上調(diào)NICD對人牙周膜干細(xì)胞增殖及遷移能力的影響

張大靈　王源元　劉莉　周嫣　李華

[摘要]目的：研究上調(diào)Notch胞內(nèi)區(qū)域（Notch Intracellular Domain，NICD）對人牙周膜干細(xì)胞增殖及遷移能力的影響。方法：將細(xì)胞分為上調(diào)組、對照組及空白組，使用MTT比色法檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡能力，采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移情況，并使用Western blot檢測人牙周膜干細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路蛋白（TGF-β、BMP-2、β-caten、LEF-1、Cyclin D1、Caspase-3、Bax、Bcl-2）表達(dá)量。結(jié)果：對照組各時(shí)間點(diǎn)的人牙周膜干細(xì)胞增殖率、堿性磷酸酶活性、遷移、黏附個(gè)數(shù)、TGF-β、BMP-2、β-caten、LEF-1、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)量均低于空白組，且凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。上調(diào)組各時(shí)間點(diǎn)人牙周膜干細(xì)胞增殖率、堿性磷酸酶活性、遷移、黏附個(gè)數(shù)、TGF-β、BMP-2、β-caten、LEF-1、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)量均高于空白組和對照組，且凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量均低于空白組和對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：上調(diào)NICD基因能促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞的增殖和遷移，其機(jī)制可能與Wnt/β-catenin通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域;人牙周膜干細(xì)胞;增殖;凋亡;遷移;信號通路

[中圖分類號]R781? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2022）01-0097-05

Effect of Upregulation of NICD on Proliferation and Migration of Human Periodontal Ligament Stem Cells

ZHANG Daling1，WANG Yuanyuan1，LIU Li2，ZHOU Yan1，LI Hua3

（1.Department of Orthodontics，People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530021，Guangxi，China;

2.Department of Stomatology，Affiliated Stomatological Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541000，Guangxi，China;

3.Department of Oral and Maxillofacial Surgery，Hospital of Stomatology，Guangxi Medical University，Nanning 530021，Guangxi，China）

Abstract： Objective? To investigate the effect of up regulating Notch intracellular domain （NICD） on the proliferation and migration of human periodontal ligament stem cells. Methods? NICD cells were divided into the up regulation group， the control group and the blank group. MTT colorimetry was used to detect cell proliferation， flow cytometry was used to detect cell apoptosis， cell migration was detected by cell scratch test， and the expression of Wnt/β-catenin signaling pathway protein in human periodontal ligament stem cells was detected by Western blot （TGF-β、BMP-2， β-caten， LEF-1， Cyclin D1， Caspase-3， Bax， Bcl-2）. Results? The proliferation rate， alkaline phosphatase activity， migration， number of adhesion and TGF-β， BMP-2， β-caten， LEF-1， Cyclin D1， Bcl-2 protein expression of human periodontal ligament stem cells in the control group at each time point were lower than those in the blank group， and the apoptosis rate， the expression of Caspase-3 and Bax protein in the blank group were higher than those in the blank group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The proliferation rate， alkaline phosphatase activity， migration， number of adhesion and TGF-β， BMP-2， β-caten， LEF-1， Cyclin D1， Bcl-2 protein expression of human periodontal ligament stem cells in the up regulation group at each time point were higher than those in the blank group and the control group （P<0.05）. The apoptosis rate， the expression of Caspase-3 and Bax protein in the up regulation group were lower than those in the blank group and the control group （P<0.05）. Conclusion? Upregulation of NICD gene can promote the proliferation and migration of human periodontal ligament stem cells， and its mechanism may be related to Wnt/β-catenin pathway.

Key words： Notch intracellular domain;human periodontal ligament stem cells; proliferation; apoptosis; migration; signaling pathways

慢性牙周炎是常見的一種口腔疾病，可對人們的口腔健康以及生活產(chǎn)生嚴(yán)重影響，甚者導(dǎo)致牙齒廢用[1]。其主要特征包括：牙齦出血、不同深度的牙周袋、牙齒松動、牙槽骨吸收等，對人類牙齒健康帶來嚴(yán)重?fù)p害[2]。牙周膜干細(xì)胞能夠通過維持自身數(shù)量來實(shí)現(xiàn)自我更新能力，經(jīng)誘導(dǎo)可分化為成骨樣細(xì)胞和脂肪樣細(xì)胞[3]。其是一種位于口腔位置的間充質(zhì)干細(xì)胞，是由釉基質(zhì)蛋白主要組成。有研究表明[4]，Notch胞內(nèi)區(qū)域（Notch intracellular domain，NICD）能夠促進(jìn)牙周組織的再生修復(fù)作用，但目前對于NICD作用調(diào)控牙周膜干細(xì)胞增殖、遷移機(jī)制研究較少，且尚無統(tǒng)一定論，因此在本研究中，上調(diào)NICD的表達(dá)研究其對牙周膜干細(xì)胞增殖、遷移的影響，以尋找其作用機(jī)制，為臨床上人牙周膜干細(xì)胞的研究提供新的方向。

