尿酸氧化酶固定化應(yīng)用于高尿酸血癥研究進(jìn)展

汪志偉，任夢飛，夏覓真，吳琳梅

尿酸氧化酶固定化應(yīng)用于高尿酸血癥研究進(jìn)展

汪志偉，任夢飛，夏覓真，吳琳梅

（安徽醫(yī)科大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230032）

高尿酸血癥是嚴(yán)重影響身體健康和生活質(zhì)量的一大疾?。蛩嵫趸福║OX）能夠催化尿酸生成水溶性尿素囊，從而降低尿酸水平，起到治療高尿酸血癥的作用．但是，UOX作為一種外源性蛋白質(zhì)，存在體內(nèi)穩(wěn)定性低、半衰期短、抗原性強(qiáng)、治療價格高等問題，限制了其在臨床上的使用．通過酶的固定化技術(shù)，可以克服UOX的缺點(diǎn)，擴(kuò)大其在治療高尿酸血癥上的應(yīng)用．對UOX的固定化及其應(yīng)用于高尿酸血癥的相關(guān)研究進(jìn)行綜述，旨在為UOX類藥物開發(fā)提供參考．

高尿酸血癥；尿酸氧化酶；固定化酶；載體材料

高尿酸血癥是嘌呤代謝紊亂引起的代謝異常綜合征，指在正常的嘌呤飲食狀態(tài)下，無論男女，非同日2次血尿酸水平超過420 μmol/L（7 mg/dL）[1]．近年來，隨著生活方式的改變，我國高尿酸血癥的發(fā)病率明顯上升且呈年輕化趨勢．研究顯示，我國成人高尿酸血癥的患病率高達(dá)13.3%，約有1.7億高尿酸血癥患者[2]．因此，高尿酸血癥已經(jīng)成為嚴(yán)重影響我國居民身體健康和生活質(zhì)量的一大疾病，有效降低體內(nèi)尿酸水平是治療高尿酸血癥的關(guān)鍵．尿酸是嘌呤化合物代謝的最終產(chǎn)物，主要以尿酸鹽陰離子的形式存在于循環(huán)中．人體內(nèi)的尿酸約2/3經(jīng)腎臟排泄，1/3經(jīng)膽道和腸道排泄[3]．在正常生理和嘌呤飲食狀態(tài)下，尿酸的產(chǎn)生和排泄保持動態(tài)平衡，當(dāng)其代謝平衡被打破則導(dǎo)致高尿酸血癥的發(fā)生．目前，治療高尿酸血癥的藥物有３大類[4-8]．但相關(guān)藥物都存在一些弊端，如丙磺舒、苯溴馬隆可引起尿酸鹽晶體在尿路的沉積，導(dǎo)致腎絞痛和腎功能損害[7]438；非布索坦有較高的心血管事件發(fā)生率[9]．因此，研發(fā)療效好、副作用小的治療高尿酸血癥的新藥迫在眉睫．

尿酸氧化酶（Urate oxidase，UOX）是一種在嘌呤代謝途徑中催化尿酸氧化的酶，其可將尿酸催化氧化生成惰性水溶性嘌呤代謝物——尿素囊，從而達(dá)到降低尿酸的目的．但是，在靈長類動物漫長的進(jìn)化過程中，人的UOX基因編碼33和187位精氨酸密碼子無義突變成終止密碼子，故人體不能合成有活性的UOX[10]．因此，外源性UOX在治療高尿酸血癥上的價值受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注．目前，已經(jīng)商業(yè)化的UOX已歷經(jīng)３代發(fā)展：第１代UOX制劑又稱非重組酶制劑，如由Sanofi Winthrop公司生產(chǎn)并在法國上市的UOX制品uricozyme[11]；第２代重組UOX，如由Sanofi-Synthelabo公司開發(fā)的rasburicase[12]；第３代聚乙二醇修飾的重組UOX，如2010年FDA批準(zhǔn)的pegloticase[13]．雖然，UOX作為分解尿酸的生物制劑已被批準(zhǔn)上市，但是UOX作為一種外源性蛋白質(zhì)，存在易被體內(nèi)酶水解、穩(wěn)定性低、半衰期短等蛋白質(zhì)藥物的共同缺點(diǎn)[14]，除此之外，UOX藥物存在價格高昂，抗原性較強(qiáng)，易產(chǎn)生過敏反應(yīng)等問題，極大地限制了UOX在臨床上的使用[15]．

