農(nóng)產(chǎn)品因輻照滅菌效果快速測(cè)試中對(duì)于ATP生物發(fā)光技術(shù)的應(yīng)用

李奎 蔚江濤 牛偉 白俊青 李世超

（1.楊凌核盛輻照技術(shù)有限公司 陜西西安 710100；2.中陜核核盛科技有限公司 陜西西安 710100）

我國農(nóng)產(chǎn)品輻照研究工作與輻照滅菌技術(shù)的應(yīng)用開始于20 世紀(jì)50 年代末，經(jīng)過半個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展，國內(nèi)農(nóng)產(chǎn)品的輻照設(shè)備、輻照技術(shù)、輻照應(yīng)用范圍相對(duì)擴(kuò)大。尤其在網(wǎng)絡(luò)購物方式興起后刺激了農(nóng)產(chǎn)品需求、提升了消費(fèi)者對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)要求。在這種情況下，需要進(jìn)一步增強(qiáng)農(nóng)產(chǎn)品輻照滅菌效果快速測(cè)試，實(shí)現(xiàn)對(duì)其危害與關(guān)鍵點(diǎn)的控制。下面先對(duì)ATP生物發(fā)光技術(shù)作出說明，再對(duì)其應(yīng)用展開分析。

1 ATP生物發(fā)光技術(shù)

ATP中文名為腺苷三磷酸，分子簡(jiǎn)式為A-P～P～P，主要由腺嘌呤、核糖、磷酸基團(tuán)（3 個(gè)）共同構(gòu)成，作為一種高能磷酸化合物發(fā)揮作用。ATP的生成途徑包括光反應(yīng)、細(xì)胞呼吸等。在細(xì)菌中ATP 含量與細(xì)菌量呈正相關(guān)關(guān)系，細(xì)菌死亡后ATP 會(huì)迅速發(fā)生酶降解現(xiàn)象或者擴(kuò)散現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)菌量增大量，細(xì)菌內(nèi)的ATP 含量相對(duì)增大，反之則減小。細(xì)菌在輻照死亡后，ATP會(huì)擴(kuò)散出去。因此，在該特征下，結(jié)合生物發(fā)光（主要是生命活性生物體產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，如螢火蟲等）逐漸形成了可資利用的ATP 生物發(fā)光技術(shù)。簡(jiǎn)單講，就是通過化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，對(duì)ATP進(jìn)行測(cè)定，以此確定測(cè)定對(duì)象中的細(xì)菌量［1］。

例如，在常見的農(nóng)產(chǎn)品脫水蔬菜中，大腸桿菌十分常見。按照我國企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范看，脫水蔬菜中菌落總數(shù)需要控制在每克不大于10000 個(gè)，其中的大腸桿菌MPN 應(yīng)控制在30 個(gè)/100g 的范圍內(nèi)［2］。根據(jù)現(xiàn)階段的研究成果看，普通細(xì)菌中應(yīng)用的輻照劑量往往高于大腸桿菌死亡所需的輻照劑量，因此，在這種情況下，可以針對(duì)脫水蔬菜中的細(xì)菌ATP，采用ATP生物發(fā)光技術(shù)進(jìn)行處理，提高輻照滅菌效果與測(cè)試速度。從實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)看，從2005 年開始，我國在各級(jí)衛(wèi)生監(jiān)督機(jī)構(gòu)中已經(jīng)配置了ATP 發(fā)光檢測(cè)設(shè)備，目前對(duì)其應(yīng)用效率與效用均有所提升。

2 ATP生物發(fā)光技術(shù)的具體應(yīng)用分析

2.1 材料與方法

2.1.1 材料

以某食品企業(yè)生產(chǎn)制造的調(diào)味品為準(zhǔn)，本次研究中選擇的供試材料包括辣椒粉、胡椒粉、脫水蔬菜。試劑以采購方式為準(zhǔn)，購于中國科學(xué)院某植物生理研究所，具體的試劑包括ATP標(biāo)樣、熒光素、熒光素酶。

