探討白介素-6對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變的干預(yù)性作用及機(jī)制

張春風(fēng)，鄭輝*，葛煥琦，謝云，李雪粉，胡睿，郭夏

（1.泰達(dá)國(guó)際心血管病醫(yī)院內(nèi)分泌科，天津 300134；2.天津醫(yī)科大學(xué)朱憲彝紀(jì)念醫(yī)院（天津市內(nèi)分泌研究所）國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)激素與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津市代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），天津 300134）

糖尿病是一個(gè)嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題，國(guó)內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國(guó)成年人糖尿病的患病率為11.2%[1]，周圍神經(jīng)病變是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，國(guó)外研究證實(shí)超過(guò)50%的糖尿病患者可診斷為周圍神經(jīng)病變[2]。周圍神經(jīng)病變是導(dǎo)致糖尿病患者足部潰瘍、下肢截肢及骨折的危險(xiǎn)因素，必須進(jìn)一步尋找針對(duì)神經(jīng)病變的病因性治療方法[3]。目前，糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，已知的是長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)及相關(guān)代謝紊亂是導(dǎo)致神經(jīng)病變的主要原因。實(shí)驗(yàn)和臨床證據(jù)表明，長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)介導(dǎo)的細(xì)胞功能障礙通過(guò)氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子釋放和神經(jīng)炎癥在神經(jīng)損傷中起關(guān)鍵作用[4-5]。Christian等[6]研究首次證實(shí)炎癥與糖尿病周圍神經(jīng)病變的相關(guān)性，尤其IL-6水平增加與神經(jīng)病變和神經(jīng)缺陷明顯相關(guān)，但該研究是橫斷面的觀察性研究，未能明確炎癥因子與神經(jīng)病變的因果關(guān)系且未進(jìn)行干預(yù)性的研究。

IL-6屬于IL-6細(xì)胞因子家族成員，分子量為21 kD，由184個(gè)氨基酸殘基組成，并含有2個(gè)糖基化位點(diǎn)。IL-6主要由單核巨噬細(xì)胞、Th2細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，且骨髓細(xì)胞和部分腫瘤細(xì)胞等也可產(chǎn)生IL-6。IL-6是一種多效性細(xì)胞因子，能調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、免疫防御機(jī)制及血細(xì)胞生成等。有研究者通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)應(yīng)用不同劑量IL-6對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，IL-6以劑量依賴的方式提高感覺(jué)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維傳導(dǎo)速度，溫度覺(jué)感覺(jué)過(guò)敏，以及坐骨神經(jīng)內(nèi)皮血流灌注[7]，但該研究未能證實(shí)IL-6干預(yù)后神經(jīng)組織病理性改變及其作用機(jī)制。

本研究通過(guò)對(duì)不同水平IL-6對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行干預(yù)后觀察腓腸神經(jīng)病理學(xué)改變及炎癥相關(guān)因子NF-κB，I?Bα的表達(dá)水平影響，旨在探討IL-6對(duì)周圍神經(jīng)病變的干預(yù)性作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 2015年10月至2018年12月，選取80只健康雄性清潔級(jí)wistar大鼠，均購(gòu)自天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心，體質(zhì)量為（200±30）g，將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、糖尿病非干預(yù)組、糖尿病低劑量IL-6干預(yù)組、糖尿病高劑量IL-6干預(yù)組，每組20只。

1.2 制備動(dòng)物模型及IL-6干預(yù) 對(duì)照組喂予基礎(chǔ)飼料，糖尿病大鼠喂予高脂高糖飼料（20%蔗糖，10%豬油，5%膽固醇，1%膽酸，64%標(biāo)準(zhǔn)飼料）。各組大鼠飼養(yǎng)條件相同，自由攝食、飲水，室溫控制在20～25℃，濕度40%～70%，12 h光照/12 h黑暗。

1.2.1 制備糖尿病周圍神經(jīng)病變模型 糖尿病大鼠給予尾靜脈注射鏈脲菌素45 mg/kg，并持續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)；對(duì)照組注射相當(dāng)劑量的檸檬酸鈉緩沖液并予普通飼料。造模1周后尾靜脈采血測(cè)定隨機(jī)血糖＞16.7 mmol/L為糖尿病造模成功。繼續(xù)上述喂養(yǎng)方法和條件8周制備周圍神經(jīng)病變模型。

1.2.2 不同劑量IL-6干預(yù) 低劑量IL-6干預(yù)組給予1μg/kg IL-6，每周3次，皮下注射；高劑量IL-6干預(yù)組給予10μg/kg IL-6，每周3次，皮下注射；對(duì)照組及非干預(yù)組給予等體積0.9%氯化鈉溶液皮下注射。干預(yù)期4周。對(duì)照組共18只完成試驗(yàn)，非干預(yù)組有15只完成，低劑量IL-6干預(yù)組有16只完成，高劑量IL-6組有16只完成。

