基于腸道微生物研究芒針?biāo)俅虒?duì)子宮內(nèi)膜異位患者疼痛的治療機(jī)理

杜 娟，叢慧芳△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150001)

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EM)是一種常見的婦科疾病，主要是指與子宮內(nèi)膜類似的組織在子宮腔或肌層外的部位生長(zhǎng)的疾病[1]。在每月的周期中，激素刺激子宮內(nèi)膜異位病灶使其生長(zhǎng)，然后分解并出血，與月經(jīng)不同，這種出血仍然局限于體內(nèi)部位，導(dǎo)致發(fā)炎、疼痛以及疤痕和粘連的形成。盡管子宮內(nèi)膜異位癥可能潛在地累及體內(nèi)的任何器官，但其通常只影響盆腔器官，例如卵巢、輸卵管和子宮韌帶[2]。該病可能會(huì)影響任何年齡的患者，但在育齡婦女中最常見，對(duì)女性的健康、生活質(zhì)量和生殖功能有重大影響[3]。目前，針對(duì)EM的治療方法主要包括采取手術(shù)直接切除病灶部位或給患者使用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑阻止雌激素的釋放，停止EM病灶部位出血[4]。但是，有研究顯示，在手術(shù)治療后，有大概30%～50%的患者會(huì)復(fù)發(fā)，在使用激素治療的患者中有11%～19%的女性表示疼痛無(wú)改善，而有5%～15%的女性由于副作用而停止治療[5]。由此可見，西醫(yī)治療EM，效果并不如人意。針刺治療是中醫(yī)常用的治療手段之一，有研究表明，針刺具有活血化瘀的作用，與普通治療方法聯(lián)合應(yīng)用能顯著提高對(duì)EM的治療效果[6]。但有關(guān)針刺治療EM的機(jī)理還不甚清晰，因此，本研究以EM患者為治療對(duì)象，從腸道菌群角度研究芒針治療EM的機(jī)理，以期為其在臨床上的應(yīng)用提供科學(xué)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對(duì)象來源于2019年—2020年在本單位就診的EM伴痛經(jīng)的患者，根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)子宮內(nèi)膜異位癥協(xié)作組《子宮內(nèi)膜異位癥的診斷和治療規(guī)范》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)，并參照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)篩選出患者40例，年齡25～42歲，平均年齡33.1歲，平均病程3.7年。研究將40例患者隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組和芒針組各20例。所有患者在進(jìn)行治療前均被告知具體情況，并取得了患者的自愿配合，研究全程符合相關(guān)倫理道德標(biāo)準(zhǔn)要求。各組患者基本情況見表1。各組平均年齡和病程差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各組的病程分布也比較接近。

表1 兩組患者基本情況比較

1.2 納排標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①臨床診斷已經(jīng)判定為EM伴痛經(jīng)的患者；②患者對(duì)此次研究知情，并同意參與研究；③患者年齡25～45歲；④血常規(guī)和肝腎指標(biāo)無(wú)異常；⑤在參與研究的1個(gè)月內(nèi)未接受其他中西醫(yī)治療。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①臨床診斷不符合EM伴痛經(jīng)癥狀的患者；②年齡<25歲或>45歲的患者；③處于妊娠期或者哺乳期的患者；④患有其他嚴(yán)重疾病的患者；⑤在參與研究的1個(gè)月內(nèi)接受其他中西醫(yī)治療的患者；⑥不符合納入標(biāo)準(zhǔn)的其他病例。

1.3 治療方法

1.3.1 對(duì)照組 患者采取米非司酮(上海新華聯(lián)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H10950202)給藥治療。

1.3.2 芒針組 則在給藥治療基礎(chǔ)上，每天給予芒針?biāo)俅讨委?。針刺具體選穴：關(guān)元、子宮、中極、氣海、十七椎、公孫及阿是穴。具體操作方法：用碘酒對(duì)選取穴位進(jìn)行消毒后，施針者用拇指先按壓穴位，關(guān)元穴直刺30～50 mm，需排尿后針刺;中極、關(guān)元和氣海的針感向會(huì)陰放射為佳;十七椎(在腰部，后正中線上，第5腰椎棘突下)直刺20～30 mm，進(jìn)針角度沿軀體水平面與軀體矢狀面成45 °夾角進(jìn)針;進(jìn)針時(shí)，左手拇指、食指撐開患部皮膚，針刺方向順著進(jìn)針方向由上往下低頻率、小幅度捻轉(zhuǎn)進(jìn)針，不提插，針刺順序?yàn)閺纳系较?。治療頻率為1次/d，每周拔罐2次，經(jīng)期疼痛時(shí)十七椎下針刺拔罐。療程為3個(gè)月經(jīng)周期，并于治療結(jié)束后1個(gè)月經(jīng)周期對(duì)患者進(jìn)行隨訪和樣品采集。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 患者主觀疼痛評(píng)分 在治療后的隨訪中，使用評(píng)分選擇數(shù)字評(píng)分(NRS)法，由患者在0～10的打分表上，根據(jù)自己治療前后疼痛情況進(jìn)行打分，數(shù)字越大代表疼痛程度越重，0分為無(wú)疼痛，10分代表疼痛最劇烈[8]。

