PCR-電化學(xué)基因芯片法在人乳頭瘤病毒感染檢測(cè)中的價(jià)值*

黃姍， 任燕燕， 韋四喜， 畢瑩， 王焰， 馬莉， 譚玉潔

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)中心， 貴州 貴陽 550004)

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)是一種屬于乳多空病毒科的雙鏈環(huán)狀DNA病毒， 可通過皮膚或黏膜損傷而引起感染[1]。HPV可依據(jù)與宮頸癌發(fā)生危險(xiǎn)性的高低而分為高低危型，HPV6和11等低危亞型可導(dǎo)致90%的肛門外生殖器疣和宮頸細(xì)胞低級(jí)別改變[2-3]；高危型以HPV16和18最為常見，與宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)高度病變(CINⅡ/Ⅲ)的發(fā)生密切相關(guān)；其他致癌亞型還包括HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73和82等，其中有12種致癌類型被歸為第一類致癌類型[3-4]。根據(jù)2018年GLOBOCAN統(tǒng)計(jì)，全球估計(jì)有57萬宮頸癌病例發(fā)生，約31萬人因?qū)m頸癌導(dǎo)致死亡[5]。高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌的重要危險(xiǎn)因素，因此，HPV-DNA檢測(cè)及分型對(duì)于宮頸癌早期篩查具有重要意義。目前常用的HPV檢測(cè)方法有二代雜交捕獲法、熒光定量PCR法和基因芯片法等[7-9]，Sanger測(cè)序法作為基因檢測(cè)中的參考方法，具有高度特異性，但因步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)及成本較高等原因不能滿足臨床實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)需要[10]；PCR-電化學(xué)基因芯片法作為一種新的HPV分型檢測(cè)方法，集合了電化學(xué)、基因信號(hào)放大、導(dǎo)流雜交及低密度基因芯片等技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，但尚無可靠的臨床應(yīng)用評(píng)估。因此，本文將PCR-電化學(xué)基因芯片法分別與金標(biāo)準(zhǔn)和臨床常用方法在HPV檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了分析和比較，旨在評(píng)估新方法的臨床應(yīng)用價(jià)值，為臨床HPV分型檢測(cè)方法的選擇和評(píng)估提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1標(biāo)本 收集2019年6—9月于貴州省某三甲醫(yī)院就診的310例女性的宮頸脫落細(xì)胞，刪去1例復(fù)檢者，共采集309例宮頸脫落細(xì)胞樣本，受檢者年齡18～70歲。

1.1.2儀器與試劑 電化學(xué)基因芯片檢測(cè)儀和人乳頭瘤病毒(20個(gè)型)基因分型檢測(cè)試劑盒(PCR-電化學(xué)基因芯片法)由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供，PCR擴(kuò)增儀、全自動(dòng)核酸提取儀和HPV核酸分型檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)均購(gòu)自江蘇碩世生物科技股份有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1取樣方法 由專業(yè)醫(yī)師用棉拭子輕輕擦去宮頸口多余分泌物，將宮頸采樣刷伸入宮頸口鱗狀上皮與柱狀上皮交界處，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)3～5圈采集宮頸脫落細(xì)胞，放入保存液管中密閉送檢。

1.2.2樣本DNA提取 在 96孔預(yù)封裝的1號(hào)和7號(hào)深孔板槽位中加入200 μL樣本，按照儀器說明書步驟進(jìn)行全自動(dòng)核酸提取。

1.2.3PCR-電化學(xué)基因芯片法 在PCR反應(yīng)管中先后加入22 μL含有PCR緩沖液和引物的反應(yīng)液和3 μL含有熱啟動(dòng)酶、三磷酸脫氧核糖核苷和尿嘧啶糖基化酶的反應(yīng)液，分別加入提取好的樣本DNA和HPV陰、陽性質(zhì)控品DNA溶液各5 μL，6 000 r/min瞬時(shí)離心后，將各反應(yīng)管放入PCR儀， 50 ℃ 3 min，95 ℃預(yù)變性15 min，94 ℃ 45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s擴(kuò)增50個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增結(jié)束后，依次將70 μL 含信號(hào)探針的HPV分型雜交液Ⅰ、10 μL含蛋白質(zhì)的雜交液Ⅱ和20 μL含高氯酸鈉的雜交液Ⅲ加入PCR產(chǎn)物中，充分混勻，將混勻的液體移入HPV分型電化學(xué)傳感器(芯片)管中，在DA9100電化學(xué)基因芯片檢測(cè)儀中檢測(cè)。

