香蕉鉀轉運體HAK/KUP/KT家族鑒定及其在果實發(fā)育和低鉀脅迫下的表達分析

金龍飛 張安妮 滕夢鑫 李新國

摘要：鉀是香蕉生長發(fā)育中需求量最大的營養(yǎng)元素，對果實產量、品質和貯藏性都有重要的影響。從香蕉基因組中鑒定出24個HAK/KUP/KT（MaKUP）基因，并對其理化性質、染色體定位、基因結構、保守功能域、進化關系、組織表達和低鉀脅迫下的表達特征進行分析。結果表明，MaKUP編碼的肽鏈平均有772個氨基酸，分子量為63.54～93.82 ku，等電點為5.44～9.30，蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為32.69～44.29，脂肪族指數(shù)為105.34～116.90，總平均親水性為 0.352～0.549，含有8～11個外顯子，可分為4個亞族;表達分析發(fā)現(xiàn)15個MaKUP基因家族成員在香蕉不同發(fā)育時期的果實中高表達，6個MaKUP基因家族成員在低鉀脅迫中上調表達，表明MaKUP在香蕉果實發(fā)育和鉀吸收中具有重要的作用。

關鍵詞：香蕉;鉀;HAK/KUP/KT;基因表達;低鉀脅迫

中圖分類號：S668.101 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）02-0030-07

收稿日期：2021-04-15

基金項目：國家自然科學基金（編號：31760549）;海南省自然科學基金（編號：320RC485）;海南省熱帶園藝作物品質調控重點實驗室科研項目[編號：HNZDSYS（YY）-01]。

作者簡介：金龍飛（1988—），男，湖北荊門人，博士，助理研究員，主要從事熱帶作物栽培研究。E-mail：jlf_0511@163.com。

通信作者：李新國，博士，教授，主要從事果樹種質資源與遺傳改良研究。E-mail：lixinguo13@163.com。

鉀是植物細胞中最多的陽離子，含量占植物干質量的2%～10%。鉀參與植物跨膜轉運、維持細胞電荷平衡、酶的活化、光合作用、滲透調節(jié)和氣孔運動等眾多的生命活動過程[1]。缺鉀會嚴重影響作物的產量和品種。植物中的鉀離子轉運蛋白主要包含Shaker通道、KCO/TPK通道、HAK/KUP/KT（后簡寫為KUP）轉運體、Trk/HKT轉運體和K+/H+逆向轉運體，其中KUP轉運體是鉀轉運系統(tǒng)中最早發(fā)現(xiàn)的數(shù)量最多、功能最豐富的鉀轉運體[2]。KUP轉運體最早在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)[3]，因其具有鉀吸收功能，被命名為鉀吸收透性酶（K+uptake permease，簡稱KUP），該轉運體可使酵母在外界K+濃度極低的條件下仍能保持較高的細胞內K+濃度，因此也被命名為高親和性K+轉運體（high-affinity K+transporter，簡稱HAK）[4]，在擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn)其具有鉀轉運功能，也被命名為K+轉運體（K+transporter，簡稱KT）[5]。隨著大量植物基因組序列的公布，KUP基因家族也在水稻[6]、小麥[7]、大豆[8]、棉花[9]、甘蔗[10]、大白菜[11]、茶樹[12]等作物中被鑒定出來。高鉀親和力的KUP的表達通常受低鉀脅迫的誘導，在玉米中過表達高親和性鉀轉運體基因ZmHAK5可以提高玉米在低鉀條件下對鉀的吸收能力，促進根系的生長[13]。