2.1.2 輻照處理

首先，將劑量率設(shè)置為50Gy/min。其次，在該標(biāo)準(zhǔn)下設(shè)置不同劑量，本次研究中設(shè)置的劑量共計(jì)5個(gè)，分別為0kGy、3.0kGy、6.0kGy、9.0kGy、12.0kGy，按照每個(gè)劑量處理3次的方式進(jìn)行操作。

2.1.3 ATP提取步驟

第一，分別稱取0.5g 辣椒粉、胡椒粉、脫水蔬菜樣品，按照1∶10（m/v）、1∶10（m/v）、1∶20（m/v）的比例混入Tris-EDTA 進(jìn)行混合，制成漿液。本次實(shí)驗(yàn)中選擇的Tris-EDTA 中，Tris 為20mmol/L、EDTA 為2mmol/L，酸堿度為7.75。第二，在沸水浴中，設(shè)置90s煮混合漿液，待其煮沸后即刻進(jìn)行冷卻處理。第三，在離心機(jī)中按照3000r/min的速度對(duì)其進(jìn)行離心處理，共計(jì)3min。第四，將離心后的混合漿液中的上清液取出用于ATP 待測(cè)液。需要說明的是在ATP 發(fā)光強(qiáng)度方面，細(xì)菌ATP大于非細(xì)菌，因此可以活力非細(xì)菌ATP清除步驟。

2.1.4 ATP測(cè)定步驟

首先，取ATP 待測(cè)液200ul 放入反應(yīng)杯，然后將反應(yīng)杯放入SHG-D生物化學(xué)發(fā)光儀中。其次，取熒光素酶-熒光素混合液800μL 注入反應(yīng)杯，蓋好蓋子后，將發(fā)光儀上的溫度設(shè)置為25℃、時(shí)間設(shè)置為10s，測(cè)定ATP 溶液發(fā)光值。在發(fā)光強(qiáng)度表示方面，嚴(yán)格按照相對(duì)發(fā)光單位RLU，將積分值設(shè)置在10s以內(nèi)。

2.2 結(jié)果與分析

2.2.1 待輻照農(nóng)產(chǎn)品含菌量測(cè)定

首先，對(duì)待輻照農(nóng)產(chǎn)品樣品中的非細(xì)菌ATP 發(fā)光強(qiáng)度與ATP發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行比較分析，前者小于后者，節(jié)省了對(duì)非細(xì)菌ATP 清除環(huán)節(jié)。同時(shí)，細(xì)菌ATP 提取時(shí)間共花去90s，其中存在最大發(fā)光強(qiáng)度。另外，在回收率方面進(jìn)行總結(jié)，3種樣品的回收率均在95%以上，試驗(yàn)時(shí)間范圍在1～2h。因此，滿足常規(guī)ATP 提取要求。其次，將試驗(yàn)材料分為6份，每個(gè)樣品均為2份：1份進(jìn)行高壓滅菌、1份不滅菌。將2份樣品混合后配置含菌樣品，測(cè)定細(xì)菌ATP生物發(fā)光與細(xì)菌總數(shù)，建立坐標(biāo)系獲得3種樣品的回歸方程：（1）Y辣椒粉=0.1953X+2.1962；（2）Y胡椒粉=0.3202X+2.4468；（3）Y香蔥粉=1.4367X-3.2850。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，r值分別為0.99、0.98、0.98，均大于0.96（r0.01值）。由此可知，細(xì)菌總數(shù)與細(xì)菌ATP 發(fā)光強(qiáng)度之間存在相關(guān)性。由于溶液顏色對(duì)于ATP發(fā)光強(qiáng)度的影響表現(xiàn)為“色素濃度增大，影響隨之增大”，由此也導(dǎo)致了回歸方程對(duì)應(yīng)曲線斜率方面的差異。

