸鉀氧化外加熱法測定。土壤理化性質(zhì)各項指標(biāo)測定的具體方法見文獻[14]。

1.3.3土壤微生物分析

用土壤DNA提取試劑盒(HiPure Soil DNA Kits，Magen，中國)提取土壤樣品的微生物DNA，并用NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Scientific，USA)檢測核酸純度和1 g·mL-1瓊脂凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量，使用引物341F (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′)對V3和V4可變區(qū)進行PCR擴增，之后使用AMPure XP Beads(BeckmanCoulter，USA)進行 PCR 產(chǎn)物純化，純化后用 Qubit 3.0 (ThermoFischer Scientific，USA)定量，進行第2輪擴增。對第2輪擴增產(chǎn)物用 AMPure XP Beads進行純化后，用 ABI StepOnePlus RealTime PCR System(Life Technologies，USA) 進行定量。按照Novaseq 6000(Illumina，USA) 的樣品要求規(guī)范化操作后，采用 PE250 模式上機測序。土壤樣品微生物多樣性具體測定過程由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測序得到原始數(shù)據(jù)(raw data)后進行數(shù)據(jù)過濾；之后對tags進行拼接、過濾、去嵌合體和去冗余處理，得到effective tags。使用 Uparse 軟件對所有樣品的全部 effective tags 序列進行聚類，以97%的一致性(identity)將序列聚類成為OTUs(operational taxonomic units)，并以最小序列數(shù)進行抽平處理，對比SILVA數(shù)據(jù)庫以70%置信度進行物種注釋。

采用Excel 2016對試驗數(shù)據(jù)進行匯總統(tǒng)計，采用IBM SPSS Statistics 21和R語言對微生物和土壤理化數(shù)據(jù)作進一步分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機物料添加對濱海鹽堿土壤理化性質(zhì)的影響

不同有機物料添加3個月后土壤理化性質(zhì)見表1。與對照相比，添加牛糞有機肥顯著降低土壤pH(P<0.05)，添加秸稈使土壤pH略有升高，但與對照之間無顯著差異(P>0.05)。添加秸稈處理土壤電導(dǎo)率(EC)降低，與其他3種處理之間差異顯著(P<0.05)。添加有機物料可提高土壤有機碳(TOC)和全氮(TN)含量，其中，生物炭處理有機碳含量與對照處理的差異達到顯著水平(P<0.05)；牛糞有機肥和秸稈兩種處理全氮含量與對照處理間差異顯著(P<0.05)。添加牛糞有機肥和生物炭后，土壤速效磷(AP)、速效鉀(AK)含量均顯著高于對照處理(P<0.05)。

表1 不同有機物料添加對土壤理化性質(zhì)的影響Table 1 Effect of the addition of different organic materials on soil physical and chemical properties

2.2 土壤樣品微生物測序結(jié)果分析

16S rRNA高通量測序和序列質(zhì)檢結(jié)果表明，4種處理土壤微生物共歸類為37門108綱213目286科444屬?？傂蛄袟l數(shù)為1 061 987條，總堿基數(shù)為484 312 434 bp，序列長度在306～478 bp之間。按最小樣本序列數(shù)抽平后，根據(jù)處理進行分組，當(dāng)1個分組內(nèi)OTU tag數(shù)均值大于1時，認(rèn)為該分組存在該OTU，并繪制Venn圖(圖1)。

S為秸稈處理，B為生物炭處理，C為牛糞有機肥處理，CK為對照。

如圖1所示，4種處理總計有4 949個OTU，共有OTU為2 258個。牛糞有機肥處理共有3 348個OTU，秸稈處理共有3 620個，生物炭處理共有3 406個，CK共有3 342個。此外，不同有機物料添加的特有OTU個數(shù)在不同處理間由多到少依次為S、B、CK和C，即添加秸稈處理土壤具有最多的特有OTU。