1.2.4熒光PCR法 完成DNA提取后，每份待測(cè)樣本核酸溶液、空白對(duì)照和陽性對(duì)照按照2 μL/管依次加入18 μL含有針對(duì)不同亞型的特異性引物和探針反應(yīng)體系的PCR八聯(lián)管中，低速離心。將反應(yīng)管放入熒光PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，按照50 ℃ 5 min酶處理、95 ℃ 10 min預(yù)變性、95 ℃ 10 s變性和58 ℃ 40 s退火、延伸及檢測(cè)熒光，45個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)分析獲得結(jié)果。

1.2.5Sanger測(cè)序 委托上海生工健康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司完成。

1.2.6結(jié)果判定 PCR-電化學(xué)基因芯片法：當(dāng)位點(diǎn)信號(hào)值<8 nA時(shí)，視該信號(hào)值為背景信號(hào)，報(bào)告單報(bào)告該位點(diǎn)型別為“Target Not Detected”；當(dāng)位點(diǎn)信號(hào)值≥8 nA時(shí)，作為型別判定依據(jù)。熒光PCR法：在各探針組中的HPV亞型擴(kuò)增曲線呈典型S型曲線、且CT值≤30，判斷相應(yīng)的HPV亞型為陽性；無典型S型擴(kuò)增曲線或CT值>30，判斷相應(yīng)的HPV亞型為陰性。

1.2.7敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和符合率 敏感性即真陽性率，反映某種方法判定某病變的漏診率；特異性即真陰性率，反映某種方法判定某病變的誤診率；陰性預(yù)測(cè)值反映得出陰性結(jié)果的樣本總數(shù)中，真實(shí)健康樣本數(shù)占陰性檢測(cè)樣本總數(shù)的百分比；陽性預(yù)測(cè)值反映出陽性結(jié)果的樣本中，真實(shí)病人樣本數(shù)占陽性樣本檢測(cè)總數(shù)的百分比；符合率又稱一致率，是篩檢實(shí)驗(yàn)判定的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)診斷的結(jié)果相同的數(shù)占總受檢數(shù)的比例[11-13]。各自計(jì)算公式分別為：敏感性(%)=真陽性/(真陽性+假陰性)×100%，特異性(%)=真陰性/(真陰性+假陽性)×100%，陽性預(yù)測(cè)值(%)=真陽性/(真陽性+假陽性)×100%，陰性預(yù)測(cè)值(%)=真陰性/(真陰性+假陰性)×100%，符合率(%)=(真陽性+真陽性)/(真陽性+真陰性+假陽性+假陰性)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩種方法結(jié)果間差異和一致性比較采用McNemar卡方檢驗(yàn)和Kappa一致性檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Kappa≥0.75為兩者一致性好，0.4≤Kappa<0.75為兩者一致性中等，Kappa<0.4為兩者一致性較差[14]。

2 結(jié)果

2.1 3種檢測(cè)方法的基因型

3種檢測(cè)方法在309例樣本中均可檢測(cè)到20種HPV基因型，其中最常檢測(cè)到的亞型為HPV52，其次依次為HPV58、16和53等。見表1。

表1 3種檢測(cè)方法檢測(cè)人乳頭瘤病毒分型結(jié)果Tab.1 HPV typing results by three methods

2.2 PCR-電化學(xué)基因芯片法與Sanger測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果比較

2.2.1PCR-電化學(xué)基因芯片法與Sanger測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果一致性分析 經(jīng)Kappa檢驗(yàn)一致性分析表明，兩者一致性好(Kappa=0.955，P<0.001)。見表2。

表2 PCR-電化學(xué)基因芯片法和Sanger測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果一致性(n)Tab.2 The consistency of the detection results between PCR-electrochemical gene chip and Sanger sequencing(n)

2.2.2PCR-電化學(xué)基因芯片法與Sanger測(cè)序不一致結(jié)果 兩種方法檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本為5例。見表3。

表3 PCR-電化學(xué)基因芯片法與Sanger測(cè)序法不一致結(jié)果分析Tab.3 Analysis of inconsistent results between PCR-electrochemical gene chip and Sanger sequencing

2.3 PCR-電化學(xué)基因芯片法和熒光PCR法檢測(cè)結(jié)果一致性分析

McNemar檢驗(yàn)示χ2=309，P=0.063，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Kappa檢驗(yàn)一致性分析表明，兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性好(Kappa=0.944，P<0.001)。見表4。

表4 PCR-電化學(xué)基因芯片法和熒光PCR法檢測(cè)結(jié)果的一致性(n)Tab.4 Consistency of detection results between PCR-electrochemical gene chip and fluorescent PCR(n)

