六六六轉(zhuǎn)化的同位素分餾效應(yīng)及其環(huán)境應(yīng)用研究進(jìn)展

邵鵬飛，王 曦，張世敏，曾 軍，吳宇澄①，林先貴

〔1.中國(guó)科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所)，江蘇 南京 210008；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450046；3.土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所)，江蘇 南京 210008〕

同位素分餾(isotopic fractionation)是指在一個(gè)系統(tǒng)中，某元素的各種同位素以不同的比值分配到各種物質(zhì)或物相中的作用[1]，根據(jù)分餾的性質(zhì)和原因可分為熱力學(xué)同位素分餾和動(dòng)力學(xué)同位素分餾兩大類(lèi)型，該文主要關(guān)注動(dòng)力學(xué)同位素效應(yīng)(kinetic isotope effect, KIE)。動(dòng)力學(xué)同位素分餾的原因在于同一元素的同位素原子或分子由于相對(duì)質(zhì)量不同，導(dǎo)致其零點(diǎn)勢(shì)能和化學(xué)鍵鍵能的差異，進(jìn)而引起物理、化學(xué)性質(zhì)上的微小差異。在化學(xué)、生物反應(yīng)中，輕、重同位素形成的化合物出現(xiàn)反應(yīng)速度或運(yùn)動(dòng)速度的快慢不一，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致重同位素在剩余相中富集[2]。同位素分餾效應(yīng)可應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，如用于修正14C測(cè)年中C含量，以及研究自然養(yǎng)分循環(huán)等[3]。在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域，同位素分餾是有機(jī)污染物來(lái)源解析和轉(zhuǎn)化途徑研究的重要工具[4]。

六氯環(huán)己烷(hexachlorohexane, HCH)俗稱(chēng)六六六，是一種人工合成的含氯有機(jī)化合物，主要用作殺蟲(chóng)劑[5]。HCH性質(zhì)穩(wěn)定，不易降解，可在環(huán)境中長(zhǎng)期存在，其大量使用導(dǎo)致在土壤和地下水中廣泛檢出，并通過(guò)食物鏈產(chǎn)生人體健康風(fēng)險(xiǎn)[6]。由于HCH的潛在危害，《關(guān)于持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約》(以下簡(jiǎn)稱(chēng)《斯德哥爾摩公約》)已將α、β、γ-HCH列為持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants，POPs)。據(jù)估計(jì)，全世界已傾倒400萬(wàn)到600萬(wàn)t各種HCH物質(zhì)，與《斯德哥爾摩公約》界定的所有其他持久性有機(jī)污染物總的傾倒規(guī)模相似[7]。雖然我國(guó)已禁止生產(chǎn)HCH，但由于歷史上曾大量使用，其殘留污染仍存在長(zhǎng)期影響。根據(jù)2014年《全國(guó)土壤污染調(diào)查公告》，我國(guó)土壤中HCH點(diǎn)位超標(biāo)率為0.5%[8]。

近年來(lái)，HCH的同位素分餾研究快速發(fā)展，通過(guò)與對(duì)映體分餾(enantiomer fractionation,EF)、自然衰減(natural attenuation)等技術(shù)結(jié)合，在污染物反應(yīng)機(jī)理、污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和污染場(chǎng)地修復(fù)方面取得重要進(jìn)展，集中體現(xiàn)了領(lǐng)域內(nèi)的理論進(jìn)展、技術(shù)進(jìn)步和應(yīng)用潛力。該文以典型持久性有機(jī)污染物HCH為例，通過(guò)對(duì)不同轉(zhuǎn)化途徑下HCH的同位素分餾現(xiàn)象及相關(guān)應(yīng)用進(jìn)行評(píng)述，旨在系統(tǒng)反映有機(jī)污染物同位素分餾研究的最新進(jìn)展，為環(huán)境污染控制提供新方法和新思路。

1 同位素分餾現(xiàn)象及測(cè)定

1.1 同位素分餾現(xiàn)象

同位素是指具有相同質(zhì)子數(shù)、不同中子數(shù)的同一元素的不同核素。就HCH的主要組成元素而言，自然界中氫以1H(氕，H)、2H(氘，D)和3H(氚，T)3種形式存在，其中，3H具有放射性。碳元素有12C、13C 和14C 3種同位素，其中，14C具有放射性。氯元素有35Cl和37Cl兩種穩(wěn)定同位素[9]。在有機(jī)污染物轉(zhuǎn)化中，由于同位素分餾效應(yīng)，產(chǎn)生了同位素比值的改變[10]。因此，不同時(shí)間段同位素比值的變化可作為污染物轉(zhuǎn)化的證據(jù)，并推斷轉(zhuǎn)化反應(yīng)的機(jī)制，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)程，將其應(yīng)用于實(shí)際環(huán)境修復(fù)。