2.3 不同有機物料添加后土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成

2.3.1不同有機物料添加后土壤細菌優(yōu)勢菌群變化

為研究不同有機物料添加對土壤細菌優(yōu)勢菌群落結(jié)構(gòu)的影響，對每種處理相對豐度排名前十位的菌門(屬)進行比較分析，將相對豐度位列前十名之外的其他已知物種歸類為others，未知物種歸類為unclassified。由圖2(a)可知，4種處理土壤中優(yōu)勢菌門相同，但相對豐度存在差異。排名前十位的優(yōu)勢菌門有：變形菌門(Proteobacteria，23.33%～29.23%)、酸桿菌門(Acidobacteria，19.8%～24.2%)、浮霉菌門(Planctomycetes，13.62%～25.07%)、綠彎菌門(Chloroflexi，7.55%～10.27%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes，5.96%～7.22%)、放線菌門(Actinobacteria，4.79%～5.93)、擬桿菌門(Bacteroidetes，3%～4.25%)、疣微菌門(Verrucomicrobia，1.6%～2.05%)、棒狀桿菌門(Rokubacteria，0.89%～1.27%)及相對豐度較小的硝化螺旋菌門(Nitrospirae，0.46%～0.55%)。不同處理土壤中相對豐度排名前3位的優(yōu)勢菌門排序存在明顯差異，牛糞有機肥處理和對照處理排序一致，均為變形菌門、酸桿菌門、浮霉菌門；生物炭處理為浮霉菌門、變形菌門、酸桿菌門；而秸稈處理為變形菌門、浮霉菌門、酸桿菌門。其他優(yōu)勢菌門相對豐度在4個處理中的排序一致。

CK為對照，C為牛糞有機肥處理，B為生物炭處理，S為秸稈處理。

為進一步了解不同有機物料添加的土壤細菌組成差異，基于門和屬水平選擇單因素方差分析來檢驗不同有機物料添加的細菌豐度差異。由圖2(c)可知，4種處理中生物炭處理變形菌門相對豐度(23.33%)最低，與對照處理(29.23%)相比顯著降低5.90個百分點(P<0.05)；添加生物炭和秸稈的土壤中浮霉菌門相對豐度較高，分別為25.07%和22.86%，顯著高于牛糞有機肥處理(13.82%)和CK處理(13.62%)。牛糞有機肥處理綠彎菌門相對豐度最高，達10.27%，并顯著高于秸稈處理(7.55%)。不同處理其他優(yōu)勢菌門相對豐度雖有一定差異，但均未達顯著水平。

由圖2(b)可知，4種處理樣地土壤中高相對豐度菌屬包括鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、不可培養(yǎng)細菌RB41 (uncultured bacterium RB41)、溶桿菌屬(Lysobacter)、小梨形菌屬(Pirellula)、Subgroup_10、Pir4_lineage、SH-PL14、芽小梨形菌屬(Blastopirellula)、浮霉菌門某屬(SM1A02)、MND1等。從屬水平來看〔圖2(d)〕，生物炭處理鞘氨醇單胞菌屬相對豐度(2.57%)顯著低于其他處理；秸稈處理不可培養(yǎng)細菌RB41相對豐度(2.03%)顯著低于其他3種處理；牛糞有機肥處理和對照處理土壤中小梨形菌屬(Pirellula)相對豐度顯著低于生物炭處理(2.11%)，同時這兩種處理SH-PL14相對豐度顯著低于生物炭處理和秸稈處理。4種處理相對豐度均低于1% 的菌屬有芽小梨形菌屬、浮霉菌門某屬(SM1A02)、MND1，其中，添加生物炭土壤中芽小梨形菌屬和添加秸稈土壤中浮霉菌門某屬(SM1A02)相對豐度顯著高于牛糞有機肥處理和對照處理。

2.3.2不同有機物料添加后土壤細菌組間差異物種分析

對不同有機物料添加后鹽堿土土壤細菌優(yōu)勢菌群落的組成進行分析發(fā)現(xiàn)，部分細菌相對豐度有較大差異，但細菌優(yōu)勢菌門(屬)組成比較相似。鹽堿土壤中添加不同有機物料后，細菌相對豐度發(fā)生變化，但不同處理間細菌種類組成是否一致尚不確定，故采用LEfSe(LDA EffectSize)分析方法研究土壤細菌在不同有機物料添加后的特征物種。此次試驗檢測出的所有物種LEfSe分析結(jié)果見圖3。為簡化圖形，圖3僅展示差異物種(LDA得分>2.0，P<0.05)。