1.3 標(biāo)本處理 大鼠隔夜空腹12 h，心臟取血2管，1管抗凝，1管迅速離心，-4℃保存留檢，分離大鼠雙側(cè)腓腸神經(jīng)，液氮保存。

1.4 血液生化指標(biāo)檢測(cè) 應(yīng)用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司）測(cè)定大鼠血IL-6的水平；采用高效液相色譜法測(cè)定大鼠糖化血紅蛋白。

1.5 腓腸神經(jīng)病理學(xué)改變 取一側(cè)腓腸神經(jīng)，經(jīng)固定，石蠟包埋，切片，HE染色觀察腓腸神經(jīng)病理學(xué)改變。

1.6 大鼠腓腸神經(jīng)IL-6，NF-κB及I?Bα的mRNA及蛋白表達(dá) 取一側(cè)大鼠腓腸神經(jīng)組織，采用Western blot法測(cè)定IL-6、NF-κB及I?Bα蛋白表達(dá)水平，相關(guān)抗體購(gòu)自武漢博士得生物工程有限公司。

應(yīng)用定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)監(jiān)測(cè)大鼠另一側(cè)腓腸神經(jīng)IL-6、NF-κB及I?BαmRNA表達(dá)量。取冰凍腓腸神經(jīng)，用超純RNA提取試劑（TaKaRa Code D9108B）提取組織樣本中總RNA。IL-6：F：5'CACTTCACAAGTCGGAGGCT3'；R：5'TCTGACAGTGCATCATCGCT3'；NF-κB：F：5'GGCATCCACCATGGAAGACA3'；R：5'CGTAACCGCGTAGTCGAAGA3'；I?Bα：F：5'TGGCAAGGTCATGCTCTCAG3'；R：5'GGAAGCAGGAATGGAGCTGA3'；內(nèi)參Actin：F：5'AAGAGGGATGCTGCCCTTAC3'；R：5'TACGGCCAAATCCGTTCACA3'。

取5μL RNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的gDNA Eraser（TaKaRa code DRRO47A）對(duì)RNA中殘留的基因組DNA進(jìn)行消化處理，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa code DRRO47A）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用ABI 7500型熒光定量PCR儀，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以“±s”表示，多組間比較應(yīng)用方差分析，兩兩比較應(yīng)用LDS法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)比較 非干預(yù)組、低劑量IL-6組和高劑量IL-6組體質(zhì)量均低于對(duì)照組，糖化血紅蛋白水平明顯高于對(duì)照組，血IL-6水平高于對(duì)照組，且低劑量組血IL-6水平低于非干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 4組大鼠生化指標(biāo)比較（±s）Table1 Comparation of biochemical index among four groups(±s)

表1 4組大鼠生化指標(biāo)比較（±s）Table1 Comparation of biochemical index among four groups(±s)

注：IL-6，白細(xì)胞介素-6。與對(duì)照組比較，a P＜0.05；與非干預(yù)組比較，b P＜0.05；與低劑量IL-6組比較，c P＜0.05

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2.2 4組大鼠腓腸神經(jīng)病理學(xué)改變 對(duì)照組大鼠腓腸神經(jīng)結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常，未見(jiàn)明顯異常；非干預(yù)組神經(jīng)結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常，纖維密度減少，截面積減小，呈萎縮趨勢(shì)，神經(jīng)纖維間隙擴(kuò)大，密度不均勻，可見(jiàn)少量異常有髓纖維；低劑量IL-6干預(yù)組部分神經(jīng)纖維排列稍紊亂，偶見(jiàn)異常有髓纖維；高劑量IL-6干預(yù)組部分神經(jīng)纖維輕度水腫變性，排列稍紊亂，偶見(jiàn)異常有髓纖維，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腓腸神經(jīng)病理改變Table 1 Comparation of biochemical index among four groups

2.3 4組大鼠腓腸神經(jīng)炎癥相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平比較 非干預(yù)組、低劑量IL-6組和高劑量IL-6組腓腸神經(jīng)IL-6、NF-κB及I?Bα的mNRA表達(dá)均高于對(duì)照組，其中非干預(yù)組大鼠的炎癥因子mRNA升高最明顯，低劑量IL-6組IL-6及I?Bα的mRNA表達(dá)與非干預(yù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)高劑量IL-6干預(yù)后，上述炎癥因子mRNA的表達(dá)進(jìn)一步下降，與非干預(yù)組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 4組大鼠腓腸神經(jīng)炎癥相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of mRNA expression of sural nerve inflammation related factors among four groups(±s)

表2 4組大鼠腓腸神經(jīng)炎癥相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of mRNA expression of sural nerve inflammation related factors among four groups(±s)

注：IL-6，白介素-6；NF-κB，核因子κB；I?Bα，抑制蛋白α。與對(duì)照組比較，a P＜0.05；與非干預(yù)組比較，b P＜0.05；與低劑量IL-6組比較，c P＜0.05