1.2 同位素分餾效應(yīng)的表征與瑞利方程

同位素比值指重同位素豐度與輕同位素豐度的比值，用R表示。由于重同位素豐度一般很小，導(dǎo)致R值很小，不利于比較，一般用δ標(biāo)度表示同位素比率。δ值指樣品的同位素比值相對(duì)于國(guó)際參考物質(zhì)同位素比值的千分差，碳元素同位素比值的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是維也納美洲擬箭石(VPDB)[11]。13C的δ值(‰)計(jì)算公式如式(1)所示，其中，Rsample和Rstandard分別為樣品及國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)中元素的同位素相對(duì)豐度比[12]：

δ(13C)=(Rsample-Rstandard)/Rstandard×1 000。

(1)

瑞利方程(Rayleigh equation)將反應(yīng)進(jìn)程中污染物濃度變化與同位素比值聯(lián)系起來(lái)，是進(jìn)行同位素分餾定性定量分析計(jì)算的主要方法。碳同位素分餾的瑞利方程如式(2)所示，其中，δt(13C)、δ0(13C)是時(shí)間為t、0時(shí)的同位素比值，ε為同位素富集因子，Ct、C0為t、0時(shí)的物質(zhì)濃度[13]。由瑞利方程可推算生物降解百分比B(%)，用其對(duì)轉(zhuǎn)化程度進(jìn)行評(píng)價(jià)，如式(3)所示。

ln {[δt(13C)+1]/[δ0(13C)+1]}=ε·ln (Ct/C0)，

(2)

B= {[δt(13C)+1]/[δ0(13C)+1]}1/ε。

(3)

同位素富集因子ε是表征同位素分餾的重要參數(shù)，即隨著污染物濃度的下降，在剩余相中重同位素富集的速率。以式(2)中 ln {[δt(13C)+1]/[δ0(13C)+1]}為縱坐標(biāo),以ln (Ct/C0)為橫坐標(biāo),在置信區(qū)間內(nèi)作圖，所得直線(xiàn)斜率即為反應(yīng)過(guò)程的同位素富集因子(圖1[14])。一般在反應(yīng)的決速步反應(yīng)速度較慢，需要較高的活化能，而在非決速步反應(yīng)速度快，需要的活化能低。同位素的富集發(fā)生在反應(yīng)決速步，同位素富集因子是衡量同位素變化的指標(biāo)，包含了反應(yīng)化學(xué)鍵斷裂的信息，因此，同位素富集因子對(duì)分析反應(yīng)機(jī)理和反應(yīng)路徑有重要作用，可根據(jù)ε之間的差異是否顯著來(lái)推測(cè)反應(yīng)機(jī)理是否相同。生物或化學(xué)反應(yīng)與動(dòng)力學(xué)同位素分餾密切相關(guān)，即發(fā)生反應(yīng)必有動(dòng)力學(xué)同位素分餾，有動(dòng)力學(xué)同位素分餾必定發(fā)生反應(yīng)，同位素分餾越明顯，反應(yīng)進(jìn)行得越快，所以可以通過(guò)ε這個(gè)反映同位素分餾的參數(shù)來(lái)判斷反應(yīng)是否進(jìn)行以及進(jìn)行的快慢。

圖1 利用同位素富集因子量化評(píng)估同位素分餾

實(shí)際測(cè)定的同位素富集效應(yīng)稱(chēng)為表觀(guān)動(dòng)力學(xué)同位素效應(yīng)(apparent kinetic isotope effect，AKIE)。AKIE是共價(jià)鍵斷裂和反應(yīng)發(fā)生前各必要步驟(如酶與底物的結(jié)合、分子傳輸?shù)?同位素選擇效應(yīng)的總和，而不同于反應(yīng)的理論KIE值。

1.3 單體同位素分析(CSIA)技術(shù)