近年來，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展以及學(xué)科間的相互滲透，大量研究發(fā)現(xiàn)通過將UOX固定化，可以克服上述缺點(diǎn)，擴(kuò)大其在治療高尿酸血癥上的應(yīng)用．與游離酶相比，固定化酶不易被體內(nèi)或體外的蛋白酶分解，半衰期延長，而且能大大降低酶的免疫原性[16]．因此，本文綜述了固定化UOX在治療高尿酸血癥中的應(yīng)用，為UOX藥物的研發(fā)提供一定的參考．

1　固定化方法

傳統(tǒng)的固定化技術(shù)主要分為吸附、共價結(jié)合、包埋和交聯(lián)4大類[17]189．除此之外，UOX的固定化還出現(xiàn)了一些新方法．

1.1　逆向蒸發(fā)法固定化

逆向蒸發(fā)法固定化方法主要是將磷脂等膜材料溶于有機(jī)溶劑（如氯仿）中，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮發(fā)有機(jī)溶劑得到薄膜．薄膜通過有機(jī)溶劑（如乙醚）再分散，然后加入含有UOX的溶液，二者混合后進(jìn)行超聲，直到形成穩(wěn)定油包水乳狀液，減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，得到固定化的UOX．目前，逆向蒸發(fā)法主要用于制備脂質(zhì)體固定的UOX[18-21]．

1.2　復(fù)乳法固定化

復(fù)乳法固定化方法先將磷脂材料溶于適量的有機(jī)溶劑中得到油相（O），內(nèi)水相（W）主要是含有UOX的水溶液，將內(nèi)水相與油相按照一定體積混合均勻，形成W/O型初乳．再將初乳加入到外水相溶液中，二者混合后，在高速分散均質(zhì)機(jī)快速剪切形成復(fù)乳，將復(fù)乳置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中除去有機(jī)溶劑，最終得到固定化的UOX[22]．

1.3　納米花型雜交晶體固定化

納米花型固定化酶指的是酶分子直接與無機(jī)鹽晶體雜交形成具有類似天然花卉形態(tài)結(jié)構(gòu)的復(fù)合體，通過一步法獲得固定化酶的技術(shù)手段[17，23]．如在無機(jī)磷酸氫鈣形成的過程中引入UOX，得到納米花固定化UOX[24]952．

2　固定化載體的選擇

2.1　脂質(zhì)體固定尿酸氧化酶

脂質(zhì)體主要由磷脂和膽固醇組成，結(jié)構(gòu)類似于生物膜的囊泡[25]．脂質(zhì)體固定UOX呈類球形，且當(dāng)磷脂與膽固醇的摩爾比為1∶1時，UOX的包封率最大[19]29．體內(nèi)尿酸清除研究表明，尾靜脈注射脂質(zhì)體固定UOX約9 h后，模型鼠體內(nèi)尿酸下降到正常水平；較游離UOX而言，縮短了4倍用時．值得一提的是，脂質(zhì)體進(jìn)行修飾后再固定化UOX，可實(shí)現(xiàn)多組分協(xié)同治療．如透明質(zhì)酸修飾的脂質(zhì)體固定UOX[26-27]，能夠起到降低尿酸和抗炎的作用．

2.2　聚合物固定尿酸氧化酶

早期，天然多糖高分子聚合物被應(yīng)用于UOX的固定化．如UOX固定于交聯(lián)羧甲基淀粉表面[28]．近年來，合成聚合物在固定UOX展現(xiàn)一定潛能．ZHANG X[29]等將UOX丙烯酰化，并以其為“核”，然后以N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）作為自由基聚合，單體N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺（BIS）作為交聯(lián)劑，得到核殼結(jié)構(gòu)固定化酶UOX/PVP．相對于游離UOX而言，UOX/PVP在血液中的循環(huán)時間提高了10倍；尾靜脈注射UOX/PVP（25 U/kg）1 d后，高尿酸模型鼠血清尿酸濃度由（1 600±5）μmol/L降為（225±63.7）μmol/L．

嵌段共聚物（Pluronic，NC）是一類具有多種作用的有效藥物遞送系統(tǒng)，其形成的膠束體系能夠有效裝載各種生物大分子和金屬納米材料[30]．Kim[31]等將UOX和金納米顆粒（AuNP）共同包封到NCs中，得到UOX-AuNP@NCs，UOX的裝載效率超過90%．體外實(shí)驗(yàn)表明，UOX-AuNP@NCs降解的尿酸量顯著增加，在高尿酸血癥小鼠模型中表現(xiàn)出了更長的血清半衰期．