香蕉是典型的喜鉀作物，植株的鉀含量高達7.16%，果實中鉀含量高達13.7 mg/g[14-15]。氮鉀肥（N ∶K2O）施用比例為1 ∶1.12～1 ∶1.20時，果實農藝性狀最佳、品質最優(yōu)、產量最高，較對照處理增產高達16.1%[16]。然而對于香蕉鉀吸收、轉運和利用相關的分子機制還少見報道。隨著香蕉AB基因組測序的完成，基于全基因組信息挖掘和鑒定香蕉鉀轉運蛋白并分析其與鉀素吸收的特性，能夠從基礎研究的層面解析香蕉鉀素吸收的分子機制，為香蕉通過遺傳改良提高養(yǎng)分利用效率奠定理論基礎。本研究基于香蕉基因組數(shù)據(jù)，利用生物信息學方法鑒定MaKUP基因家族成員，并從基因及蛋白結構、基因在各組織中的表達模式及基因在低鉀脅迫下寶島蕉的表達模式等3個方面進行分析，以期初步解析香蕉中MaKUP基因在果實發(fā)育和低鉀響應中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種為寶島蕉（Musa AAA Cavendish，cv. Baodaojiao），來自中國熱帶農業(yè)科學院組培中心，苗高約20 cm，長勢一致，5葉1心，心葉未展開，無病蟲害。將袋裝寶島蕉幼苗取出，洗凈根系轉入清水中進行適應性培養(yǎng)，待新根長出后，依次換1/4、1/2和全營養(yǎng)阿夫多寧營養(yǎng)液，每5 d更換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)條件為光照強度75 μmol/（m2·s），光照時間14 h/d，晝夜溫度27 ℃，相對濕度85%～90%，每 3 h 通氣15 min。試驗時間為2020年10月至2021年2月。

1.2 試驗方法

1.2.1 水培和低鉀處理 采用水培對供試材料進行低鉀脅迫處理，低鉀脅迫處理的鉀濃度為4 mg/L，以全營養(yǎng)液作為對照（鉀濃度為40 mg/L），3株1個處理，每個處理重復3次。低鉀處理后1、3、6、12、24 h采集2 cm的根尖，液氮速凍后，保存在 -80 ℃ 冰箱中。

1.2.2 MaKUP基因家族的生物信息學分析 從香蕉基因組數(shù)據(jù)庫中下載基因的編碼序列（CDS）、基因序列、蛋白序列、啟動子序列以及在香蕉各組織中的表達數(shù)據(jù)（RPKM值）。利用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白序列的氨基酸數(shù)量、等電點、分子量;利用CD-Search Tool（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）分析結構域，利用MEME（http：//alternate.meme-suite.org/tools/meme）分析保守基序，使用TBtools軟件繪制熱圖[17];利用GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）分析基因結構;利用MEGA 6.0軟件繪制進化樹。

1.2.3 香蕉根尖總RNA的提取、cDNA的合成和熒光定量PCR 采用植物總RNA提取試劑盒（DP432）[天根生化科技（北京）有限公司]提取香蕉根尖總RNA，具體方法參照說明書。為防止RNA降解，所用試驗耗材（槍頭、離心管）均為RNase-free，研缽與研磨棒用錫箔紙包裹后180 ℃干熱滅菌4 h，冷卻待用。利用瓊脂糖凝膠電泳與紫外分光光度法檢測RNA的濃度、純度與完整度，保證RNA條帶28S與18S的亮度在2 ∶1，5S條帶亮度弱，D260 nm/D280 nm在1.9～2.1之間。采用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金生物技術有限公司）合成cDNA，具體方法參照說明書。采用PowerUPTM SYBRTM Green Master Mix（Thermo Scientific公司）進行基因表達分析，具體方法參照試劑盒說明書，在Applied Biosystems 7500上進行熒光定量PCR反應，所用引物序列見表1。每個樣品設置3個生物學重復及3個機械重復，以actin為內參基因，以未進行低鉀脅迫的樣品作為參照，根據(jù)2-ΔΔCT法進行相對表達量的計算。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan’s檢測法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 MaKUP基因家族成員的理化性質