單體同位素分析(compound-specific isotope analysis，CSIA)技術(shù)最初應(yīng)用于地球化學(xué)領(lǐng)域，現(xiàn)已成為地質(zhì)微生物學(xué)、食品科學(xué)、考古學(xué)和環(huán)境科學(xué)等多個(gè)學(xué)科分支中最強(qiáng)大的同位素分析工具之一。CSIA可對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中的化合物進(jìn)行測(cè)定，故能在分子層面上為各種應(yīng)用提供更為詳盡的信息和更加廣闊的視角。CSIA通過(guò)測(cè)定特定化合物的同位素比值來(lái)推斷環(huán)境中污染物的轉(zhuǎn)化，已經(jīng)成為表征環(huán)境中有機(jī)污染物降解的有效工具，主要應(yīng)用于污染物來(lái)源判別、降解機(jī)制研究和判斷場(chǎng)地是否存在自然衰減等[15]。CSIA使用的儀器設(shè)備主要有氣相色譜儀、同位素比值質(zhì)譜儀等(GC-IRMS)。分析中，先利用氣相色譜儀分離目標(biāo)化合物，通過(guò)反應(yīng)爐將化合物轉(zhuǎn)化為易檢測(cè)的小分子，如H2、CO2等，再與同位素質(zhì)譜聯(lián)用分析單一化合物的同位素組成[16]。對(duì)同一反應(yīng)過(guò)程不同時(shí)間樣品的同位素比值進(jìn)行比較，即可確定是否發(fā)生同位素分餾現(xiàn)象。在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域，CSIA已被用于分析多種污染物的轉(zhuǎn)化，包括有機(jī)農(nóng)藥、除草劑、增塑劑等[10]。

2 HCH的轉(zhuǎn)化

2.1 HCH的性質(zhì)

HCH共有8種異構(gòu)體，常見(jiàn)的異構(gòu)體有α、β、γ和δ-HCH[17]，其中，γ-HCH(lindane,中文名林丹)的殺蟲(chóng)效果最好[18]，而α-HCH為手性分子，具有一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體。4種HCH的性質(zhì)見(jiàn)表1。HCH異構(gòu)體的形成是由于氯原子在六元環(huán)的位置不同導(dǎo)致，包括處在軸向的(a鍵)氯原子和處在水平方向的(e鍵)氯原子。水平方向氯原子比軸向氯原子更穩(wěn)定，水平方向氯原子越多，HCH異構(gòu)體越難降解[5]。

表1 4種HCH異構(gòu)體的性質(zhì)Table 1 Properties of four HCH isomers

2.2 HCH的轉(zhuǎn)化途徑

HCH能以多種方式降解，如直接光解、間接光解(UV/H2O2)、堿水解、電化學(xué)還原、零價(jià)鐵還原和微生物降解等[19]，降解機(jī)制主要包括抽氫反應(yīng)、脫氯反應(yīng)、脫氯化氫反應(yīng)和二氯消除反應(yīng)。直接光解是在紫外線(xiàn)照射下六元環(huán)脫氯[20]，間接光解是由UV/H2O2產(chǎn)生的強(qiáng)氧化性羥基自由基，以抽氫反應(yīng)機(jī)制形成自由基[21]；堿性環(huán)境下的水解(堿水解)速率遠(yuǎn)大于酸性和中性條件下的水解，以脫氯化氫反應(yīng)機(jī)制脫去一個(gè)HCl形成雙鍵[22]；電化學(xué)還原和零價(jià)鐵還原都是向反應(yīng)體系中添加電子[23]，電化學(xué)還原通過(guò)脫氯機(jī)制，而零價(jià)鐵還原以二氯消除的機(jī)制脫去兩個(gè)氯原子形成雙鍵。HCH的化學(xué)轉(zhuǎn)化途徑如圖2[24]所示。

圖2 HCH的化學(xué)轉(zhuǎn)化途徑[24]

根據(jù)反應(yīng)體系是否有氧可將微生物降解分為厭氧降解和好氧降解[25]。厭氧降解大多發(fā)生在沉積物和地下水等無(wú)氧環(huán)境，目前已觀(guān)察到α、β、γ和δ-HCH的厭氧降解，且α和γ-HCH的降解速率快于δ和β-HCH。如圖3所示，HCH厭氧降解通過(guò)二氯消除反應(yīng)生成中間產(chǎn)物四氯環(huán)己烯(TCCH)和1,3-二氯環(huán)己二烯(1,3-DCDN)[26]，再進(jìn)行脫氯化氫反應(yīng)或二氯消除形成終產(chǎn)物氯苯和苯[19]。目前，還不清楚何種微生物基因或酶參與HCH厭氧降解[27]。

HCH的好氧降解過(guò)程見(jiàn)圖3。HCH經(jīng)脫氯化氫反應(yīng)形成中間產(chǎn)物五氯環(huán)己烯(PCCH) 和四氯環(huán)己二烯(TCDN)。TCDN可以進(jìn)行脫氯化氫反應(yīng)形成三氯苯(TCB)，也可進(jìn)行脫氯反應(yīng)形成三氯環(huán)己二烯醇(DNOL)，DNOL再進(jìn)行脫氯化氫反應(yīng)生成二氯苯酚(DCP)。β-HCH與其他異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化路徑不同，由于沒(méi)有軸向氯原子而不易發(fā)生脫氯化氫反應(yīng)，卻更容易發(fā)生水解脫氯反應(yīng)[28]。目前，所了解的微生物好氧降解HCH基因主要是lin基因簇[29]，其編碼的酶通過(guò)多步反應(yīng)[30]，將HCH轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物進(jìn)入三羧酸循環(huán)[31]。