圖3 不同處理土壤細菌LEfSe分析

進化分支圖3(a)中，由內(nèi)到外的圓形代表由界至種的分類級別，在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該分類水平下的一個物種，其直徑大小與相對豐度呈正比。由圖3(a)可知，與其他3種處理相比，生物炭處理土壤中未出現(xiàn)差異物種。秸稈處理具有顯著區(qū)分于其他處理的差異物種種類最多，這也對應(yīng)了OUT Venn圖分析中秸稈處理土壤具有最多的特有OTU的結(jié)果，這些物種主要包括變形菌門α變形菌綱(Caulobacterales、Altererythrobacter、Hyphomonadaceae)、δ變形菌綱粘球菌目(Sorangiineae_bacterium_NIC37A_2、Haliangium、0319_6G20、Haliangiaceae、BIrii41)和γ變形菌綱(R7C24、CCD24)等；牛糞有機肥處理土壤中差異物種為變形菌門α變形菌綱(Rhizobiales、Tagaea_marina)和厚壁菌門鹽芽孢桿菌屬(Halobacillus)；對照處理差異物種為芽單胞菌門某綱(AKAU4049)。由圖3(b)可知，牛糞有機肥處理得分最高的物種為變形菌門根瘤菌目(Rhizobiales)，對照處理得分最高的為芽單胞菌門某綱(AKAU4049)，秸稈處理得分最高的為粘球菌目(Myxococcales)。這些差異物種的產(chǎn)生，可能是細菌對不同有機物料添加后土壤理化性質(zhì)變化的響應(yīng)結(jié)果。因此，不同處理間差異物種也在一定程度上說明不同有機物料對濱海鹽堿土的改良效果存在差異。

2.4 有機物料添加對濱海鹽堿土土壤細菌多樣性的影響

2.4.1有機物料添加對濱海鹽堿土土壤細菌α多樣性的影響

α多樣性指生境或系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，多采用物種豐富度(即種類情況)和均勻度(即分布情況)來衡量。常用的微生物群落α多樣性指標(biāo)有表征物種豐富度的Ace和Chao指數(shù)，表征群落多樣性的Simpson指數(shù)，以及說明測序結(jié)果是否合理的覆蓋率Coverage指數(shù)(表2)。此次測序的Coverage指數(shù)值均在96%以上，表明測序基本飽和，已覆蓋大部分物種。Simpson指數(shù)綜合考慮了物種豐富度和均勻度，在不同處理間的排序由大到小依次為B、S、C和CK。群落多樣性最高的為生物炭處理，最低的為對照處理，表明有機物料添加能使土壤細菌群落多樣性提高，改善鹽堿地土壤細菌群落組成，提高物種豐度并使物種分布更均勻。不同處理Ace和Chao指數(shù)由大到小依次均為C、S、B和CK，牛糞有機肥處理2種指數(shù)最高，表明添加牛糞有機肥的土壤中細菌豐度最大，其次為秸稈處理和生物炭處理。這可能是由于牛糞有機肥中豐富的養(yǎng)分和有機碳為微生物生長提供了良好條件，改變了鹽堿地土壤養(yǎng)分不足的狀況，導(dǎo)致豐度提高。

表2 不同處理土壤細菌群落α多樣性分析Table 2 Analysis of α diversity of soil bacterial communities in different treatments

2.4.2有機物料添加對濱海鹽堿土土壤細菌β多樣性的影響

β多樣性重在關(guān)注樣本間多樣性，用來反映不同處理間是否具有顯著的微生物群落差異。采用基于Bary-Curtis距離的主坐標(biāo)分析(principal co-ordinate analysis，PCoA)方法作圖比較群落差異(圖4)。

圖4 不同處理土壤細菌群落主坐標(biāo)分析(門水平)

如圖4所示，PCoA1軸和PCoA2軸總計解釋了群落結(jié)構(gòu)總變異的87.91%。在PCoA1軸上，不同處理樣本分布較為分散，牛糞有機肥處理和對照處理樣本主要分布在正半軸，而秸稈處理和生物炭處理樣本主要分布在負半軸；在PCoA2軸上，秸稈處理和CK處理樣本正負軸均有分布，生物炭處理和牛糞有機肥處理樣本則全部落在負半軸。由圖4還可知，牛糞有機肥處理樣本分布最為集中，顯示出較好的重復(fù)性。不同處理間群落分布顯示出一定差異，通過Adonis檢驗(R2=0.60，P<0.05)發(fā)現(xiàn)，組間距離大于組內(nèi)，因此，差異主要來自不同分組處理，即不同處理間細菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著差異。