1? 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 研究細(xì)胞：人牙周膜干細(xì)胞NICD（上海研生實(shí)業(yè)有限公司），本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑：兔抗人TGF-β抗體（武漢菲恩生物科技有限公司）;大鼠抗小鼠BMP-2抗體、LEF-1抗體、Cyclin D1抗體（上海恒斐生物科技有限公司）;人抗大鼠β-caten抗體（上海優(yōu)予生物科技有限公司）;大鼠抗小鼠Caspase-3抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體（上?？泼羯锟萍加邢薰荆?。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組：取人牙周膜干細(xì)胞，在培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)其融合率為75%左右時(shí)，使用胰酶進(jìn)行消化，消化完成后則終止消化（在新鮮培養(yǎng)基中），隨之便用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測量終止消化后的細(xì)胞，測量其密度后，將其種植在六孔板中，每個(gè)板中種植4×105個(gè)細(xì)胞，加至新鮮的培養(yǎng)基中（3ml），進(jìn)行培養(yǎng)，在溫度為37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)期融合率達(dá)到40%～80%時(shí)，取1.5μl的放入100μl的雙抗培養(yǎng)基中（去除血清），并進(jìn)行完全混合，混合后進(jìn)行離心處理，放置EP管底，并在管內(nèi)加入12μl的PolyFect Reagent，進(jìn)行上下重復(fù)顛倒，反復(fù)5次后，進(jìn)行混合處理，然后放置室內(nèi)靜置，時(shí)間為5～10min，對轉(zhuǎn)染復(fù)合物起到促進(jìn)作用，將新鮮培養(yǎng)基中加入六孔板中的培養(yǎng)基（3ml），將600μl培養(yǎng)基加入EP管中，上下顛倒2次，放入六孔板，水平晃蕩，然后培養(yǎng)24h后，換液處理。再次培養(yǎng)24h，倒置，使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。NICD受體基因序列根據(jù)質(zhì)粒特點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引入SacⅠ酶切位點(diǎn)（由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成），構(gòu)建NICD上調(diào)慢病毒載體，分為上調(diào)組。對照組中加入一段無義序列空白載體;空白組只加生理鹽水。

1.2.2 熒光定量qRT-PCR檢測NICD的水平：采集樣本5ml，置于一次性真空無抗凝劑的采血管中，使用Ficoll液分離單個(gè)核細(xì)胞。TRIzol提取細(xì)胞RNA，經(jīng)過電泳檢測RNA并定量，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。之后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，探針或SYBR 反應(yīng)體系25μl，反應(yīng)條件滿足：94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)組和空白對照。將PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)前3～15個(gè)循環(huán)熒光信號作為熒光本底信號，調(diào)節(jié)基線，采用2-△△Ct分析NICD基因表達(dá)。NICD引物序列：上游cDNA為模板、GAPDH為內(nèi)參照，用以下引物（上游：5’-CGCGGATCCATGCACCTGGATGCCGCTGACCTG-3’;下游：5’-ACGTCTAGACTTGAAGGCCTCCGGAATGCG-3’）。

1.2.3 堿性磷酸酶活性檢測：取第三代成長較好細(xì)胞hPDLSCs消化離心制成細(xì)胞懸液，按1×104 cell/ml的密度接種于96孔板中，24 h后，細(xì)胞貼壁后將培養(yǎng)液摒棄，PBS連續(xù)沖洗3次，在每孔180 μl中加無酚紅成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液。各組分別在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)1、3、5、7 d后停止培養(yǎng)，使用PBS反復(fù)沖洗后按堿性磷酸酶活性試劑盒進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀檢測各孔520 nm波長處的吸光度值，取平均值。