圖3 HCH的微生物好氧和厭氧降解途徑

3 HCH轉(zhuǎn)化的同位素分餾效應(yīng)

3.1 碳同位素分餾

HCH的不同化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)存在明顯的碳同位素分餾差異。已知較重元素共價(jià)鍵的斷裂具有更大的同位素效應(yīng)，即HCH分子中C—Cl鍵斷裂比C—H鍵斷裂引起更強(qiáng)的同位素分餾。實(shí)驗(yàn)測(cè)定顯示，α-HCH間接光解抽氫反應(yīng)導(dǎo)致的C—H鍵斷裂，同位素分餾因子εc為(-1.9±0.2)‰。直接光解和電化學(xué)還原引發(fā)脫氯反應(yīng)，C—Cl鍵斷裂的εc分別為(-2.8±0.2)‰和(-3.8±0.4)‰。零價(jià)鐵引起的二氯消除反應(yīng)中，兩個(gè)C—Cl 鍵發(fā)生斷裂，εc為(-4.9±0.1)‰ 。堿水解脫氯化氫反應(yīng)中，同時(shí)發(fā)生C—H和C—Cl 鍵的斷裂，產(chǎn)生的同位素分餾效應(yīng)最大〔εc=(-7.6±0.4)‰〕[24]。

利用HCH的同位素分餾還可以判斷生物降解的機(jī)制。微生物好氧降解γ-HCH的ε值低于厭氧生物降解的ε值，印證好氧和厭氧降解過(guò)程有不同的酶催化過(guò)程[29]。而對(duì)兩株降解細(xì)菌SphingobiumindicumB90A和S.japonicumUT26的研究表明，它們對(duì)γ-HCH的碳同位素富集因子分別為(-1.5±0.1)‰ 和(-1.7±0.2)‰，因無(wú)顯著差異而推測(cè)兩種降解菌有相似的γ-HCH降解機(jī)理[32]。

利用碳元素的同位素富集因子，可以推斷環(huán)境中HCH的降解途徑。對(duì)某污染土壤中4種主要HCH異構(gòu)體的濃度和同位素比值進(jìn)行測(cè)定，得到α、β、γ和δ-HCH的同位素富集因子分別為-2.0‰、-1.5‰、-3.2‰和-1.4‰。因此，可以推測(cè)β和δ-HCH可能有相同的降解路徑，而α和γ異構(gòu)體以不同機(jī)制降解。文獻(xiàn)報(bào)道中α-HCH有氧降解ε值的范圍為-1.7‰～-1.0‰，無(wú)氧降解ε值為-3.7‰。γ-HCH有氧降解ε值范圍為-1.7‰～-1.5‰，無(wú)氧降解ε值范圍為-3.9‰～-3.4‰。由于α和γ-HCH的ε值低于好氧降解而高于厭氧降解，提示可能存在有氧和無(wú)氧降解協(xié)同作用過(guò)程。這些認(rèn)識(shí)有助于對(duì)污染土壤中HCH的原位生物降解進(jìn)行更科學(xué)的評(píng)估[33]。

3.2 雙元素同位素分析

除碳元素外，還可以用氯、氫等元素的同位素特征來(lái)表征HCH的轉(zhuǎn)化。在同位素分析研究中，以碳元素為研究對(duì)象較為常見(jiàn)，氯同位素因分析過(guò)程中高溫將有機(jī)氯還原為氯化氫氣體，對(duì)探測(cè)器具有腐蝕性，而氫同位素2H的自然豐度很低，因此，氯和氫同位素比值的測(cè)定更為復(fù)雜。最近，雙進(jìn)樣(DI-IRMS)離線(xiàn)轉(zhuǎn)換法優(yōu)化了氯同位素分析方法，為HCH提供了準(zhǔn)確可重復(fù)的氯同位素比值數(shù)據(jù)，同時(shí)也建立了氫同位素的分析方法，采用一種基于鉻的連續(xù)流動(dòng)轉(zhuǎn)換方法測(cè)定了HCH的氫同位素比值[34]。雙元素同位素分析能更好地表征與環(huán)境中有機(jī)污染物的來(lái)源、沉降、降解過(guò)程和化學(xué)鍵斷裂有關(guān)的轉(zhuǎn)化路徑，得到的同位素分餾數(shù)據(jù)可提供更詳細(xì)準(zhǔn)確的過(guò)渡態(tài)化合鍵斷裂信息，避免單同位素研究的局限性，減少實(shí)驗(yàn)誤差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更可信[35]。