通過Blastp將擬南芥和水稻的KUP基因家族的氨基酸序列與香蕉A基因組數(shù)據(jù)進行比對，得到的候選基因進行保守結構域分析，共獲得24個MaKUP基因家族成員，根據(jù)其在染色體上排列順序，依次命名為MaKUP1～MaKUP24。香蕉MaKUP多肽鏈氨基酸數(shù)量為565～839個，平均值為772個;分子量為63.54～93.82 ku，平均值為86.09 ku;等電點為5.44～9.30，平均值為7.89;外顯子數(shù)量為8～11個，都具有鉀轉運體結構域，蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為32.69～44.29，平均值為39.24，10個為穩(wěn)定蛋白，14個為不穩(wěn)定蛋白（蛋白不穩(wěn)定指數(shù)>40）;脂肪族指數(shù)為105.34～116.90，平均值為109.74;總平均親水性為0.352～0.549，平均值為0.403，都為正值，表明MaKUP蛋白均表現(xiàn)為疏水性（表2）。

2.2 MaKUP基因家族成員在染色體上的定位

對MaKUP基因家族成員在染色體上的位置進行分析，發(fā)現(xiàn)24個MaKUP基因家族成員分布在10條染色體上。MaKUP1在chr01上，MaKUP2在chr02上，MaKUP3和MaKUP4在chr03上，MaKUP5在chr04上，MaKUP6、MaKUP7和MaKUP8在chr05上，MaKUP9～MaKUP12在chr07上，MaKUP13～MaKUP17在chr08上，MaKUP18和MaKUP19在chr09上，MaKUP20和MaKUP21在chr10上，MaKUP22～MaKUP24在chr11上。MaKUP4和MaKUP14，MaKUP6和MaKUP22，MaKUP15和MaKUP23，MaKUP16和MaKUP18存在基因共線性現(xiàn)象（圖1）。

2.3 MaKUP基因家族成員的進化關系和保守基序

進化分析將MaKUP基因家族成員分為4個大類，MaKUP1、 MaKUP3、 MaKUP10、MaKUP12、MaKUP13、MaKUP18、和MaKUP24聚為一類，MaKUP4、MaKUP7、MaKUP8、MaKUP14、MaKUP15、MaKUP20和MaKUP23聚為一類，MaKUP2、MaKUP5、MaKUP6、MaKUP11、MaKUP16、MaKUP17、MaKUP19、MaKUP21和MaKUP22聚為一類，MaKUP9單獨為一類（圖2）。利用MEME在線工具對香蕉MaKUP蛋白的保守基序進行分析，得到10個保守基序，除了MaKUP2以外，都含有10個保守基序（圖2）。

2.4 MaKUP基因家族成員在不同組織和果實發(fā)育不同時期的表達特征

MaKUP基因家族成員在香蕉不同組織和果實不同發(fā)育時期表達量差異較大，其中MaKUP3、MaKUP6和MaKUP7在葉中的表達量較高，MaKUP8、MaKUP15和MaKUP23在根中的表達量較高，MaKUP2、MaKUP4、MaKUP10、MaKUP13、MaKUP14、MaKUP24在花后0 d表達量較高，MaKUP2、MaKUP9、MaKUP13、MaKUP14、MaKUP16、MaKUP17、MaKUP18、MaKUP21在花后20 d表達量較高，MaKUP1和MaKUP19在采后8 d的果中表達量較高，MaKUP5、MaKUP11、MaKUP12、MaKUP20和MaKUP22在采后14 d的果中表達量較高（圖3）。

2.5 MaKUP基因家族成員在低鉀脅迫下的表達特征

采用熒光定量PCR對低鉀脅迫處理0、1、3、6、12、24 h后24個MaKUP基因家族成員在香蕉根尖中的表達特征進行分析，發(fā)現(xiàn)6個MaKUP基因家族成員受到低鉀脅迫的誘導，其表達量逐漸升高，達到峰值后逐漸降低。其中MaKUP1、MaKUP3、MaKUP14、MaKUP20和MaKUP22在低鉀脅迫處理3 h后相對表達量達到峰值，分別是對照的10、12、5、16、4倍;MaKUP21的相對表達量在低鉀脅迫處理12 h后達到峰值，是對照的5倍，在低鉀脅迫處理24 h又迅速降低（圖4）。