1.2.4 人牙周膜干細(xì)胞增殖能力檢測：MTT比色法檢測三組人牙周膜干細(xì)胞增殖，在96孔培養(yǎng)板中對人牙周膜干細(xì)胞懸液進(jìn)行接種，加入90μl細(xì)胞懸液放置每個(gè)孔內(nèi)，將三組不同濃度曲古霉素A培養(yǎng)液劃分為24 h、48h和72 h，并設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。在加入10 μl的培養(yǎng)液中放入不同濃度的曲古霉素A進(jìn)行培養(yǎng)。等達(dá)到相應(yīng)時(shí)間后，加入150 μl的DMSO，搖晃10 s，增殖率=（細(xì)胞OD值/參照值-1）×100%。

1.2.5 人牙周膜干細(xì)胞凋亡能力檢測：使用流式細(xì)胞儀對三組人牙周膜干細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測，對細(xì)胞進(jìn)行傳代處理，至5孔板中，在5% CO2、37 ℃的環(huán)境下對其進(jìn)行培養(yǎng)，在24 h、48 h、72 h后，加入蛋白酶依次進(jìn)行消化處理和離心處理，使用離心機(jī)將其離心，轉(zhuǎn)速為2 000 r/min，離心時(shí)間5 min，收集離心后的細(xì)胞，使用PBS沖洗兩次，每次3 min，然后再次離心處理和收集細(xì)胞，加入1MlPI，放置1h（避光），之后用特異性熒光進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記后在流動期間發(fā)射光子，利用發(fā)光信號對光子數(shù)值進(jìn)行檢測，最后使用流式細(xì)胞儀對人牙周膜干細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測。

1.2.6 人牙周膜干細(xì)胞遷移能力檢測：將人牙周膜干細(xì)胞NICD在18板孔內(nèi)進(jìn)行接種，在細(xì)胞增長到90%時(shí)，垂直劃出三條直線，使用100μl槍頭。采用PBS緩沖液連續(xù)沖洗3次，加0.5%血清培養(yǎng)基24h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移狀況。

1.2.7 人牙周膜干細(xì)胞黏附能力檢測：在96孔板中加入30 mg/L的纖維和50μl連接蛋白，過夜風(fēng)干;通過3% BSA PBS液化，封存2 h;每孔中加RPM-1640清洗，將細(xì)胞稀釋5×105個(gè)/毫升置于200 μl 10% FBS溶液中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h;采用PBS反復(fù)清兩次;每孔中100 μl無血清培養(yǎng)基，20 μl MTS（5 g/L）溶液;拍照，再次進(jìn)行4 h培養(yǎng)，棄上清，加入100 μl的DMSO，晃蕩10 min，溶解后，通過酶標(biāo)儀觀察490 nm波長的吸光值。

1.2.8 Western blot檢測：將采集到的標(biāo)本10 000×g離心處理10 min，對上清液進(jìn)行提取后，BCA進(jìn)行蛋白定量檢測，在2×SDS凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白，在100℃環(huán)境中加熱5 min有助于蛋白發(fā)生變性。凝膠電泳完、轉(zhuǎn)膜，取膜，4℃環(huán)境下在5%脫脂牛奶中固定、封閉處理時(shí)間為1h，將一抗使用0.05%～0.1% TBST給予稀釋（TGF-β、BMP-2、β-caten、LEF-1、Cyclin D1、Caspase-3、Bax、Bcl-2一抗為1：1 000），4℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，每次為5 min，二抗被0.05%～0.1% TBST稀釋（1：10 000），搖動孵育時(shí)間為 1h，再次采用TBST連續(xù)洗膜3次，處理時(shí)間為5 min。DAB顯色，定量分析蛋白表達(dá)情況。以GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）描述，多組間比較采用F檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 三組NICD表達(dá)量比較：上調(diào)組NICD表達(dá)量高于空白組和對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;空白組NICD表達(dá)量高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1～2。

2.2 三組人牙周膜干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)堿性磷酸酶活性比較：如圖3所示，對照組堿性磷酸酶活性低于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;上調(diào)組堿性磷酸酶活性高于空白組和對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 三組人牙周膜干細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)增殖、凋亡情況比較：如圖4所示，對照組各時(shí)間點(diǎn)人牙周膜干細(xì)胞增殖率低于空白組，且人牙周膜干細(xì)胞凋亡率高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;上調(diào)組各時(shí)間點(diǎn)人牙周膜干細(xì)胞增殖率高于空白組和對照組，且凋亡率低于空白組和對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 三組人牙周膜干細(xì)胞遷移、黏附情況比較：如圖5～8所示，上調(diào)組人牙周膜干細(xì)胞遷移、黏附個(gè)數(shù)均高于對照組及空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.5 三組人牙周膜干細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達(dá)量比較：如圖9～10所示，對照組人牙周膜干細(xì)胞中TGF-β、BMP-2、β-caten、LEF-1、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)量均低于空白組，且Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;上調(diào)組人牙周膜干細(xì)胞中TGF-β、BMP-2、β-caten、LEF-1、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)量均高于空白組和對照組，且Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量低于空白組和對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3? 討論

