去卵巢小鼠焦慮樣行為和血清激素水平及當(dāng)歸補(bǔ)血湯的干預(yù)作用

馬微微 閆金銘 郭鑫睿 葛金環(huán) 王琪 魏薇 黃莉莉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

焦慮在女性一般人群中的發(fā)病率約為男性的2倍，在圍絕經(jīng)期女性中，焦慮的發(fā)生率顯著增加〔1，2〕。圍絕經(jīng)期伴隨著負(fù)性情緒的增加，影響女性的身心健康。圍絕經(jīng)期卵巢功能衰退、體內(nèi)雌激素水平下降，激素替代治療可作為圍絕經(jīng)期改善情緒的主要治療策略，但是存在增加子宮內(nèi)膜癌、心腦血管疾病等風(fēng)險(xiǎn)的爭議〔3〕。研究表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯可以有效改善圍絕經(jīng)期女性的精神和軀體癥狀〔4～6〕，但是相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究較少。本實(shí)驗(yàn)主要觀察去卵巢小鼠的焦慮樣行為、血清激素水平的變化及當(dāng)歸補(bǔ)血湯的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)ICR雌性小鼠，體重(23±2)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(黑)2018-007。動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動(dòng)物室，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水、攝食，室溫：(20±3)℃；濕度為(55±15)%；照明：12 h明暗交替(光照：7∶00～19∶00，黑暗：19∶00～7∶00)。

1.2試劑及藥物 當(dāng)歸購于哈爾濱益安堂大藥房有限公司和平店，經(jīng)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室老師鑒定；黃芪購于哈爾濱益安堂大藥房有限公司和平店，經(jīng)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定；水合氯醛購于天津市大茂化學(xué)試劑廠(批號(hào)：20190327)；小鼠雌二醇(E2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購于南京建成生物工程研究所(20191114)；小鼠皮質(zhì)酮(CORT)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購于南京建成生物工程研究所(20191114)。小鼠褪黑素(MT)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購于南京建成生物工程研究所(20191114)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 高壓滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司，型號(hào)：YXQ-SG46-280S；高架十字迷宮裝置：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理實(shí)驗(yàn)室自制；高速低溫冷凍離心機(jī)：美國TOMOS有限公司，型號(hào)：3-18R(3006004)；-80℃超低溫冰箱：青島海爾特種電器有限公司，型號(hào)：DW-86L338；酶標(biāo)儀：美國Bio-Rad公司，型號(hào)：xMark10092；分析天平：美國NewClassic MF公司，型號(hào)：MS105。

1.4方法

1.4.1當(dāng)歸補(bǔ)血湯的制備 取黃芪90 g、當(dāng)歸18 g，加入8倍量水，浸泡1 h，小火煎煮20 min后過濾，濾渣加入4倍量水小火再煎煮20 min，過濾，合并兩次濾液并濃縮至濃度為2 g/ml。將2 g/ml的當(dāng)歸補(bǔ)血湯水煎液分別稀釋4倍、16倍，即得到當(dāng)歸補(bǔ)血湯低、中、高劑量組，濃度分別為0.125 g/ml、0.500 g/ml、2.000 g/ml。

1.4.2去卵巢手術(shù)、給藥及分組 適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，60只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組和低、中、高劑量組。模型組和各劑量組按照文獻(xiàn)方法〔7〕，摘除小鼠雙側(cè)卵巢。假手術(shù)組只摘除卵巢附近同樣體積的脂肪組織。術(shù)后各組均連續(xù)注射青霉素3 d，以防感染。術(shù)后恢復(fù)7 d，低、中、高劑量組于每日早8∶00灌胃給藥，劑量分別為2.5、10.0、40.0 g/kg；模型組、假手術(shù)組灌胃給予同體積蒸餾水，連續(xù)給藥7 d。

1.4.3高架十字迷宮測(cè)試 各組均于末次給予蒸餾水或當(dāng)歸補(bǔ)血湯低、中、高劑量后20 min，進(jìn)行高架十字迷宮測(cè)試。測(cè)試時(shí)間范圍為早8∶30～12∶00。首先將小鼠背對(duì)實(shí)驗(yàn)者，頭朝向開臂端放置在高架十字迷宮上，視頻記錄裝置記錄5 min內(nèi)小鼠運(yùn)動(dòng)情況。每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物做完實(shí)驗(yàn)后，高架十字迷宮開臂和閉臂都用75%酒精擦拭，待酒精揮發(fā)后，按照上述步驟，再繼續(xù)放第2只小鼠，直至所有動(dòng)物做完實(shí)驗(yàn)。觀看視頻，記錄動(dòng)物進(jìn)入開臂次數(shù)和滯留時(shí)間，進(jìn)入閉臂次數(shù)及滯留時(shí)間，計(jì)算開臂次數(shù)比例和滯留時(shí)間比例作為焦慮評(píng)定指標(biāo)。開臂次數(shù)比例=開臂次數(shù)/(開臂次數(shù)+閉臂次數(shù))×100%。開臂時(shí)間比例=開臂滯留時(shí)間/(開臂滯留時(shí)間+閉臂滯留時(shí)間)×100%。