2.4 PCR-電化學(xué)基因芯片法與熒光PCR法的診斷效能評(píng)價(jià)

以Sanger測(cè)序法為金標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算PCR-電化學(xué)基因芯片法和熒光PCR法的敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和符合率。其中PCR-電化學(xué)基因芯片法敏感性為98.44%、特異性為100%、陽性預(yù)測(cè)值為100%、陰性預(yù)測(cè)值為92.86%及符合率為98.71%；熒光PCR法敏感性為100%、特異性為98.08%、陽性預(yù)測(cè)值為99.61%、陰性預(yù)測(cè)值為100%及符合率為99.68%。

3 討論

Sanger測(cè)序法是基因檢測(cè)中普遍認(rèn)可的方法，但由于耗時(shí)長(zhǎng)和成本高等原因未能在臨床廣泛開展。目前常用的熒光PCR法，在原有常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入一條標(biāo)記2個(gè)熒光基團(tuán)的熒光雙標(biāo)記探針，減少了常規(guī)PCR擴(kuò)增過程中因污染導(dǎo)致的假陽性，具有高擴(kuò)增效率[20]。而PCR-電化學(xué)基因芯片法是一種新的HPV檢測(cè)方法，將特異性捕獲探針分別固定在特制的印刷電路板金電極表面，制備成HPV分型基因芯片，用于捕獲PCR多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物，與信號(hào)探針特異結(jié)合，其信號(hào)探針上標(biāo)記有二茂鐵分子，通過夾心雜交產(chǎn)生電流的變化，進(jìn)而通過電流信號(hào)進(jìn)行人乳頭瘤病毒分型，提高了檢測(cè)敏感性和特異性。本文以Sanger測(cè)序法作為金標(biāo)準(zhǔn)，將PCR-電化學(xué)基因芯片法和臨床常用的熒光PCR法結(jié)果進(jìn)行了一致性比較和診斷效能評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，PCR-電化學(xué)基因芯片法與熒光PCR法和Sanger測(cè)序法均有高度一致性，提示PCR-電化學(xué)基因芯片檢測(cè)法亦具有較高的可靠性。比較而言，PCR-電化學(xué)基因芯片法具有較高的特異性、陽性預(yù)測(cè)值更高，而熒光PCR法具有更高的敏感度、陰性預(yù)測(cè)值和總符合率更高。

在將PCR-電化學(xué)基因芯片法與Sanger測(cè)序法的不一致結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，PCR-電化學(xué)基因芯片法，有4例假陰性，亞型分別為52型、68型和2次39型，分析原因可能為PCR-電化學(xué)基因芯片法對(duì)52型、39型和68型等亞型敏感性較低；1例檢出陽性但與測(cè)序法亞型不一致，分析原因可能為出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增。而熒光PCR法與測(cè)序法不一致的樣本稍多，其中大多數(shù)為亞型分型與測(cè)序法不一致?；诒敬螌?shí)驗(yàn)結(jié)果中的HPV亞型檢測(cè)分析，熒光PCR較易漏檢HPV58、52、56、51、16、18、59、82、6和11等亞型；多次增加檢出HPV39、52、53、81、68、33、73、68、51和11等亞型，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)。分析可能的原因如下：(1)當(dāng)同一樣本中有多個(gè)亞型同時(shí)存在且各亞型含量有差異時(shí)，擴(kuò)增時(shí)可能出現(xiàn)引物競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致部分型別無法檢出；(2)HPV濃度位于試劑盒檢測(cè)限濃度附近及低濃度核酸提取效率差異；(3)熒光PCR法可能由于引物、探針和DNA聚合酶等濃度影響，導(dǎo)致PCR反應(yīng)中出現(xiàn)引物錯(cuò)配以及樣本混合其他病原體感染等原因而出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增[21]；(4)同一份樣本需先后進(jìn)行3種不同實(shí)驗(yàn)方法的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)后期含量少的樣本可能出現(xiàn)了DNA降解。因此，本研究顯示PCR-電化學(xué)基因芯片法和熒光PCR法均與Sanger測(cè)序法具有較高的一致性。熒光PCR法由于高敏感性和價(jià)格經(jīng)濟(jì)，適用于基層開展宮頸癌篩查，而PCR-電化學(xué)基因芯片法的高特異性使其有望聯(lián)合p16/Ki-67、TESTIN和DMBT1等多種分子標(biāo)志物實(shí)現(xiàn)對(duì)宮頸癌及癌前病變的精準(zhǔn)化診斷[22-23]。臨床可根據(jù)不同病患需求選擇合適的HPV檢測(cè)方法，減少因不必要的陰道鏡檢查和過度治療而引起患者的負(fù)面心理影響[24-25]，提高篩查效率。

綜上，PCR-電化學(xué)基因芯片法與Sanger測(cè)序法和熒光PCR法一致性均好，且具有高特異性和陽性預(yù)測(cè)值，可作為臨床HPV感染檢測(cè)方法的補(bǔ)充。