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2.4 4組大鼠腓腸神經(jīng)炎癥相關(guān)因子蛋白表達(dá)水平比較 應(yīng)用Image J軟件分析灰度值，各組大鼠腓腸神經(jīng)IL-6，NF-κB及I?Bα蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖2。與對(duì)照組比較，非干預(yù)組、低劑量IL-6組和高劑量IL-6組腓腸神經(jīng)IL-6、NF-κB及I?Bα蛋白表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)低劑量IL-6干預(yù)后，上述炎癥因子蛋白表達(dá)水平有下降，其中IL-6和NF-κB表達(dá)水平與非干預(yù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)高劑量IL-6干預(yù)后，上述炎癥因子表達(dá)水平進(jìn)一步下降，與非干預(yù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 4組大鼠腓腸神經(jīng)炎癥相關(guān)因子蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 3 Comparison of protein expression of sural nerve inflammation related factor among four groups(±s)

表3 4組大鼠腓腸神經(jīng)炎癥相關(guān)因子蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 3 Comparison of protein expression of sural nerve inflammation related factor among four groups(±s)

注：IL-6，白細(xì)胞介素-6；NF-κB，核因子κB；I?Bα，抑制蛋白α。與對(duì)照組比較，a P＜0.05；與非干預(yù)組比較，b P＜0.05；與低劑量IL-6組比較，c P＜0.05

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圖2 各組大鼠腓腸神經(jīng)炎癥因子蛋白表達(dá)水平Figure 2 Protein expression of sural nerve inflammatory factor in each group

3 討論

在1985年，IL-6首次被確定為B細(xì)胞刺激因子，并被描述為啟動(dòng)免疫系統(tǒng)急性期反應(yīng)的促炎細(xì)胞因子[8]。在糖尿病周圍神經(jīng)病變患者的血液中發(fā)現(xiàn)IL-6水平升高，提示IL-6可能與神經(jīng)病變發(fā)生發(fā)展相關(guān)。后續(xù)的臨床研究中發(fā)現(xiàn)在給予糖尿病周圍神經(jīng)病變患者進(jìn)行運(yùn)動(dòng)指導(dǎo)時(shí)，血液IL-6水平呈脈沖式升高，且伴隨血流量增強(qiáng)和慢性炎癥減少，促進(jìn)周圍神經(jīng)纖維再生的作用；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中經(jīng)實(shí)驗(yàn)性切開(kāi)軸突后可觀察到IL-6在神經(jīng)中過(guò)度表達(dá)，從而促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，直到與施萬(wàn)細(xì)胞建立接觸。因此，目前IL-6被理解為一種多功能細(xì)胞因子，既可激發(fā)炎癥，也有抗炎作用[9]。目前比較一致的觀點(diǎn)認(rèn)為，當(dāng)IL-6的水平達(dá)到10～100 pg/ml時(shí)（類似于運(yùn)動(dòng)時(shí)IL-6的短暫脈沖式突然增高），IL-6對(duì)于糖尿病神經(jīng)病變表現(xiàn)為改善和修復(fù)作用，然而對(duì)于長(zhǎng)期慢性低劑量IL-6水平的升高（2～3 pg/ml）時(shí)，IL-6表現(xiàn)為炎癥效應(yīng)，可能促進(jìn)糖尿病神經(jīng)病變的進(jìn)一步進(jìn)展[10]。

本研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)下大鼠血液IL-6水平高于非糖尿病大鼠，然而給予外源性IL-6干預(yù)后，大鼠腓腸神經(jīng)IL-6的mRNA及蛋白表達(dá)受到抑制，病理下可見(jiàn)神經(jīng)結(jié)構(gòu)較前改善，提示IL-6對(duì)周圍神經(jīng)病變起到保護(hù)性作用。

既往國(guó)外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)外源性給予IL-6干預(yù)后，大鼠周圍神經(jīng)傳導(dǎo)速度，熱痛覺(jué)感知均得到改善，然而并未進(jìn)一步分析IL-6的作用機(jī)制[7]。NFκB被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。NF-κB的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致神經(jīng)炎癥的發(fā)展，促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，神經(jīng)損傷，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度異常。NF-κB可表達(dá)于任何細(xì)胞，通常以無(wú)活性形式存在，在炎癥因子刺激下NF-κB被激活，轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核內(nèi)并調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，應(yīng)用IL-6進(jìn)行干預(yù)后，大鼠腓腸神經(jīng)NF-κB及I?Bα的mRNA及蛋白表達(dá)均受到抑制，并且呈現(xiàn)為劑量依賴方式，提示IL-6可能通過(guò)抑制NF-κB的表達(dá)從而起到改善神經(jīng)形態(tài)及功能的作用。

既往研究[11]發(fā)現(xiàn)IL-6有改善糖代謝及胰島素敏感性的作用，但本研究中應(yīng)用IL-6后對(duì)于糖化血紅蛋白的改善作用不明顯，考慮可能與干預(yù)時(shí)間短相關(guān)，關(guān)于IL-6與血糖及胰島素的相關(guān)性需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，IL-6可通過(guò)抑制腓腸神經(jīng)NF-κB的表達(dá)，緩解糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變的進(jìn)展。