1.4.4小鼠血清E2、皮質(zhì)酮及MT含量檢測(cè) 高架十字迷宮測(cè)試結(jié)束后立即將小鼠摘除眼球取血，血液靜止1 h后經(jīng)離心機(jī)5 000 r/min，離心10 min，取上清液，-80℃超低溫冰箱保存，待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，測(cè)定小鼠血清中E2、CORT及MT含量，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.5小鼠子宮重量稱量 各組小鼠取血后斷椎處死，打開腹腔，分離子宮系膜并剝離周圍脂肪，切斷輸卵管與子宮的連接，在子宮頸與子宮角的交界處切下子宮角，得到完整新鮮子宮，立即稱量其濕重，計(jì)算子宮系數(shù)。子宮系數(shù)=子宮濕重/體重×100%

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同劑量當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)去卵巢小鼠高架十字迷宮中活動(dòng)情況的影響 與假手術(shù)組相比，模型組小鼠處于高架十字迷宮中的開臂時(shí)間比例、開臂次數(shù)比例均明顯降低(P<0.01)。見表1。

2.2不同劑量當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)去卵巢小鼠子宮系數(shù)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組小鼠的子宮系數(shù)明顯降低(P<0.01)。與模型組相比，低、中、高劑量組小鼠的子宮系數(shù)均明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.3不同劑量當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)去卵巢小鼠血清E2、CORT及MT水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組小鼠E2、MT含量明顯降低，CORT含量明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，低、中、高劑量組小鼠E2、MT含量均明顯升高、CORT含量均明顯降低(P<0.01)。與模型組相比，低劑量組小鼠MT含量明顯升高(P<0.05)；中、高劑量組小鼠MT含量均明顯升高(P<0.01)。見表1。

3 討 論

當(dāng)歸補(bǔ)血湯始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，由當(dāng)歸和黃芪兩味中藥組成，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的功效。當(dāng)歸是中醫(yī)藥治療焦慮癥的一味常用中藥〔8〕，現(xiàn)代藥理研究表明，當(dāng)歸精油具有良好的抗焦慮作用〔9〕。本研究結(jié)果提示當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)去卵巢小鼠的抗焦慮作用，具有一定的劑量依賴性，大劑量才可表現(xiàn)出發(fā)揮其作用。

雌激素降低是圍絕經(jīng)期女性出現(xiàn)負(fù)性癥狀的主要原因，雌激素替代治療可以緩解相應(yīng)的負(fù)性癥狀。譚玄松〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可增加單側(cè)切除卵巢大鼠的雌激素水平，延緩去勢(shì)大鼠絕經(jīng)后衰老。外源性給予E2，通過減少基礎(chǔ)或應(yīng)激狀態(tài)下的CORT水平，表現(xiàn)出對(duì)去卵巢動(dòng)物的抗焦慮作用，此作用僅限于一定的E2水平范圍內(nèi)〔11〕，為當(dāng)歸補(bǔ)血湯僅大劑量表現(xiàn)出抗焦慮作用提供了依據(jù)。本研究結(jié)果表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能通過提高去卵巢小鼠體內(nèi)的E2水平，降低CORT水平，從而改善去卵巢動(dòng)物的焦慮情緒。

MT是松果體產(chǎn)生的一種胺類激素，具有顯著的抗氧化應(yīng)激作用，表現(xiàn)出延緩衰老的作用。絕經(jīng)女性表現(xiàn)出夜間MT分減少〔12〕。研究證實(shí)MT可表現(xiàn)出激素替代治療作用，減少圍絕經(jīng)期的氧化應(yīng)激，進(jìn)而緩解圍絕經(jīng)期負(fù)性癥狀〔13，14〕，而且MT還表現(xiàn)出抗焦慮作用〔15，16〕。當(dāng)歸補(bǔ)血湯可增加去卵巢小鼠MT含量，推測(cè)MT參與其改善去卵巢動(dòng)物的焦慮情緒作用。