2.3　自組裝空心納米微球固定尿酸氧化酶

自組裝空心納米微球（UHPHD）是一種新型的載體，酶可包載于空心納米囊中，從而實(shí)現(xiàn)固定化．鄧雪[32-33]等將UOX裝載于聚乙二醇-透明質(zhì)酸/磺丁基--環(huán)糊精形成的UHPHD中，并對其藥代動力學(xué)和生物等效性初步研究．結(jié)果表明，游離UOX的半衰期為（0.89±0.25）h，UHPHD固定UOX的半衰期為（8.35±5.95）h，延長了8.4倍，固定化UOX的生物利用度和抗胰蛋白酶水解能力增強(qiáng)．

2.4　納米花固定尿酸氧化酶

納米花型固定化酶只需一步反應(yīng)便能完成載體合成及酶的固定化，具有極大的發(fā)展和應(yīng)用潛力[34]．Hao Y[24]等利用納米花型態(tài)的無機(jī)磷酸氫鈣共固定UOX和辣根過氧化物酶（HRP），得到UOX&HRP-CaHPO4，并采用微針系統(tǒng)將其遞送到高尿酸血癥模型鼠體內(nèi)．結(jié)果表明，9 h后血清尿酸可降到正常水平．UOX催化尿酸氧化生成尿囊素、CO2和H2O2．然而，大量H2O2在人體內(nèi)會引起嚴(yán)重的副作用．UOX&HRP-CaHPO4實(shí)現(xiàn)降低尿酸的同時通過HRP催化作用清除生成的H2O2．

2.5　水凝膠固定尿酸氧化酶

水凝膠是以水為分散介質(zhì)的，具有三維空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體系，在酶的固定化上應(yīng)用廣泛．Cho[35]等設(shè)計了一種由聚乙二醇-聚（-氨基酯聚氨酯）（PEG-PAEU）共聚物組成的含白蛋白結(jié)合肽（ABP）的可注射水凝膠，用于固定人血清白蛋白（HSA）修飾的UOX（UOX-HSA），并利用水凝膠結(jié)構(gòu)中HSA與ABP之間的強(qiáng)特異性相互作用來延長酶的釋放．結(jié)果表明，PEG-PAEU-ABP固定UOX-HSA半衰期約為96 h，較游離UOX提高了88倍．

3　結(jié)語

UOX通過固定化后，其穩(wěn)定性、半衰期、生物利用率等得到了很大的提高，同時外源蛋白質(zhì)引起的免疫原性降低．固定化載體材料從天然聚合物發(fā)展到脂質(zhì)體、納米花和水凝膠．通過透皮給藥方式治療可以選擇水凝膠固定UOX；聚合物、脂質(zhì)體、納米花對固定UOX展現(xiàn)出較高的包封率和酶活，但是作為治療性固定化酶，其生物安全性評價還有待系統(tǒng)地研究．未來固定化UOX的研究可以考慮２個方面：（1）目前固定化UOX主要是通過靜脈注射的方式給藥，作用部位在肝臟和腎臟，長期的藥物治療會引起肝腎功能損傷．鑒于尿酸在腸液中有較高的分布，通過腸道途徑降低血尿酸具有可行性[36]．但是，UOX在偏酸性條件下活性較低．因此，可通過固定化技術(shù)，提高UOX在酸性條件下酶活性，為口服UOX類制劑的研發(fā)提供新方向．（2）載體材料進(jìn)行功能化的修飾，構(gòu)建多酶體系結(jié)合的固定化酶，同時發(fā)揮載體與酶以及不同酶之間的協(xié)同作用．

[1] 中華醫(yī)學(xué)會內(nèi)分泌學(xué)分會．中國高尿酸血癥與痛風(fēng)診療指南（2019）[J]．中華內(nèi)分泌代謝雜志，2020，36（1）：1-13．

[2] LIU R，HAN C，WU D，et al．Prevalence of hyperuricemia and gout in mainland China from 2000 to 2014：a systematic review and meta-analysis[J]．Biomed Res Int，2015，2015：1-12．