雙元素同位素分餾以Λ值來(lái)表征。如圖4所示，Δ(13C)和Δ(37Cl)為某時(shí)間點(diǎn)碳、氯同位素比值與初始碳、氯同位素比值的差值，將Λ定義為轉(zhuǎn)化過(guò)程中兩種元素同位素分餾的回歸線(xiàn)的斜率。Λ值反映了兩種元素同位素分餾的相關(guān)性，可用于區(qū)分復(fù)雜系統(tǒng)中的不同轉(zhuǎn)化機(jī)制。

圖4 利用Λ值對(duì)雙元素同位素分餾進(jìn)行表征的結(jié)果

碳、氯雙元素同位素分析能更好地表征碳氯鍵斷裂的轉(zhuǎn)化機(jī)理。在用碳、氯雙元素同位素分析表征污染地下水HCH厭氧轉(zhuǎn)化的研究中，測(cè)定了α、β、γ、δ-HCH 4種異構(gòu)體在二氯消除過(guò)程中的濃度變化和碳、氯同位素比值，用于計(jì)算同位素富集因子(ε)和表觀(guān)動(dòng)力學(xué)同位素效應(yīng)(AKIE，EAKI)。以εC/εCl和EAKI,C/EAKI,Cl來(lái)表征HCH異構(gòu)體C—Cl鍵的斷裂，分析兩個(gè)碳氯鍵是同時(shí)斷裂還是分步斷裂以及斷裂鍵的方向(水平或軸向)。研究結(jié)果表明，α、β、γ-HCH有相似的εC/εCl與EAKI,C/EAKI,Cl，由于β-HCH所有氯原子都在水平方向，推測(cè)β-HCH的氯原子在二氯消除過(guò)程中發(fā)生旋轉(zhuǎn)，從水平方向轉(zhuǎn)變?yōu)檩S向，這一過(guò)程可能由酶催化。δ-HCH的εC/εCl和EAKI,C/EAKI,Cl與其他異構(gòu)體不同，說(shuō)明δ-HCH碳氯鍵斷裂與其他異構(gòu)體不同，可能斷裂一個(gè)軸向碳氯鍵和一個(gè)水平方向碳氯鍵[36]。

因?yàn)?H和1H之間的相對(duì)原子質(zhì)量差較大，氫同位素分餾通常比其他元素更明顯。大多數(shù)樣品δ(2H)值范圍為-102‰～-52‰，在精度小于或等于±5‰情況下，氫同位素比值可以作為確認(rèn)HCH來(lái)源的證據(jù)[37]。碳、氫雙元素同位素分析已經(jīng)被用于推斷微生物降解酶的催化機(jī)理。HCH有氧降解是由lin基因編碼的酶催化的，包括LinA和LinB等，分別催化不同反應(yīng)。不同降解微生物的LinA可分為L(zhǎng)inA1和LinA2[38]，目前其催化機(jī)制仍不清楚。采用碳、氫雙元素同位素分析方法來(lái)分析降解酶LinA2和LinB的催化機(jī)制，測(cè)定的LinA2催化反應(yīng)13C-AKIE和2H-AKIE分別為1.029±0.001和6.7±2.9，而LinB催化反應(yīng)的13C-AKIE和2H-AKIE分別為1.073±0.006和1.41±0.04。LinB碳同位素分餾效應(yīng)大于LinA2，氫同位素分餾效應(yīng)小于LinA2。推測(cè)催化機(jī)制為L(zhǎng)inA2進(jìn)行脫氯化氫的雙分子消除反應(yīng)，LinB進(jìn)行水解脫氯的親核取代反應(yīng)。脫氯化氫反應(yīng)斷裂C—Cl鍵和C—H鍵，有顯著的C和H同位素分餾;水解脫氯斷裂C—Cl鍵，只有C同位素分餾，而H同位素分餾不顯著。LinB催化反應(yīng)氫同位素分餾效應(yīng)較小，可能是由二級(jí)同位素效應(yīng)引起的[39]。

