豬傳染性胸膜肺炎病原的分離鑒定試驗(yàn)

冀 威

（朝陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 朝陽(yáng) 122000）

豬傳染性胸膜肺炎由胸膜肺炎放線桿菌引起，又稱豬接觸性傳染性胸膜肺炎，以呼吸道癥狀為主要表現(xiàn)形式，具有高度傳染性。典型癥狀有出血性纖維素性胸膜肺炎和慢性纖維素性壞死性胸膜肺炎，急性型表現(xiàn)高死亡率。各年齡和性別的豬都易感，以6 周齡～6 月齡的豬常見，3 月齡仔豬易感性最強(qiáng)，死亡率可達(dá)到80%～100%。病豬和帶菌豬是傳染源，如種公豬和慢性經(jīng)過帶菌豬?？諝怙w沫傳播和生物媒介傳播是最主要傳播途徑。鳥和嚙齒類動(dòng)物可攜帶病原菌進(jìn)行傳播。本病季節(jié)性明顯，和4～5 月每年9～11 月多發(fā)。飼養(yǎng)環(huán)境惡劣、轉(zhuǎn)群、運(yùn)輸、通風(fēng)、溫度、濕度、密度等應(yīng)激因素都是誘發(fā)本病的原因。本研究成功從朝陽(yáng)某豬場(chǎng)病豬扁桃體和肺部分離到了一株豬胸膜肺炎放線桿菌，對(duì)病原進(jìn)行分離鑒定，通過藥敏試驗(yàn)，篩選出敏感藥物并制定了適合本地區(qū)的綜合防控方案，對(duì)本病的防控和治療有一定積極作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 （1）病料：2021 年3 月份，朝陽(yáng)某豬場(chǎng)3 月齡左右的豬出現(xiàn)精神沉郁，采食量下降，發(fā)熱，皮膚發(fā)紅，不愿不穩(wěn)，不愛運(yùn)動(dòng)，個(gè)別呼吸困難，咳嗽，犬坐。耳、鼻及四肢皮膚呈藍(lán)紫色淤青，呼吸困難張口呼吸，體溫上升，出現(xiàn)典型癥狀短期內(nèi)快速死亡。剖檢可見肺臟表面有纖維素性附著物和出現(xiàn)紫紅色肝樣變，胸膜厚，胸膜炎癥狀明顯。無菌采集肺、肝脾、腎、氣管和鼻腔分泌物病料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。

（2）試劑材料：蛋白酶K、胰蛋白陳、SDS(十二烷基磺酸鈉)、NAaC(醋酸鈉)、冰乙酸、苯酚、氯仿、異戊醇、無水乙醇、氯化鎂、PEG 等為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品。

（3）培養(yǎng)基：以牛腦心浸汁為基礎(chǔ)，巧克力瓊脂、綿羊鮮血瓊脂、SS 瓊脂、麥康凱、馬丁肉湯培養(yǎng)基。

（4）試驗(yàn)動(dòng)物：小白鼠在體重18～20g（5 只）；70 日齡健康豬3 頭。

（5）主要儀器：離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、凈化工作臺(tái)、振蕩培養(yǎng)箱、冰箱、電熱恒溫水浴鍋、微量加樣器、普通光學(xué)顯微鏡、微波爐、培養(yǎng)皿、三角瓶等、一次性注射器若干。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 顯微鏡觀察 首先，將無菌采取的病料均勻涂在玻璃片上，并進(jìn)行革蘭染色，找到清晰視野通過顯微鏡觀察菌體特點(diǎn)，并做好記錄。

1.2.2 分離培養(yǎng) 首先用0.01%V 因子巧克力瓊脂培養(yǎng)基劃線接種病料，實(shí)驗(yàn)室恒溫37℃條件下進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)24h。挑取菌落革蘭氏染色，觀察細(xì)菌形態(tài)和染色特性。然后用10%牛血清和100μg/mLNAD馬丁肉湯做培養(yǎng)培養(yǎng)上述可疑菌落進(jìn)行分離純化，實(shí)驗(yàn)室恒溫37℃培養(yǎng)24h，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基同步接種該菌落，詳細(xì)觀察菌落特征。

1.2.3 培養(yǎng)特性 純化的菌株接種到普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、SS 培養(yǎng)基、添加V 因子血平板培養(yǎng)基、巧克力培養(yǎng)基上，于37℃恒溫含有10%CO2條件下培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

1.2.4 NAD 依賴性試驗(yàn) 含有馬血清和NAD 營(yíng)養(yǎng)肉湯和不含馬血清和NAD 營(yíng)養(yǎng)肉湯當(dāng)作實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)124h，記錄結(jié)果。

1.2.5 衛(wèi)星現(xiàn)象 純化后細(xì)菌接種到加輔酶A 胰蛋白胨劃有葡萄球菌十字線大豆肉湯瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24～36h。