[3] DE OLIVEIRA E P，BURINI R C．High plasma uric acid concentration：causes and consequences[J]．Diabetology & metabolic syndrome，2012，4（1）：1-7．

[4] 謝麗玲，賀盼攀，秦獻(xiàn)輝，等．高尿酸血癥治療的研究進(jìn)展[J]．生物醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化，2021，2（4）：34-40．

[5] SCHLESINGER N．Management of acute and chronic gouty arthritis[J]．Drugs，2004，64（21）：2399-2416．

[6] LOVE B L，BARRONS R，VEVERKA A，et al．Uratelowering therapy for gout：focus on febuxostat[J]．Pharmacotherapy：The Journal of Human Pharmacology and Drug Therapy，2010，30（6）：594-608．

[7] 張瑞芬，趙晶．痛風(fēng)的藥物治療現(xiàn)狀及展望[J]．解放軍藥學(xué)學(xué)報，2007，23（6）：438-441．

[8] PUI C H．Rasburicase：a potent uricolytic agent[J]．Expert opinion on pharmacotherapy，2002，3（4）：433-442．

[9] WHITE W B，SAAG K G，BECKER M A，et al．Cardiovascular safety of febuxostat or allopurinol in patients with gout[J]．New England Journal of Medicine，2018，378（13）：1200-1210．

[10] 謝光蓉，趙百學(xué)，王旻，等．人尿酸氧化酶進(jìn)化機(jī)制研究[J]．藥物生物技術(shù)，2014，21（4）：287-292．

[11] 黃琳秋，江筠，樓覺人．尿酸氧化酶臨床療效和安全性評價[J]．國際生物制品學(xué)雜志，2016，39（2）：92-96．

[12] DIGUMARTI R，SINHA S，NIRNI SS，et al．Efficacy of rasburicase（recombinant urate oxidase）in the prevention and treatment of malignancy-associated hyperuricemia：an Indian experience[J]．Indian J Cancer，2014，51（2）：180-183．

[13] VADHAN-RAJ S，F(xiàn)AYAD LE，F(xiàn)ANALE MA，et al．A randomized trial of a single-dose rasburicase versus five-daily doses in patients at risk for tumor lysis syndrome[J]．Ann Oncol，2012，23（6）：1640-1645．

[14] 周蕊，劉欣，曾波，等．疾病治療及藥物制備用酶的研究進(jìn)展[J]．生物工程學(xué)報，2021，37（7）：2256-2271．

[15] 王亞鵬，路建光，馬潔，等．尿酸氧化酶類藥物的研究進(jìn)展[J]．中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2020，51（9）：1107-1117．

[16] KISHIMOTO T K，F(xiàn)ERRARI J D，LAMOTHE R A，et al．Improving the efficacy and safety of biologic drugs with tolerogenic nanoparticles[J]．Nat Nanotechnol，2016，11（10）：890-899．

[17] 柯彩霞，范艷利，蘇楓，等．酶的固定化技術(shù)最新研究進(jìn)展[J]．生物工程學(xué)報，2018，34（2）：188-203．

[18] 周云莉，何丹，張敉，等．用Bicine-NaOH緩沖液制備的尿酸酶復(fù)合納米脂質(zhì)體中尿酸酶的生化特性[J]．華西藥學(xué)雜志，2015，30（5）：543-546．

[19] TAN Q Y，WANG N，YANG H，et al．Preparation and characterization of lipid vesicles containing uricase[J]．Drug delivery，2010，17（1）：28-37．

[20] 楊蘭，周云莉，李瑤，等．尿酸酶-過氧化氫酶脂質(zhì)體的特性分析及藥效學(xué)研究[J]．中國藥理學(xué)通報，2017，33（9）：1211-1214．

[21] Yang L，Zhang Y，Xie J，et al．Biomimetic polysaccharide-cloaked lipidic nanovesicles/microassemblies for improving the enzymatic activity and prolonging the action time for hyperuricemia treatment[J]．Nanoscale，2020，12（28）：15222-15235．

[22] 熊華蓉，何丹，鄧雪，等．尿酸酶多囊脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)和藥效學(xué)試驗(yàn)[J]．華西藥學(xué)雜志，2016，31（1）：18-20．

[23] ALTINKAYNAK C，TAVLASOGLU S，OCSOY I．A new generation approach in enzyme immobilization：Organic-inorganic hybrid nanoflowers with enhanced catalytic activity and stability[J]．Enzyme and microbial technology，2016，93：105-112．