3.3 同位素與對(duì)映體分餾

α-HCH具有手性，由(+)α-HCH和(-)α-HCH兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體組成。非生物降解過(guò)程中對(duì)映異構(gòu)體組成不變，而在生物降解途徑中，由于微生物酶蛋白空間結(jié)構(gòu)的特異性，某一種特定的對(duì)映體降解效率高，另一種對(duì)映體降解速率低，導(dǎo)致對(duì)映體組成的變化，發(fā)生對(duì)映體分餾現(xiàn)象。對(duì)映體分餾現(xiàn)象是研究手性有機(jī)污染物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵方法，也可通過(guò)是否發(fā)生對(duì)映體分餾現(xiàn)象來(lái)區(qū)分生物降解途徑和非生物降解途徑[32]。

在α-HCH有氧生物降解實(shí)驗(yàn)中，以手性色譜柱將(+)α-HCH和(-)α-HCH分離并分別測(cè)定降解前后濃度和碳同位素比值，通過(guò)瑞利方程作圖發(fā)現(xiàn)(+)α-HCH和(-)α-HCH的碳同位素富集因子有顯著差異，表明兩種α-HCH對(duì)映體以不同路徑降解?；趯?duì)映體特異性同位素分析的原位生物降解可用于更精細(xì)地評(píng)估手性污染物的轉(zhuǎn)化[40]。

采用對(duì)映體特異性穩(wěn)定同位素分析(ESIA)方法，評(píng)估從有機(jī)氯污染場(chǎng)地采集的樣品中α-HCH的去向。發(fā)現(xiàn)所有樣品較純品均有顯著的碳同位素分餾，表明都發(fā)生了轉(zhuǎn)化。3個(gè)樣品中，樣品1和3產(chǎn)生對(duì)映體選擇性分餾，表明存在生物降解；樣品2的對(duì)映體分餾與純品α-HCH接近，同時(shí)伴有顯著的同位素分餾，表明該樣品主要經(jīng)歷的是非生物轉(zhuǎn)化[40]。

4 HCH同位素分餾的環(huán)境應(yīng)用

4.1 污染物溯源

由于工藝、原料等不同，不同來(lái)源工業(yè)級(jí)HCH的δ(13C)有顯著差異，而同種工業(yè)級(jí)HCH異構(gòu)體間δ(13C)沒(méi)有顯著區(qū)別[41]。根據(jù)這一原理，如污染場(chǎng)地同位素特征指紋受環(huán)境條件影響較小，可利用CSIA方法來(lái)區(qū)分不同HCH來(lái)源。

案例1：基于同位素簽名的不同來(lái)源HCH環(huán)境法醫(yī)學(xué)調(diào)查。根據(jù)來(lái)自15個(gè)國(guó)家77個(gè)HCH樣品的碳、氫、氯同位素組成，將這些樣品分為5大類(lèi)：第1類(lèi)包括73%的樣品；第2類(lèi)包括2個(gè)來(lái)自同一公司的α和β-HCH分析標(biāo)準(zhǔn)品，可能與合成純化工藝有關(guān)；第3類(lèi)是2個(gè)來(lái)自不同公司的δ-HCH，可能來(lái)自共同的合成原料(苯)；第4類(lèi)是來(lái)自亞洲國(guó)家(中國(guó)、印度、日本)的4個(gè)分析純?chǔ)?HCH，體現(xiàn)區(qū)域來(lái)源特征；第5類(lèi)是3個(gè)從醫(yī)藥產(chǎn)品中提煉的γ-HCH樣品，可能與多步純化過(guò)程有關(guān)[37]。

4.2 HCH隨食物鏈(網(wǎng))的傳遞與富集

HCH可以從環(huán)境進(jìn)入食物鏈(網(wǎng))。為了評(píng)價(jià)HCH污染的風(fēng)險(xiǎn)，必須深入了解污染物在食物鏈(網(wǎng))中的傳輸和轉(zhuǎn)化行為。若測(cè)定單一的動(dòng)植物體內(nèi)HCH濃度，則無(wú)法判斷食物鏈(網(wǎng))中HCH的來(lái)源和轉(zhuǎn)化程度。同位素分餾證據(jù)則可以幫助確定食物網(wǎng)中HCH暴露水平及其積累趨勢(shì)。WU等[42]發(fā)現(xiàn)食物鏈中不同類(lèi)型樣品HCH的提取和凈化具有明顯的同位素效應(yīng)，為將CSIA應(yīng)用于食物鏈(網(wǎng))分析奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