2.2.2 輻照農(nóng)產(chǎn)品含菌量測(cè)定

第一，在0kGy、3.0kGy、6.0kGy、9.0kGy、12.0kGy 劑量下，對(duì)輻照樣品進(jìn)行ATP發(fā)光強(qiáng)度數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，在不同的劑量下，輻照樣品中細(xì)菌ATP提取液發(fā)光強(qiáng)度隨著劑量的增大而增加，發(fā)光強(qiáng)度呈現(xiàn)為先高后低的趨勢(shì)，詳見表1。根據(jù)ATP 生物發(fā)光技術(shù)的基本應(yīng)用原理看，輻照后的農(nóng)產(chǎn)品中的活菌數(shù)是先增后減，結(jié)合實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)看，在壓力蒸汽滅菌條件下，農(nóng)產(chǎn)品含菌量與細(xì)菌ATP發(fā)光強(qiáng)度之間存在一定的線性關(guān)聯(lián)。在輻照條件下，ATP 二者具有相關(guān)性。區(qū)別僅在于輻照滅菌處理?xiàng)l件下，會(huì)對(duì)樣品檢測(cè)過程產(chǎn)生相應(yīng)的影響，而且這種影響可以持續(xù)50d 左右，時(shí)效性相對(duì)較好［3］。

表1 不同輻照劑量下的脫水蔬菜發(fā)光強(qiáng)度與細(xì)菌總數(shù)

第二，從動(dòng)力學(xué)角度分析細(xì)菌ATP生物發(fā)光過程，發(fā)現(xiàn)將熒光素酶-熒光素加入到細(xì)菌ATP 提取液后不久（較短時(shí)間內(nèi)），ATP發(fā)光值達(dá)到最高點(diǎn)，滿足動(dòng)力學(xué)方程。具體分析中主要是采用直線化處理辦法，將動(dòng)力學(xué)方程處理為直線方程，然后對(duì)其發(fā)光曲線動(dòng)態(tài)變化情況進(jìn)行測(cè)定分析，進(jìn)而反映出發(fā)光過程受到的影響程度。操作如下：（1）對(duì)A=A0e-Kt（k 為常數(shù)）進(jìn)行直線化處理，得 到InA=InA0-kt。（2）假定Y=InA，Y0=InA0，得到Y(jié)=Y0-kt。（3）假定測(cè)量時(shí)間間隔為4s，可以對(duì)其進(jìn)行連續(xù)性測(cè)定，詳見表2。結(jié)果顯示處理后的樣品內(nèi)細(xì)菌ATP發(fā)光強(qiáng)度衰減速度快。既符合ATP生物發(fā)光技術(shù)的原理，也與本次實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果趨于一致。根據(jù)數(shù)值統(tǒng)計(jì)結(jié)果看，當(dāng)輻照劑量為5.0kGy 時(shí)達(dá)到了最大值，之后處于降低趨勢(shì)。

表2 農(nóng)產(chǎn)品輻照條件下對(duì)細(xì)菌ATP 生物發(fā)光影響

第三，輻照處理產(chǎn)生的影響情況看，在應(yīng)用ATP生物發(fā)光技術(shù)時(shí)主要是依賴于添加的熒光素酶-熒光素。從特征看，該物質(zhì)具有較高的特異性與靈敏度，當(dāng)其加入到ATP 提取液之后，ATP 的濃度也隨發(fā)光強(qiáng)度的變化而變化［4］。由于本次研究中采用的輻照以γ射線為主，所以在輻照條件下對(duì)其發(fā)光強(qiáng)度變化與ATP 濃度之間的關(guān)系可以通過γ射線做進(jìn)一步分析。用紫外分光光度計(jì)對(duì)樣品中ATP 含量檢測(cè)時(shí)，當(dāng)紫外線波長(zhǎng)為260nm，ATP 在吸收紫外線方面對(duì)其具有較好的吸收性，同時(shí)當(dāng)吸光值增大時(shí)，也表明其中的ATP 含量較大，由此可知其中的含菌量較大。反之，當(dāng)吸光值變小時(shí)，則會(huì)出現(xiàn)活菌量較小的現(xiàn)象。因此從關(guān)系方面看，紫外線與樣品ATP含量呈現(xiàn)為負(fù)相關(guān)關(guān)聯(lián)。在電離輻射時(shí)選擇γ射線，統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示劑量增大時(shí)，其中的ATP含量因吸收了γ射線而相應(yīng)減少。因此在輻照條件下，ATP含量不會(huì)增大，反而會(huì)因輻照時(shí)間的延長(zhǎng)、輻照被吸收量的增大而減少。