1.2.6 CAMP 試驗(yàn) 垂直劃線可疑菌和金黃色葡萄球菌于血平板上，兩條線盡量靠近37℃培養(yǎng)18～24h。若金黃色葡萄球菌和APP 劃線交界處出現(xiàn)三角形或煙頭狀溶血帶，可判定為疑似胸膜肺炎放線桿菌。

1.2.7 生化試驗(yàn) 挑取純化后的疑似菌，接種葡萄糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、山梨醇、靛基質(zhì)、甘露醇、MR、VP、尿素酶、硫化氫生化試劑及微量生化鑒定管，生化培養(yǎng)基中分別加入NAD，待檢菌接入其中，37℃培養(yǎng)18h。

1.2.8 血清學(xué)試驗(yàn) 血清學(xué)實(shí)驗(yàn)采用瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)。（1）實(shí)驗(yàn)材料 APPI～12 型標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性因子血清做定性用診斷血清；酚水待檢抗原。

（2）抗原制備 將各型標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離菌株分別接種于TSA 瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，用PBS洗掉菌落，離心機(jī)5000r/min，10min 洗滌1 次，將上清晰棄掉，用68℃去離子水進(jìn)行稀釋混勻，再加入等體積的68℃平衡酚，68℃恒溫進(jìn)行水浴并進(jìn)行攪拌20min。再進(jìn)行冰浴冷卻至4℃，離心機(jī)7000r/min，離心20min 獲得水相。沉淀后再加入與第一次等量的68℃去離子水，重復(fù)上述過程。將兩次水相均勻混合即得診斷分型抗原。

（3）瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 1g 瓊脂粉，100mLPBS 緩沖液，加入三角燒瓶加熱至溶化，經(jīng)高壓滅菌加入終濃度為0.01%疊氮鈉。用1%瓊脂溶液制成3mm 厚瓊脂板，待瓊脂凝固完全，平板上打梅花孔，挑出中間瓊脂塊加入玻璃器皿中再用酒精燈加熱融化封底。梅花孔中間孔加抗原，邊緣各孔加注其他各型抗體。將準(zhǔn)備好瓊脂平板37℃恒溫?cái)U(kuò)散。設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)株抗原對(duì)照和陰性血清對(duì)照組。36h 觀察記錄。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)出現(xiàn)沉淀線判定為陽(yáng)性，相反則判定為陰性。

1.2.9 攻毒試驗(yàn) （1）小鼠試驗(yàn) 將上述病原菌純化懸濁液，注射到3 只體重18～20g 小白鼠腹腔內(nèi)，劑量每只0.3mL，對(duì)照組2 只小白鼠腹腔注射0.3mL 無菌馬丁肉湯培養(yǎng)液，24h 后觀察小鼠狀態(tài)，無菌采集死亡小鼠肺、肝、脾等涂片染色鏡檢。

（2）病例復(fù)制試驗(yàn) 事先準(zhǔn)備好的3 頭健康豬隨機(jī)分試驗(yàn)組2 頭，對(duì)照組1 頭。試驗(yàn)組將5mL分離菌株滴鼻，對(duì)照組5mL 滅菌的生理鹽水滴鼻，同等條件下不同圈舍飼養(yǎng)并觀察臨床癥狀表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組致死病豬立即進(jìn)行解刨。同上述方法無菌采集病料進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，觀察不同組織器官中細(xì)菌分離情況。

1.2.10 藥敏試驗(yàn) 特制的牛腦心浸汁瓊脂平板均勻涂上通過實(shí)驗(yàn)所得的胸膜肺炎放線桿菌的菌株，用鑷子夾取不同藥敏紙片貼于平板上輕輕壓實(shí)，37℃培養(yǎng)18～24h，觀察并記錄藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 形態(tài)染色特性 采集病料通過革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn)革蘭陰性，有莢膜，無芽孢的短小桿菌。

2.2 細(xì)菌分離及形態(tài)鑒定結(jié)果 （1）純化后菌體在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、SS 培養(yǎng)基上均不能生長(zhǎng)；巧克力瓊脂培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基上可以生長(zhǎng)，可觀察到透明、細(xì)小、米粒大小圓形露珠樣粘液菌落，菌落直徑約1～2mm；含有V 因子普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出乳白色米粒大小特征菌落。

（2） NAD 依賴性試驗(yàn)結(jié)果：有在馬血清和NAD 營(yíng)養(yǎng)肉湯中細(xì)菌能生長(zhǎng)，沒有不能生長(zhǎng)。

（3）衛(wèi)星現(xiàn)象試驗(yàn)結(jié)果：待檢菌在滋養(yǎng)菌生長(zhǎng)線附近密集生長(zhǎng)距離滋養(yǎng)線越遠(yuǎn)越稀疏最終消失殆盡的衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象。

（4）CAMP 試驗(yàn)結(jié)果：劃有金黃色葡萄球菌十字線處呈現(xiàn)典型煙蒂狀溶血帶(分離菌與葡萄球菌協(xié)同溶血所呈現(xiàn)出的表象)。判定陽(yáng)性結(jié)果即分離菌為CAMP。