案例2：采用CSIA研究食物鏈(網(wǎng))中HCH的傳輸過(guò)程。印度勒克瑙(Lucknow)的一家農(nóng)藥廠(chǎng)向環(huán)境中排放含HCH廢棄物。為了研究HCH在食物鏈中的轉(zhuǎn)移過(guò)程，在生產(chǎn)區(qū)和廢料堆場(chǎng)兩個(gè)區(qū)域分別采集土壤、河水、沉積物、植物和動(dòng)物等不同類(lèi)型樣品。對(duì)HCH含量和碳同位素比值的分析發(fā)現(xiàn)：土壤、沉積物中雖然存在明顯的HCH污染，但β-HCH的碳同位素富集程度低，即缺乏生物降解；α-HCH的δ(13C)值有所增加，提示污染物在傳輸過(guò)程中發(fā)生降解。植物體內(nèi)β-HCH的13C出現(xiàn)富集，表明存在與植物相關(guān)的降解。牛奶樣品中α-HCH、β-HCH都發(fā)生強(qiáng)烈的碳同位素分餾現(xiàn)象，參考現(xiàn)有的HCH生物降解同位素富集因子，根據(jù)瑞利方程計(jì)算后可以推斷大部分進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的HCH已被降解，提示動(dòng)物的HCH實(shí)際暴露水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于濃度測(cè)定值。這一研究表明，CSIA方法可以用于監(jiān)測(cè)食物鏈中HCH，描述食物鏈中HCH的降解特征，在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和公共衛(wèi)生研究中具有潛在的應(yīng)用前景[43]。

4.3 HCH的植物修復(fù)機(jī)制

植物吸收是HCH進(jìn)入食物網(wǎng)的第一步，而植物及相關(guān)微生物的協(xié)同降解作用是利用植物修復(fù)污染環(huán)境的基礎(chǔ)。僅根據(jù)植物不同部位的濃度還不足以確認(rèn)HCH的轉(zhuǎn)化，將同位素分餾原理用于植物轉(zhuǎn)化研究，可以揭示植物對(duì)HCH的降解機(jī)制，為持久性有機(jī)物污染土壤的植物修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

案例3：以雙元素同位素和對(duì)映體分餾表征土壤-小麥盆栽系統(tǒng)中HCH的轉(zhuǎn)化規(guī)律。LIU等[44]采用雙元素CSIA和對(duì)映體分餾方法研究HCH在水培和盆栽小麥中的生物轉(zhuǎn)化，為研究植物修復(fù)提供了新的工具[45]，也將同位素分餾和對(duì)映體分餾的應(yīng)用領(lǐng)域擴(kuò)展到植物修復(fù)。比較兩組實(shí)驗(yàn)的C、Cl同位素分餾發(fā)現(xiàn)，水培和土壤盆栽的Λ值明顯不同，說(shuō)明在水培和土壤盆栽?xún)煞N條件下HCH的轉(zhuǎn)化路徑不同。轉(zhuǎn)化過(guò)程發(fā)生對(duì)映體分餾，在不同生長(zhǎng)時(shí)期α-HCH的不同對(duì)映體優(yōu)先轉(zhuǎn)化。13C和37Cl分餾的相關(guān)性揭示了整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程可用因子Λ來(lái)表征，依此判斷碳氯鍵是否以相似的模式斷裂，為探索HCH在植物中的轉(zhuǎn)化機(jī)制提供證據(jù)。

4.4 污染場(chǎng)地監(jiān)測(cè)自然衰減的修復(fù)評(píng)價(jià)

監(jiān)測(cè)自然衰減(monitored natural attenuation，MNA)是一種利用自然發(fā)生的物理、化學(xué)和生物作用來(lái)降低場(chǎng)地內(nèi)污染物總量、濃度、毒性、移動(dòng)性的修復(fù)方式[46]。MNA的核心在于確認(rèn)場(chǎng)地內(nèi)污染物是否存在自然衰減，但由于復(fù)雜的水文地質(zhì)條件和地球化學(xué)過(guò)程，僅通過(guò)濃度測(cè)定往往無(wú)法準(zhǔn)確反映污染物的降解信息。CSIA技術(shù)可以通過(guò)測(cè)定同位素分餾，解決在實(shí)際場(chǎng)地土壤修復(fù)中污染物的降解程度與速率難以測(cè)定的問(wèn)題，已被美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局等環(huán)境管理部門(mén)采納成為MNA的關(guān)鍵評(píng)價(jià)技術(shù)之一[47]。

利用CSIA方法，逐年監(jiān)測(cè)污染物的δ(13C)，比較同位素比值變化。若發(fā)生13C富集，則說(shuō)明有自然衰減作用，隨著時(shí)間的推移，污染場(chǎng)地污染物減少，只需依靠自然衰減即可進(jìn)行場(chǎng)地修復(fù)。若未發(fā)生13C 富集，說(shuō)明自然衰減作用不明顯，需采取其他方法，如物理化學(xué)等方法來(lái)進(jìn)行場(chǎng)地修復(fù)。CSIA為污染場(chǎng)地的修復(fù)方法選擇提供依據(jù)[48]。

