子宮內(nèi)膜癌患者POLQ樣蛋白解旋酶的表達(dá)及臨床意義*

覃紅， 張瑜

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 婦科， 湖南 長沙 410008； 2.湘西自治州人民醫(yī)院&吉首大學(xué)第一附屬醫(yī)院 婦科， 湖南 吉首 416000)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)是常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高及死亡率高，嚴(yán)重威脅女性的生命健康，因此，早期識別診斷EC可及時進(jìn)行治療，從而有效地改善疾病的預(yù)后[1-2]。目前臨床上主要依據(jù)病理形態(tài)學(xué)早期診斷EC，但效果不佳。因此，尋找新的分子標(biāo)記物用于早期識別癌前病變和診斷EC具有重要意義[3]。POLQ樣蛋白解旋酶(helicase POLQ-like，HELQ)是一種核蛋白，可催化DNA雙鏈解螺旋，從而參與機(jī)體DNA修復(fù)過程[4-5]。HELQ在多種惡性腫瘤中常發(fā)生缺失或低表達(dá)，推測其在腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮抑癌基因作用，如肝癌、白血病、卵巢和乳腺癌[6]。目前國內(nèi)外關(guān)于HELQ在EC早期診斷和預(yù)后評估中的作用研究鮮有報(bào)道，本研究通過比較正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜伴不典型增生及EC中HELQ表達(dá)的差異，分析HELQ表達(dá)水平與EC臨床特征的相關(guān)性及其死亡預(yù)后的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年12月—2019年5月收治的年齡≥18周歲、臨床信息和病理資料齊全患者為研究對象，其中EC患者37例(EC組)、子宮內(nèi)膜不典型增生患者43例(增生組)及正常子宮內(nèi)膜患者30例(正常組)。EC組患者系擇期行EC全面分期手術(shù)、取內(nèi)膜組織行病理學(xué)診斷為EC，增生組患者系行全子宮切除術(shù)后或診斷學(xué)刮宮手術(shù)、取內(nèi)膜組織行病理學(xué)診斷為子宮內(nèi)膜不典型增生，正常組患者系因子宮內(nèi)膜息肉、異常子宮出血或子宮肌瘤等行診斷學(xué)刮宮術(shù)或全子宮切除術(shù)、取內(nèi)膜組織行病理學(xué)診斷為正常子宮內(nèi)膜組織。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前曾接受過放、化療等治療；(2)合并其他惡性腫瘤和或其他婦科惡性腫瘤；(3)術(shù)前1年接受過雌激素、孕激素等相關(guān)藥物治療；(4)病理結(jié)果為炎性改變，或者同時合并炎癥細(xì)胞浸潤；(5)合并嚴(yán)重心臟、肝臟、腎臟等器質(zhì)性疾??；(6)妊娠或哺乳期婦女；(7)意識障礙或精神異常，無法配合隨訪；(8)閱片時發(fā)生脫片、病理診斷不明確。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1子宮內(nèi)膜標(biāo)本制作及切片 取3組患者子宮內(nèi)膜組織，采用10%甲醛固定，常規(guī)制作石蠟切片，石蠟切片靜置于蘇木素染料5 min，流水沖洗，置于1%鹽酸乙醇溶液分化3 s，沖洗切片5 min；切片置于1%氨水溶液中反藍(lán)15 s，沖洗后蒸餾水中靜置；置于伊紅溶液染色2 min，依次放入75%乙醇溶液5 min、85%乙醇溶液5 min、無水乙醇Ⅰ溶液5 min、無水乙醇Ⅱ溶液5 min及二甲苯溶液5 min；風(fēng)干切片，中性樹膠封片，顯微鏡(日本尼康公司)下觀察組織切片，由病理醫(yī)師核對診斷結(jié)果。