有學(xué)者指出，將牙周膜干細(xì)胞移植到牙槽骨缺陷區(qū)，可促使牙周組織的再生，從而為牙周干細(xì)胞的研究提供了新的理論依據(jù)[5]。Nagata M等[6]研究中認(rèn)為培養(yǎng)牙周膜干細(xì)胞可增強(qiáng)牙周再生。牙周膜干細(xì)胞能夠分化成為牙骨質(zhì)和牙周膜樣組織等，在維持牙周組織健康起著重要作用[7]。有研究表明[8]，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)區(qū)和CDC10重復(fù)序列與胞內(nèi)區(qū)激活有關(guān)，且能夠改變引起轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)，而RAM結(jié)構(gòu)蛋白域能夠促進(jìn)NICD與轉(zhuǎn)錄因子更好地結(jié)合[9]。

TGF-β能夠在成熟有機(jī)體和發(fā)育中參與細(xì)胞生長、分化、凋亡過程，維持細(xì)胞動態(tài)平衡，能夠與Ⅱ型受體結(jié)合而形成的受調(diào)控的SMAD蛋白[10-11]。有研究表明，BMP-2可通過轉(zhuǎn)染基因上調(diào)牙周膜干細(xì)胞中的NICD等基因的表達(dá)[11]。BMP-2可通過激活Wnt信號通路中β-catenin通路來促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的分化和遷移，有研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2還可與其他因子相互作用[12]。LEF-1是Wnt通路中重要的調(diào)節(jié)因子，能夠通過與DNA的結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控基因的表達(dá)[13]。Cyclin D1是一種周期性蛋白，能夠調(diào)控細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)化，在調(diào)節(jié)細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換中也發(fā)揮著重要作用。其還能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，能夠激活G1周期蛋白依賴性激酶CDK4。有研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1除了能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂外還能夠促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的功能。Cyclin D1屬于細(xì)胞周期依賴性激酶CDKs的調(diào)控者，不同周期蛋白表現(xiàn)其不同特異性和降解性，有益于每個(gè)有絲分裂時(shí)間的協(xié)調(diào)性[14]。Caspase-3屬于Caspase家族中的一員，Caspase-3是凋亡反應(yīng)中最為主要的凋亡蛋白[15]。Caspase-8參與執(zhí)行凋亡，誘導(dǎo)Caspase-3激活，使Caspase啟動聯(lián)級反應(yīng)，活化執(zhí)行Caspase裂解特異性底物致使細(xì)胞凋亡。有研究表明，降低激活Caspase-3可有效抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[16]。Bax是Bcl-2家族中重要促凋亡蛋白，是線粒體膜上離子通道的主要組成部分，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C進(jìn)入線粒體，激活Caspase-9，然后進(jìn)一步激活Caspase-3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17-18]。Bcl-2具有抗凋亡的作用，能夠阻止線粒體細(xì)胞色素C釋放發(fā)揮其作用。有研究表明，Bcl-2能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期，過表達(dá)則可抑制細(xì)胞凋亡，Bax能夠?qū)cl-2抑制凋亡起對抗作用[19]。Bcl-2/Bax屬于一個(gè)平衡體系，Bcl-2過多時(shí)則可抑制凋亡，而Bax過多時(shí)，則可促進(jìn)凋亡[20]。Wnt信號通路是生物過程中極為保守的一條通路，主要存在于細(xì)胞核生物代謝活動中。在本文中上調(diào)NICD受體基因，將Wnt/β-catenin信號通路激活，β-catenin蛋白能夠在細(xì)胞內(nèi)聚集，并與細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)節(jié)下游因子Cyclin D1、LEF-1、Caspase-3、Bax、BMP-2等表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控干細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等一系列活動。

綜上所述，上調(diào)人牙周膜干細(xì)胞NICD，可有效促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞的增殖和遷移，其機(jī)制可能與Wnt/β-catenin通路激活，調(diào)控其下游因子有關(guān)。

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[收稿日期]2020-07-13

本文引用格式：張大靈，王源元，劉莉，等.上調(diào)NICD對人牙周膜干細(xì)胞增殖及遷移能力的影響[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2022，31（1）：97-101.