[24] HAO Y，LI H，CAO Y P，et al．Uricase and horseradish peroxidase hybrid CaHPO4nanoflower integrated with transcutaneous patches for treatment of hyperuricemia[J]．Journal of Biomedical Nanotechnology，2019，15（5）：951-965．

[25] RIDEAU E，DIMOVA R，SCHWILLE P，et al．Liposomes and polymersomes：A comparative review towards cell mimicking[J]．Chem Soc Rev，2018，47（23）：8572-8610．

[26] 謝江川，何丹，胡雪原，等．透明質(zhì)酸修飾的尿酸酶多囊脂質(zhì)體體外穩(wěn)定性初步研究[J]．重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2017，42（2）：191-196．

[27] 謝江川，何丹，胡雪原，等．透明質(zhì)酸修飾的尿酸酶脂質(zhì)體的制備及特性[J]．第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2016，37（9）：1076-1081．

[28] MULHBACHER J，MCGEENEY K，ISPAS-SZABO P，et al．Modified high amylose starch for immobilization of uricase for therapeutic application[J]．Biotechnology and applied biochemistry，2002，36（3）：163-170．

[29] ZHANG X，XU D，JIN X，et al．Nanocapsules of therapeutic proteins with enhanced stability and long blood circulation for hyperuricemia management[J]．Journal of Controlled Release，2017，255：54-61．

[30] Choi W I，Tae G，Kim Y H．One pot，single phase synthesis of thermo-sensitive nano-carriers by photo-crosslinking of a diacrylated pluronic[J]．Journal of Materials Chemistry，2008，18（24）：2769-2774．

[31] Kim S，Kim M，Jung S，et al．Co-delivery of therapeutic protein and catalase-mimic nanoparticle using a biocompatible nanocarrier for enhanced therapeutic effect[J]．Journal of Controlled Release，2019，309：181-189．

[32] 鄧雪，胡雪原，何丹，等．靜脈給予尿酸酶自組裝空心納米微球的藥代動力學(xué)和生物等效性初步研究[J]．食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（7）：698-701．

[33] 鄧雪，胡雪原，何丹，等．尿酸酶自組裝空心納米微球體外穩(wěn)定性[J]．食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（9）：933-937．

[34] 馮慧，韓娟，黃文睿，等．納米花型酶-無機(jī)雜化固定化酶研究進(jìn)展[J]．化學(xué)通報，2021，84（12）：1263-1273．

[35] CHO J，KIM S H，YANG B，et al．Albumin affibody-outfitted injectable gel enabling extended release of urate oxidase-albumin conjugates for hyperuricemia treatment[J]．Journal of Controlled Release，2020，324：532-544．

[36] 董鮮祥，張楠，范楠，等．腸道途徑降低血尿酸的可行性探討[J]．醫(yī)學(xué)爭鳴，2020，11（4）：41-45．

Research progress on immobilization of urate oxidase and its application in hyperuricemia

WANG Zhiwei，REN Mengfei，XIA Mizhen，WU Linmei

（School of Life Sciences，Anhui Medical University，Hefei 230032，China）

Hyperuricemia is a major disease that seriously affects health and quality of life．Urate oxidase（UOX）can treat hyperuricemia because that it can catalyze enzymatic oxidation of uric acid to allantoin，which reduce the level of plasma uric acid．However，as an exogenous protein，UOX has the problems，such as low in vivo stability，short half-life，strong antigenicity and high treatment price，which limit its clinical use．Through the enzyme immobilization technology，the shortcomings of UOX can be overcome and its application in the treatment of hyperuricemia can be expanded．The immobilization of UOX and the related researches on its application in hyperuricemia were reviewed in order to provide reference for the development of UOX drugs．

hyperuricemia；urate oxidase；immobilized enzyme；carrier materials

1007-9831（2022）11-0063-04

Q814

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2022.11.012

2022-04-29

安徽醫(yī)科大學(xué)博士科研基金項(xiàng)目（XJ201515）; 安徽醫(yī)科大學(xué)2021年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項(xiàng)目（202110366046X）

汪志偉（2001-），男，安徽池州人，在讀本科生．E-mail：wangzhiwei202109@163.com

吳琳梅（1988-），女，貴州三都人，講師，博士，從事生物材料研究．E-mail：wlm88.1.26@126.com