2.5 土壤細菌群落與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性分析

外源有機物料添加對濱海鹽堿土基本理化性質(zhì)產(chǎn)生一定影響(表1)，而土壤中微生物群落分布又與土壤環(huán)境條件密切相關(guān)[15]。上述分析結(jié)果顯示，添加不同有機物料土壤中微生物群落存在明顯差異，因此，對土壤基本理化性質(zhì)指標(biāo)(土壤環(huán)境因子)與細菌群落的相關(guān)關(guān)系進行分析。首先，基于消除趨勢對應(yīng)分析(detrended correspondence analysis，DCA)選擇冗余分析(redundancy analysis，RDA)和典范對應(yīng)分析(canonical correspondence analysis, CCA)模型，由于DCA結(jié)果中l(wèi)engths of gradient的第1軸大小為0.625<3，因而更適合采用RDA。RDA結(jié)果(圖5)表明，在屬水平上RDA1軸和RDA2軸分別解釋了細菌群落變異的64.33%和19.98%，所選土壤理化指標(biāo)已能較好地解釋細菌群落變化。RDA1軸主要由pH(R2=0.366)、TOC(R2=0.475)和TN(R2=0.09)貢獻，RDA2軸主要由EC(R2=0.357)貢獻，其中，TOC對細菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著(P<0.05)。

環(huán)境因子箭頭長度表示對物種分布影響大小，環(huán)境因子箭頭線與坐標(biāo)軸夾角表示對該軸的貢獻大?。粯悠吩诩^上的投影到原點的距離表示該組樣品中環(huán)境因子豐度。

通過方差分解分析(variance partitioning analysis，VPA)，對不同環(huán)境因子的差異貢獻度量化，結(jié)果表明pH與TOC是影響群落結(jié)構(gòu)的主要因素，分別解釋了9.32%和8.97%的物種分布總變異，EC和AK分別解釋了5.53%和5.00%的總變異。

為進一步研究不同細菌對土壤環(huán)境因子的響應(yīng)情況，采用相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖展示環(huán)境因子與物種的Pearson相關(guān)性(圖6)。由圖6可知，EC是聯(lián)通性最大的環(huán)境因子，表明EC的變化影響更多的物種，pH和TOC次之， TN、AP和AK連通性較低，但AK與高豐度的優(yōu)勢菌屬小梨形菌屬(Pirellula)呈顯著正相關(guān)，這與RDA分析結(jié)果基本吻合。與EC呈顯著負相關(guān)的細菌包括變形菌門的紅螺菌目兩屬(Dongia、Reyranella)、粘細菌目兩屬(Haliangium、Sorangiineae_bacterium_NIC37A_2)、交替赤桿菌屬(Altererythrobacter)、生絲單胞菌科某屬(Hirschia)、γ變形菌綱某屬(Acidibacter)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)和酸桿菌門一屬(Bryobacter)， 呈顯著正相關(guān)的只有紅螺菌目某屬(Azoarcus)?？梢园l(fā)現(xiàn)，與EC呈顯著相關(guān)的物種以變形菌門為主。優(yōu)勢菌屬中溶桿菌屬(Lysobacter)與TOC呈顯著負相關(guān)，小梨形菌屬與AK呈顯著正相關(guān)，Pir4_lineage、SH-PL14與pH呈顯著正相關(guān)。

圖6 土壤細菌與土壤理化性質(zhì)Pearson相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖(屬水平)

由上述分析可知，受EC影響的菌種和秸稈處理組的差異菌群高度重合(圖3)，秸稈處理LDA得分最高的粘球菌目(Myxococcales)兩屬(Haliangium、Sorangiineae_bacterium_NIC37A_2)、酸桿菌門一屬(Bryobacter)、交替赤桿菌屬(Altererythrobacter)等與EC呈顯著負相關(guān)，這意味著EC可能是產(chǎn)生差異菌群的重要因素。