3 討論與結論

香蕉是重要的熱帶果樹，其產量和品質與鉀元素含量密切相關，KUP是編碼植物鉀吸收的重要轉運體基因，已在水稻[6]、小麥[7]、棉花[9]等多個作物中被鑒定出來，而在香蕉中尚未見報道。本研究基于香蕉基因組數(shù)據(jù)篩選得到24個MaKUP基因家族成員，經過基因結構、保守結構域和保守基序分析，發(fā)現(xiàn)都含有典型的鉀轉運結構域，鑒定都是鉀轉運體。染色體定位發(fā)現(xiàn)24個MaKUP基因家族成員均

勻分布在10個染色體上，其中8個基因存在基因共線性，這可能是由于基因復制產生的?；驈椭剖录軌驅е轮参锘蚪M中形成大量的重復基因，而重復基因的存在能夠促進基因新功能的進化，增強植物對環(huán)境變化的適應性[18]，8個共線性的基因可能是香蕉適應高鉀需求的一種進化機制。進化樹和保守基序分析發(fā)現(xiàn)MaKUP基因家族成員可分為4個亞類，除了MaKUP2以外，都含有10個保守基序，這表明MaKUP在進化中功能比較保守。

植物的KUP基因廣泛分布在各個組織和器官中，在鉀吸收和轉運中起著重要的作用。在水稻中5個KUP基因（OsHAK2、OsHAK10、OsHAK15、OsHAK23和OsHAK25）在3個品種的所有組織中都有表達[19]，在茶樹中CsHAK3在8個組織中持續(xù)高表達[12]。本研究中發(fā)現(xiàn)MaKUP基因家族成員在香蕉的根、葉、不同發(fā)育時期和不同采后時期的果實中都有表達，不同成員在不同組織中表達差異較大，其中8個MaKUP基因家族成員在香蕉果實發(fā)育前期高表達，7個MaKUP基因家族成員在采后的香蕉果實中高表達，這表明MaKUP基因在果實發(fā)育成熟過程中和鉀元素的轉運中起重要作用，這可能也是香蕉果實鉀含量高的主要原因。

在低鉀脅迫下植物一方面通過增加根系面積提高與土壤的接觸面積，另一方面通過激活高親和鉀吸收系統(tǒng)，增加對鉀的獲取能力[20]。KUP/HAK/KT轉運體家族成員按照對鉀的親和性可分為高親和性鉀轉運體、低親和性鉀轉運體和雙親和性鉀轉運體3類，在植物鉀吸收和長距離運輸中起著重要的作用[2]。AtHAK5是典型的高親和性鉀轉運子，主要定位在擬南芥根部的上皮細胞和中柱中，其表達受到低鉀脅迫的誘導，對根系鉀吸收起著重要的作用[21]。在茶樹中的研究發(fā)現(xiàn)鑒定的21個KUP基因家族成員，其中CsHAK5、CsHAK7、CsHAK8、CsHAK11、CsHAK12、CsHAK18、CsHAK19、CsHAK20和CsHAK21的表達受到低鉀脅迫的誘導[12]。在本研究中6個MaKUP基因（MaKUP1、MaKUP3、MaKUP14、MaKUP20、MaKUP21和MaKUP22）受到低鉀脅迫的誘導，表明這6個MaKUP基因可能是高親和鉀轉運體，在低鉀脅迫下可以通過上調MaKUP基因的表達，提高香蕉對鉀的吸收能力。KUP不僅在植物根吸收鉀中起著重要的作用，還參與葉片對鉀吸收的轉運，在桃葉面噴施鉀肥后PPeKUP1、PPeKUP2和PPeKUP7的表達量顯著上調[22]，在本研究中MaKUP3和MaKUP6在葉片中的表達量明顯高于其他組織，表明這2個基因可能參與香蕉葉片對鉀的吸收。

本研究采用生物信息學方法從香蕉基因組中鑒定出24個MaKUP基因家族成員，表達分析發(fā)現(xiàn)MaKUP基因家族成員在香蕉的根、葉和果中均有表達，其中15個MaKUP基因家族成員在果實發(fā)育中高表達，6個MaKUP基因家族成員受到低鉀脅迫的誘導，表明MaKUP基因在香蕉果實發(fā)育和鉀吸收中具有重要的作用。

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