1.2.2HELQ的檢測及陽性判斷 采用免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry，IHC)檢測3組研究對象子宮內(nèi)膜組織中HELQ蛋白表達(dá)水平，按照試劑盒中說明書操作。福爾馬林浸泡30 min、固定24 h，脫水、石蠟包埋后制成蠟塊、切片厚3.5 μm；40 ℃溫水上切片，65 ℃烤片機(jī)烘烤至水干蠟化；切片脫蠟、抗原修復(fù)、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷、血清封閉、一抗和二抗孵育(抗體濃度均為1 ∶200)、辣根過氧化物酶(3,3N-Diaminobenzidine tertrahydrochloride，DAB；塞維爾武漢生物科技有限公司生產(chǎn))顯色、胞核復(fù)染及脫水制片后，全自動玻片掃描系統(tǒng)掃描玻片、閱片；根據(jù)免疫反應(yīng)評分[immunoreactive score，IRS；IRS=染色強(qiáng)度(staining intensity，SI)×陽性細(xì)胞百分比(percentage of positive cells，PP)]系統(tǒng)進(jìn)行評價，每張玻片計(jì)數(shù)5個高倍鏡視野，將強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評分相乘得出IRS，規(guī)定IRS評分>2分為HELQ陽性[7]。

1.2.3Envision法檢測腫瘤增殖指數(shù)(anti-Ki67，Ki67)檢測 按SP-9000試劑盒說明書操作步驟檢測3組研究對象子宮內(nèi)膜組織中Ki67表達(dá)水平。隨機(jī)選擇10個(400×)視野下計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，根據(jù)著色情況將細(xì)胞按以下規(guī)則計(jì)分，陽性細(xì)胞數(shù)染色為未被著色、淡黃色、棕黃色及棕褐色分別計(jì)0、1、2 及 3分；計(jì)算陽性細(xì)胞百分率，<5%記0分、5%≤～<25%記1分、25%≤～<50%記2分、50%≤～<75%記3分、≥75%記4分，最后根據(jù)著色和陽性細(xì)胞百分率評分結(jié)果乘積得分判斷陽性和陰性，規(guī)定乘積得分0分為陰性(-)、 乘積得分1分及以上為陽性(+)[8]。

1.2.4雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)檢測及結(jié)果判斷 將3組研究對象子宮內(nèi)膜組織切片常規(guī)脫蠟，采用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗；采用3%過氧化氫室溫下浸泡10 min，PBS清洗；浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，92～98 ℃微波爐10 min，室溫冷卻30 min，PBS清洗；加2%羊血清，室溫20 min；去除液體，滴加鼠抗人雌激素、孕激素受體單克隆抗體，4 ℃過夜，PBS清洗；DAB顯色，蘇木精染色、脫水、透明及封片；ER、PR主要定位于細(xì)胞核，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率[陽性細(xì)胞百分率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)] ，≤10%為陰性(-)，>10%為陽性(+)[9]。

1.2.5基礎(chǔ)、臨床及術(shù)后隨訪信息 收集3組研究對象的基礎(chǔ)信息，包括年齡、身高、體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)、孕產(chǎn)史、流產(chǎn)史及婦科疾病史；收集EC組患者子宮內(nèi)膜癌分化程度、國際婦產(chǎn)科協(xié)會(the International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGP)分期、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管浸潤情況；采用門診復(fù)診或電話隨訪EC患者術(shù)后情況，隨訪截止時間為2021年1月1日，隨訪內(nèi)容包括隨訪時間(單位為月)、患者是否發(fā)生死亡和原因、是否失訪和原因等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 基礎(chǔ)信息

3組研究對象年齡、BMI、孕產(chǎn)史、流產(chǎn)史和婦科疾病史比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 各組研究對象的基礎(chǔ)信息比較Tab.1 Comparison of basic information in each group

2.2 HELQ陽性表達(dá)

3組研究對象子宮內(nèi)膜組織中HELQ陽性表達(dá)比較，EC組患者子宮內(nèi)膜組織中HELQ陽性表達(dá)人數(shù)少于正常組和增生組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組研究對象子宮內(nèi)膜組織中HELQ陽性表達(dá)Tab.2 Comparison of positive expression of HELQ in endometrial tissues of each group

2.3 EC組患者HELQ表達(dá)與臨床病理學(xué)特征、免疫組織化學(xué)指標(biāo)的關(guān)系

EC組患者中HELQ陰性和陽性者的腫瘤肌層浸潤深度、脈管浸潤、PR表達(dá)及Ki67表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 EC組患者中HELQ表達(dá)與臨床病理學(xué)特征、免疫組織化學(xué)指標(biāo)的關(guān)系Tab.3 Correlation between clinicopathological/immunohistochemical features and HELQ expression in endometrial cancer group