同時，優(yōu)勢菌與土壤理化因子的顯著相關(guān)性也解釋了不同處理間的豐度差異，如溶桿菌屬與TOC呈顯著負相關(guān)，因此，有機物料添加處理溶桿菌屬相對豐度均低于對照(圖2)，與pH呈顯著正相關(guān)的Pir4_lineage、SH-PL14在秸稈處理和生物炭處理中的相對豐度均高于牛糞有機肥處理和對照(圖2)，原因在于添加秸稈和生物炭的土壤pH高于牛糞有機肥處理和對照(表1)。

3 討論

3.1 不同有機物料添加對土壤細菌群落的影響

不同有機物料添加后土壤中相對豐度位居前3位的菌門為變形菌門、酸桿菌門和浮霉菌門，除生物炭處理外，其他處理相對豐度最大的菌門都是變形菌門。以往研究認(rèn)為在濱海鹽堿土中，細菌豐度占據(jù)較大優(yōu)勢，而變形菌門常成為優(yōu)勢菌門[16-17]，其數(shù)量、種類眾多，包括多種代謝類型，參與多種土壤生物地球化學(xué)循環(huán)過程[18]。筆者試驗中，牛糞有機肥的施用增加了酸桿菌門相對豐度，酸桿菌門在土壤中大量存在，相對豐度甚至可達50%以上[19]。目前，發(fā)現(xiàn)該菌門微生物具有降解動植物殘體[20]、參與鐵循環(huán)和單碳化合物代謝等生態(tài)功能[21-22]。有研究發(fā)現(xiàn)酸桿菌門與土壤pH呈顯著負相關(guān)[23]，而牛糞有機肥處理土壤pH比其他處理顯著降低，筆者研究結(jié)果與之一致。浮霉菌門是生物炭處理組相對豐度最大的菌門，生物炭和秸稈的施用顯著增加浮霉菌門相對豐度。浮霉菌門微生物多數(shù)屬于專性好氧菌，并與土壤中反硝化過程有關(guān)[24]。牛糞有機肥處理土壤綠彎菌門相對豐度最高，該細菌門中大多數(shù)微生物可以將糖和多糖發(fā)酵成有機酸和氫[25]，加快土壤有機物的分解。

不同添加物土壤中優(yōu)勢菌屬以鞘氨醇單胞菌屬、溶桿菌屬等變形菌門和小梨形菌屬、芽小梨形菌屬、SM1A02等浮霉菌門的菌屬為主。鞘氨醇單胞菌屬是能夠分解大分子化合物，如芳香族化合物，降解土壤有毒物質(zhì)并參與氮循環(huán)的一類異養(yǎng)、好氧的革蘭陰性菌。秸稈處理土壤中鞘氨醇單胞菌屬相對豐度最高，這與秸稈中大分子物質(zhì)的分解和有機氮的礦化密不可分。在LEfSe分析中，粘球菌目是秸稈處理LDA得分最高的物種。有研究表明粘細菌與纖維素分解相關(guān)，其中，堆囊菌屬(Sorangium)、多囊菌屬(Polyangium)等屬于噬纖維素型粘細菌[26]。在物種與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性分析中，粘球菌目兩屬(Haliangium、Sorangiineae_bacterium_NIC37A_2)、酸桿菌門一屬(Bryobacter)、交替赤桿菌屬(Altererythrobacter)等與EC呈顯著負相關(guān)，這解釋了秸稈處理粘球菌目為何高于其他處理。鹽芽孢桿菌屬(Halobacillus)是一類中等嗜鹽、嚴(yán)格好氧的化能異養(yǎng)菌，對土壤鹽分條件有一定要求[27]，其在牛糞有機肥處理中分布最多，這可能是由于相比其他處理牛糞有機肥處理土壤鹽分降低到一個最適條件。