案例4：采用CSIA對(duì)污染場(chǎng)地含水層HCH生物降解進(jìn)行評(píng)估。某農(nóng)藥劑型加工廠(chǎng)場(chǎng)地含水層被HCH污染。為確定地下含水層是否進(jìn)行自然衰減，沿污染羽中心線(xiàn)的地下水流向設(shè)置A～F 6個(gè)采樣井，并于2008、2009和2010年連續(xù)3年采集地下水樣品。采用CSIA技術(shù)分析地下水樣品中δ-HCH濃度和碳同位素比值(圖5[49]) 。測(cè)定結(jié)果顯示，A取樣井污染物濃度隨取樣年份逐漸降低，但δ(13C)值未發(fā)生明顯變化，推測(cè)污染物濃度下降的主要原因是物理過(guò)程，而非生物降解。B取樣井δ(13C)值在2009年明顯增加，提供了生物降解的證據(jù)；但2008、2010年樣品δ(13C)值與上游的A取樣井類(lèi)似，表明這兩個(gè)年份生物降解可以忽略不計(jì)。C、D和E取樣井污染物濃度隨取樣年份下降，δ(13C)值隨取樣年份增加，提示生物降解的存在。F取樣井污染物濃度變化不明顯，但出現(xiàn)顯著的同位素分餾，也表明發(fā)生降解。該案例利用碳同位素的CSIA技術(shù)，展示了同位素分餾方法在場(chǎng)地地下含水層污染物降解趨勢(shì)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用潛力[49]。

圖5 某農(nóng)藥廠(chǎng)地下含水層中δ-HCH濃度和碳同位素比值〔δ(13C)〕[49]

5 展望

同位素分餾的理論進(jìn)展和CSIA技術(shù)的進(jìn)步可為包括HCH在內(nèi)的有機(jī)污染物的反應(yīng)機(jī)理研究和修復(fù)評(píng)價(jià)提供有力的支撐。在理論方面，計(jì)算化學(xué)[10]、量子力學(xué)/分子力學(xué)(QM/MM)方法已用于計(jì)算或預(yù)測(cè)碳、氫、氯等元素的動(dòng)力學(xué)同位素效應(yīng)，與同位素分餾的實(shí)驗(yàn)觀(guān)測(cè)相印證，可以更精確地解析HCH轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制，表征生物降解的反應(yīng)機(jī)理[50]。另一方面，對(duì)污染物轉(zhuǎn)化過(guò)程的理解可以幫助解釋同位素分餾現(xiàn)象。例如，低濃度污染物通過(guò)細(xì)胞膜時(shí)可能存在質(zhì)量傳遞限制，底物吸收不足，從而掩蓋酶促反應(yīng)同位素分餾[51]，需要進(jìn)一步的工作來(lái)闡明HCH吸收和遷移對(duì)同位素分餾的影響[52]。

在分析技術(shù)方面，近期的發(fā)展包括樣品的凈化和富集，如分子印跡聚合物(MIPs)在復(fù)雜環(huán)境樣品處理中的運(yùn)用等[53]；CSIA可分析元素不斷拓展[36]，除了碳、氫、氯等元素外，目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)溴[54]、氮[55]等元素的測(cè)定；CSIA與其他方法，如對(duì)映體分餾[56]、分子生物學(xué)方法的聯(lián)用等。這些技術(shù)進(jìn)步可以進(jìn)一步促進(jìn)HCH研究，更深入揭示污染物反應(yīng)機(jī)理。

在環(huán)境應(yīng)用方面，同位素分餾是不依賴(lài)于濃度測(cè)定的一種獨(dú)立評(píng)價(jià)方法，目前已經(jīng)有許多實(shí)際案例。例如，在流域尺度，CSIA能用于估算污染物的遷移轉(zhuǎn)化，為殺蟲(chóng)劑環(huán)境殘留管理提供依據(jù)[57]；在場(chǎng)地修復(fù)中，同位素分餾可用作土壤和地下水中HCH自然衰減的關(guān)鍵評(píng)價(jià)手段。盡管CSIA技術(shù)也存在一定的局限，如可分析的物質(zhì)多是小分子，測(cè)定結(jié)果可能受儀器、分析方法和實(shí)驗(yàn)環(huán)境等因素影響等，但隨著技術(shù)進(jìn)步和儀器精度的提高，同位素分餾及其分析技術(shù)有望在土壤、地下水環(huán)境治理與評(píng)價(jià)中獲得更為廣泛的應(yīng)用。