2.4 HELQ表達(dá)與EC患者死亡的相關(guān)性

37例EC患者隨訪時間為0～61個月，中位隨訪時間為39.5個月，死亡3例，總死亡率為8.11%；壽命表法分析結(jié)果顯示，1、3、5年生存率分別為97.0%、94.0%及89.0%；Cox回歸結(jié)果顯示，校正協(xié)變量腫瘤的肌層浸潤深度、脈管浸潤、Ki67表達(dá)及PR表達(dá)后，EC患者HELQ表達(dá)對其死亡的發(fā)生無影響(P>0.05)；Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，HELQ陽性和HELQ陰性EC患者生存率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4和圖1。

表4 Cox回歸分析HELQ表達(dá)與EC患者死亡的相關(guān)性Tab.4 Correlation between HELQ expression and death in patients with endometrial cancer patients by Cox regression analysis

圖1 HELQ表達(dá)陽性和陰性EC患者的生存曲線比較Fig.1 Comparison of survival curves of patients with HELQ expression-positive and HELQ expression-negative

2.5 HELQ表達(dá)對EC患者死亡的預(yù)測作用

ROC分析結(jié)果顯示，HELQ、HELQ×Ki67、HELQ×PR、HELQ×Ki67×PR預(yù)測EC死亡發(fā)生AUC分別為0.642、0.711、0.676、0.725，均大于0.5，但P>0.05。見表5和圖2。差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HELQ表達(dá)對EC患者死亡無預(yù)測作用。

表5 ROC曲線分析HELQ表達(dá)在EC患者死亡發(fā)生預(yù)測中的效能Tab.5 Efficacy of HELQ expression in predicting the death of endometrial cancer patients by ROC curves

圖2 HELQ及HELQ聯(lián)合其他指標(biāo)預(yù)測EC患者死亡發(fā)生的ROC曲線Fig.2 HELQ and HELQ combined with other indexes to predict the ROC curve of death in EC patients

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，HELQ與生殖健康和腫瘤疾病密切相關(guān)[10]，HELQ缺失或低表達(dá)可增加DNA損傷風(fēng)險，提高腫瘤發(fā)生率。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明[11]，HELQ與卵巢腫瘤、垂體瘤中生殖細(xì)胞缺失有關(guān)，敲除HELQ基因的小鼠生殖能力下降、生殖細(xì)胞缺失、DNA股間交聯(lián)敏感以及致癌傾向。本次研究結(jié)果顯示，隨著子宮內(nèi)膜從正常到癌變過程中HELQ陽性表達(dá)率逐漸下降(P<0.05)，在EC患者子宮內(nèi)膜組織中陽性表達(dá)率最低，與劉芳平等[12]、李亞萍等[13]、Liu等[14]研究結(jié)果一致，提示HELQ在EC中低表達(dá)，可作為惡性腫瘤早期診斷的新分子，在EC早期診斷中具有一定的應(yīng)用價值。

肌層浸潤深度、脈管浸潤及Ki67陽性率在既往研究中已被證實(shí)是EC預(yù)后評估的重要指標(biāo)，張品等[15]研究認(rèn)為，深肌層浸潤是EC預(yù)后獨(dú)立危險因素，能夠增加EC死亡發(fā)生風(fēng)險。趙昌芹等[16]研究顯示，EC伴有腫瘤脈管浸潤患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險相對無脈管浸潤增加3倍。R?dulescu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Ki67與腫瘤的增殖有關(guān)，其陽性表達(dá)可影響EC患者生存率和復(fù)發(fā)。本研究中，HELQ陽性組和HELQ陰性組肌層浸潤深度、脈管浸潤、Ki67陽性率和PR陽性率存在差異(P<0.05)，相關(guān)性分析中HELQ陽性率越低，則患者肌層浸潤深度、脈管浸潤、Ki67陽性率和死亡發(fā)生率越高(P<0.05)，提示HELQ可能作為抑癌基因參與EC腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移的過程，當(dāng)HELQ缺失或既表達(dá)則可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有研究顯示，EC中80%屬于激素依賴型(Ⅰ型)，是由于雌激素過度刺激導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增生，從而引發(fā)EC[18-20]。而孕激素能夠通過與子宮內(nèi)膜上PR結(jié)合，誘導(dǎo)過度增生的子宮內(nèi)膜向分泌期轉(zhuǎn)化，防止EC的發(fā)生[21-22]。本次研究結(jié)果顯示，HELQ陰性組EC患者肌層浸潤深度>1/2、脈管侵襲比率及Ki67陽性率較HELQ陽性組高(P<0.05)，提示HELQ在EC發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因作用，當(dāng)HELQ陰性或低表達(dá)時，腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及浸潤能力增加，導(dǎo)致腫瘤病情的進(jìn)展。同時，HELQ陰性組PR陽性率較HELQ陰性組低，孕激素不能有效結(jié)合PR拮抗雌激素發(fā)揮保護(hù)子宮內(nèi)膜的作用，從而促進(jìn)了EC的發(fā)生、發(fā)展。因此，推測HELQ在EC預(yù)后中具有重要作用。