3.2 土壤理化因子對細菌群落的影響

通過RDA分析發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致不同處理間群落差異的主要因素有pH、TOC、EC和AK，其中，通過方差分解分析得到pH、TOC和EC對群落總變異的解釋度更高，同時在網(wǎng)絡(luò)圖中的連通性更大，影響了更多的物種，可以認(rèn)為pH、TOC和EC是導(dǎo)致群落差異的主要因素。鹽堿地土壤環(huán)境惡劣，微生物會受到多種條件制約，包括pH、鹽度、碳源、氧氣等[15-16]。 pH可以直接對土壤中微生物進行選擇，強大的生境壓力將會保留那些更加適應(yīng)此pH的物種[28]，在鹽堿土土壤微生物受到的脅迫中，pH和鹽分常常同時出現(xiàn)[29]。有研究顯示，在鹽堿土中，鹽度是微生物群落變化的主要影響因素[30]；但也有研究表明微生物群落變化與含水量、營養(yǎng)物質(zhì)和pH高度相關(guān)，鹽度并不是主要因素[31]。這些結(jié)果的差異可能與分析尺度有關(guān)，在鹽度梯度變化大的研究中，鹽度的影響往往更大，而在不同分類水平上的研究也會得出有差異的結(jié)果。WONG等[32]向鹽堿土中加入粉碎的菅草，顯著提高了土壤的累積呼吸率和土壤微生物生物量，結(jié)果顯示這是由于有機碳的輸入和土壤鹽分的降低，筆者試驗中秸稈處理土壤鹽度顯著降低是該處理產(chǎn)生較多差異物種的重要原因。SINGH等[33]利用有機肥和黃鐵礦改良鹽堿土，發(fā)現(xiàn)處理組細菌數(shù)量最大，原因在于試驗處理降低了土壤pH和鹽度，筆者試驗中有關(guān)牛糞有機肥處理的結(jié)果與之相似：牛糞有機肥的施用可以降低土壤pH，增加土壤有機碳含量，提高細菌豐度。施用生物炭對土壤影響的研究結(jié)果有一定差異，有研究[12]肯定了生物炭的改良作用，即能夠改善土壤性質(zhì)，提高微生物豐度，但也有研究[34]表明生物炭會提高土壤pH和EC，不同的結(jié)果差異可能與生物炭種類、施用量及土壤類型有關(guān)[11,34]。筆者試驗中，與對照處理相比，施用生物炭雖會提高土壤pH和EC，但添加生物炭的土壤細菌群落多樣性和細菌豐度均高于對照處理。除去土壤條件本身的限制作用外，也有研究認(rèn)為是鹽度導(dǎo)致的植物生長的減少間接影響了微生物的分布差異[35]。筆者試驗中添加牛糞有機肥的土壤中根瘤菌相對豐度與其他處理相比有顯著差異，這可能表明由于牛糞有機肥對鹽堿土的改良效果，導(dǎo)致植物生長，進而影響土壤微生物的分布。但在試驗采樣過程中，并未觀察到不同處理樣地間植物生長具有明顯差異，有機物料添加、植物生長、土壤鹽度和微生物分布之間復(fù)雜的相互作用仍需進一步研究。

結(jié)合現(xiàn)有研究分析，認(rèn)為有機物料添加對土壤微生物的作用原理主要在于兩個方面：(1)增加了土壤碳氮的輸入，為微生物的生長繁殖提供所需養(yǎng)分；(2)改善土壤結(jié)構(gòu)，減少制約因素，如pH、鹽度等的限制，改善微生物活動微域環(huán)境[8-9, 11-13]。有機物料的施加會改變土壤環(huán)境，環(huán)境的變化影響著微生物群落，而微生物群落的變化又會進一步影響土壤養(yǎng)分的分解轉(zhuǎn)移，這是一個兩者互相影響、互相作用的漫長過程。

4 結(jié)論

(1)與對照相比，所有處理均提高土壤TOC、TN、AP和AK含量，其中，生物炭處理TOC含量提高顯著，秸稈與牛糞有機肥處理TN含量增加顯著，生物炭與牛糞有機肥處理AP、AK含量提高顯著；牛糞有機肥的施用顯著降低土壤pH，秸稈處理顯著降低土壤鹽度，秸稈和生物炭處理土壤pH略微升高。

(2)不同有機物料添加后土壤中細菌在門屬水平上的優(yōu)勢菌未發(fā)生變化，但優(yōu)勢菌相對豐度在不同處理間存在明顯差異。牛糞有機肥處理土壤細菌豐度最大，生物炭處理土壤群落多樣性最高，秸稈處理土壤差異物種最多。

(3)土壤細菌群落分布主要受土壤pH、總有機碳含量和EC的影響。