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果 通過生化實(shí)驗(yàn)分離菌能發(fā)酵木糖、葡萄糖、麥芽糖；山梨醇、甘露醇、靛基質(zhì)、MR、VP 不能生長(zhǎng)；尿素酶實(shí)驗(yàn)?zāi)芊纸饽蛩禺a(chǎn)生氨和CO2；蔗糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果不確定；不能產(chǎn)生H2S。（見表1）。

表1 分離菌株生化實(shí)驗(yàn)

2.4 血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清3 型出現(xiàn)沉淀線，其他陽(yáng)性均無沉淀線出現(xiàn)，判定分離株血清型為3 型。

2.5 攻毒試驗(yàn)結(jié)果 （1）試驗(yàn)組小白鼠活動(dòng)變?nèi)酰幻Q立蜷縮，呼吸加快，18h 時(shí)開始出現(xiàn)死亡，48h內(nèi)全部死亡；對(duì)照組沒有死亡小鼠。死亡小鼠采集肝、脾、肺病料涂片染色鏡檢可見大量革蘭染色陰性短小桿菌。（2）攻毒后被感染仔豬先后出現(xiàn)不同程度的精神沉郁、食欲下降或者廢絕，喜臥運(yùn)動(dòng)下降，噴嚏，發(fā)熱體溫41℃，張口呼吸，犬坐姿勢(shì)，無毛少毛處如耳、鼻、腿、腿側(cè)皮膚發(fā)紺，個(gè)別豬有腹瀉癥狀。（3）解剖病死豬可見典型豬傳染性胸膜肺炎癥狀，出現(xiàn)胸膜肺炎，打開胸腔有淡黃色液體流出，胸膜有纖維素附著，肺臟、橫隔膜粘在一起界限不清，支氣管內(nèi)大量泡沫狀液體，心包變厚有大量液體滲出，心內(nèi)膜和外膜上可見纖維素樣附著物，肝臟暗紅色充血腫大，被膜緊張，表面有壞死灶。（4）接種豬血液、糞、器官中APP 的分離結(jié)果 是肺臟和扁桃體中病原菌分離率最高，為6/6，心血、氣管分泌物次之，未在腎臟和腸系膜淋分離到APP。

2.6 藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果 用分離到的APP 進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果（見表2）。

表2 分離菌株對(duì)10 種藥物的敏感性 單位：mm

（1）該菌對(duì)頭孢噻肟、氧氟沙星、氟苯尼考、替米考星、諾氟沙星極度敏感；青霉素低度敏感；對(duì)鏈霉素不敏感；其他藥物效果不一致。

（2）藥敏實(shí)驗(yàn)顯示，各種藥物對(duì)分離菌抑制作用差異很大，所以做藥敏實(shí)驗(yàn)要選用本地菌株，篩選出的敏感藥物只適用當(dāng)?shù)鼐?，?shí)際應(yīng)用時(shí)要選擇敏感且廉價(jià)藥物。

3 討 論

3.1 本次試驗(yàn)從朝陽(yáng)某發(fā)病豬場(chǎng)病例中分離到一株豬胸膜肺炎放線桿菌，通過藥敏試驗(yàn)，找出了有效且廉價(jià)藥物，降低了用藥成本又提高了治療效果。

3.2 不同品種、年齡的豬對(duì)胸膜肺炎放線桿菌都有易感性，以6 周齡～5 月齡斷奶后仔豬發(fā)病較為常見，占50%以上，季節(jié)性較明顯，東北地區(qū)從10 月份至次年的5 月，氣溫較低或溫差較大季節(jié)發(fā)病較多。

3.3 本次實(shí)驗(yàn)分離到的胸膜肺炎防線桿菌，對(duì)藥物敏感實(shí)驗(yàn)篩選出的藥物敏感。

3.4 通過臨床診斷實(shí)驗(yàn)室確診判定該豬場(chǎng)疫情為豬傳染性胸膜肺炎，致病菌血清型為3 型。

4 防 控

4.1 頭孢噻肟、氟苯尼考、替米考星、諾氟沙星等為本次分離株的敏感藥物，對(duì)病情控制良好。

4.2 本場(chǎng)防控經(jīng)驗(yàn)表明，篩選敏感藥物和強(qiáng)化飼養(yǎng)管理都非常重要，應(yīng)合理控制密度、加強(qiáng)通風(fēng)，及時(shí)處理病死豬和消滅傳染源，保持圈舍清潔。

4.3 加強(qiáng)生物安全防控。選擇無菌公豬或后備母豬，防止引進(jìn)帶菌豬;采用“全進(jìn)全出”飼養(yǎng)方式，做好空欄管理，空欄要一周以上。

4.4 發(fā)生過本病豬場(chǎng)要定期進(jìn)行抗體檢測(cè)，及時(shí)淘汰病豬，制定合理藥物防治計(jì)劃，建立健康豬群。

4.5 免疫接種 該病不是強(qiáng)制免疫接種疾病，有商品化滅活疫苗可用。首免選擇5～8 周齡，二免2～3周后。母豬免疫要在產(chǎn)前4 周。有條件制作自家滅活苗效果更好。