有學(xué)者關(guān)于HELQ在惡性腫瘤預(yù)后中作用進(jìn)行了研究。高峻等[23]研究顯示，HELQ與原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)，HELQ蛋白低表達(dá)導(dǎo)致原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者預(yù)后不良；Guo等[24]研究顯示在慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者中HELQ表達(dá)水平與IGHV變異相關(guān)，而慢性淋巴細(xì)胞性白血病與靶細(xì)胞信號通路相關(guān)的預(yù)后與HELQ/EGR3的表達(dá)相關(guān)，慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者HELQ缺失導(dǎo)致其預(yù)后不良；Long等[25]研究表明，HELQ表達(dá)與卵巢癌患者對鉑類化療的反應(yīng)、總生存期及無病生存期有關(guān)，在腫瘤細(xì)胞過表達(dá)和敲除HELQ蛋白，能分別增加和降低細(xì)胞DNA修復(fù)活性，從而分別增加和降低腫瘤對順鉑耐藥性，能作為預(yù)測卵巢癌患者化療耐藥和判斷患者預(yù)后的指標(biāo)。本次研究中，HELQ表達(dá)與EC患者死亡預(yù)后呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，但校正混雜因素后，HELQ表達(dá)并不是EC死亡預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P>0.05)，提示與既往研究結(jié)果不同，一方面與樣本量小、發(fā)生死亡結(jié)局人數(shù)過少、研究結(jié)果可靠性有限有關(guān)；另一方面提示HELQ可能通過調(diào)控其他基因或分子物質(zhì)表達(dá)，從而影響EC的疾病進(jìn)展和預(yù)后。ROC曲線分析結(jié)果顯示，HELQ、HELQ聯(lián)合其他病理學(xué)、免疫組織化學(xué)指標(biāo)預(yù)測EC患者死亡AUC>0.5(P>0.05)，提示HELQ雖然與死亡預(yù)后發(fā)生有一定相關(guān)，但在預(yù)后評估中作用還有待進(jìn)一步探討。

本次研究分別檢測正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜不典型增生和EC子宮內(nèi)膜組織中檢測HELQ表達(dá)，初步探討了EC和EC癌前病變中檢測HELQ表達(dá)水平的變化趨勢；分析EC中HELQ表達(dá)與臨床病理學(xué)特征和免疫組化指標(biāo)的相關(guān)性，為后續(xù)HELQ參與EC發(fā)生、發(fā)展的具體作用機(jī)制研究提供線索；探討HELQ表達(dá)對EC死亡預(yù)后的影響及在預(yù)后評估中的預(yù)測作用，有助于早期識別EC術(shù)后不良預(yù)后發(fā)生的高危人群，及時采取干預(yù)措施，防止不良疾病轉(zhuǎn)歸。但本研究也存在一定不足：首先，樣本例數(shù)較小，病例僅來源于一家醫(yī)院，研究對象選取可能存在選擇偏倚；其次，未驗(yàn)證HELQ對細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及其在EC發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制；最末，隨訪中僅以死亡為結(jié)局，而臨床實(shí)際中EC患者術(shù)后復(fù)發(fā)率較死亡率高，未探討HELQ對EC患者復(fù)發(fā)的影響，預(yù)后評價不全面。這些都有待后續(xù)擴(kuò)大樣本量、多中心進(jìn)一步深入研究探討。

綜上所述，EC患者HELQ陽性表達(dá)率較子宮內(nèi)膜不典型增生患者和正常子宮內(nèi)膜女性低，可能與EC的發(fā)生、發(fā)展及死亡有關(guān)，早期檢測HELQ表達(dá)有助于臨床診療工作開展。