第四，從干擾方面分析，待輻照樣品含菌在輻照條件下主要受到γ 射線影響，因此在整個(gè)過程中可能會(huì)產(chǎn)生一定的干擾。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其受干擾情況，本次研究中，對(duì)存放了半年的γ 射線輻照產(chǎn)品進(jìn)行了拆包檢驗(yàn)（即對(duì)本次研究3 種樣品一樣、保質(zhì)時(shí)間在180d 后的產(chǎn)品進(jìn)行了1∶1 比例的滅菌分析），結(jié)果顯示：3 種樣品與拆包檢驗(yàn)的產(chǎn)品之間均無明顯差異。由此可見，γ 射線對(duì)于輻照過程的ATP 生物發(fā)光不存在干擾［5］。

為了查找可能的干擾源，經(jīng)查閱讀資料與交流經(jīng)驗(yàn)后，認(rèn)為對(duì)于細(xì)菌ATP 提取液發(fā)光值產(chǎn)生干擾的因素，可能來自輻照后的細(xì)菌所致。因此，以3種樣品為準(zhǔn)，先用生理鹽水（5%）對(duì)樣品進(jìn)行未滅菌之前的洗脫處理，然后將其放置在培養(yǎng)箱中（溫度設(shè)置為25℃）靜置3d再對(duì)其進(jìn)行輻照處理，經(jīng)對(duì)樣品細(xì)菌ATP提取液進(jìn)行測(cè)定分析發(fā)現(xiàn)，ATP 提取液中的發(fā)光值存在異常［6］。另外，考慮到加入熒光素酶-熒光素反應(yīng)液后出現(xiàn)了干擾現(xiàn)象，所以對(duì)加入反應(yīng)液與未加入反應(yīng)液的樣品細(xì)菌ATP 提取液進(jìn)行了對(duì)比分析，雖然沒有獲得明顯證據(jù)，但是并不能排除直接購買的反應(yīng)液中存在某些脫酸激酶存在。因此，在后續(xù)的研究中，仍然需要對(duì)直接購置的反應(yīng)液進(jìn)行專業(yè)研究與實(shí)驗(yàn)分析，搞清楚在應(yīng)用ATP生物發(fā)光技術(shù)時(shí)潛在的干擾源等。

3 結(jié)語

綜上所述，農(nóng)產(chǎn)品生長(zhǎng)于土壤環(huán)境，攜帶著各種細(xì)菌，食用后會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的危害。因此，在現(xiàn)代農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)制造、加工儲(chǔ)存中，普遍應(yīng)用了輻照滅菌技術(shù)保障其安全。為了有效達(dá)到對(duì)此類技術(shù)的應(yīng)用效用，在常用的輻照滅菌技術(shù)方面，可以結(jié)合ATP 生物發(fā)光技術(shù)開展微生物檢驗(yàn)，提高農(nóng)產(chǎn)品輻照滅菌效果的快速測(cè)試效率，從而保障輻照滅菌技術(shù)的應(yīng)用效用。結(jié)合以上初步分析可以看出，輻照農(nóng)產(chǎn)品樣品測(cè)定中細(xì)菌總數(shù)與細(xì)菌ATP 發(fā)光強(qiáng)度之間存在相關(guān)性，輻照滅菌處理?xiàng)l件下，ATP 生物發(fā)光技術(shù)會(huì)對(duì)樣品檢測(cè)過程產(chǎn)生相應(yīng)的影響，造成這種影響的因素可能來自反應(yīng)液質(zhì)量與滅菌后的細(xì)菌感染。因此，應(yīng)該對(duì)其開展進(jìn)一步研究。