1.4.2 血清中脂多糖、前列腺素E2和雌二醇的檢測(cè) 在患者治療結(jié)束1個(gè)月經(jīng)周期后，對(duì)患者進(jìn)行血清樣品的采集，并使用人脂多糖(LPS)ELISA檢測(cè)(購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司)、人前列腺素E2(PGE2)ELISA檢測(cè)(購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司)、人雌二醇(E2)ELISA檢測(cè)(購(gòu)自上海恪敏生物科技有限公司)對(duì)血清樣品中的LPS濃度、PGE2濃度和E2濃度進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.3 血清中炎性因子的檢測(cè) 在患者治療結(jié)束1個(gè)月經(jīng)周期后，對(duì)患者進(jìn)行血清樣品的采集，使用ELISA試劑盒(購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司)對(duì)血清樣品中的IL-1、TNF-α和IL-10的濃度進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.4 糞便中微生物多樣性的分析 在患者治療結(jié)束1個(gè)月經(jīng)周期后，對(duì)患者糞便進(jìn)行采集，將糞便制成10 %的懸濁液后，用微生物DNA提取試劑盒(購(gòu)自美國(guó)QAIGEN生物技術(shù)公司)對(duì)糞便中微生物的DNA進(jìn)行提取，然后根據(jù)細(xì)菌16s rDNA的V3+V4區(qū)域的特異引物序列如下：Nobar-341F：3′CCTACGGGNGGCWGCAG 5′,Nobar-805R：3′GACTACHVGGGTATCTAATCC 5′,對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行回收后，送北京百邁克公司進(jìn)行基因測(cè)序，并對(duì)微生物的α-多樣性指標(biāo)進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)各試驗(yàn)組在97%相似度水平下的Ace、Chao1、香濃指數(shù)及辛普森指數(shù)。

1.4.5 糞便中微生物區(qū)系門水平的分析 在進(jìn)行α-多樣性比較的同時(shí)，將各試驗(yàn)組糞便微生物DNA序列中的OTU代表序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫(kù)(16S rDNA)進(jìn)行比對(duì)得到各患者糞便微生物每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，進(jìn)而進(jìn)行物種的分類統(tǒng)計(jì)，獲得門水平物種分布柱狀圖。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 兩組患者NRS評(píng)分比較

治療前對(duì)照組和芒針組患者的NRS評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);治療后，對(duì)照組和芒針組的NRS評(píng)分均顯著低于治療前(P<0.05)，而且芒針組的NRS評(píng)分也顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者NRS評(píng)分比較

2.2 兩組患者血清中脂多糖、前列腺素E2和雌二醇水平比較

在進(jìn)行了3個(gè)月經(jīng)周期的治療后，與對(duì)照組相比，芒針組患者血清中的LPS、PGE2、E2濃度分別下降了23.71%、54.72%和4.16%，其中LPS、PGE2的下降達(dá)到顯著水平(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者血清中脂多糖、前列腺素E2和雌二醇水平比較

2.3 兩組患者血清中炎性因子水平比較

在進(jìn)行了3個(gè)月經(jīng)周期的治療后，與對(duì)照組相比，芒針組患者血清中的IL-1、TNF-α濃度分別顯著下降了27.15%和12.22%(P<0.05)，血清中的IL-10則顯著提高了12.35%(P<0.05)。見表4。

表4 兩組患者血清中炎性因子水平比較

2.4 兩組患者糞便中微生物多樣性比較

在進(jìn)行了3個(gè)月經(jīng)周期的治療后，與對(duì)照組相比，芒針組患者糞便中微生物α-多樣性指標(biāo)中的香濃指數(shù)、辛普森指數(shù)、Chao1、ACE分別顯著提高了27.06%、80.77%、14.49%和23.53%(P<0.05)。見表5。

表5 兩組患者糞便中α-多樣性的分析結(jié)果

2.5 兩組患者糞便中微生物區(qū)系門水平比較

在進(jìn)行了3個(gè)月經(jīng)周期的治療后，患者糞便中微生物主要以厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)為優(yōu)勢(shì)菌群，但兩組患者在治療后，微生物菌群的構(gòu)成并不相同，與對(duì)照組相比，芒針組患者糞便微生物中的厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和藍(lán)藻菌門的比例顯著增加(P<0.05)，而放線菌門的比例則顯著降低(P<0.05)。見圖1。

3 討論

EM的臨床表現(xiàn)為痛經(jīng)、不育或卵巢腫塊，年輕人的EM癥狀可能更為嚴(yán)重，尤其是在15歲之前就首次出現(xiàn)盆腔癥狀的患者。EM癥狀包括疲勞、精神分裂癥、胃腸道問題、腹脹、惡心和在此期間出現(xiàn)胃部不適[9]。根據(jù)受累部位的不同，可能還會(huì)出現(xiàn)其他癥狀，例如:患有子宮內(nèi)膜異位癥的女性通常表現(xiàn)為非特異性下尿路癥狀[10]。通常對(duì)EM患者采取的是手術(shù)治療方法，但該方法存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，也有可能對(duì)育齡女性的生殖功能造成不利影響[11]。有研究認(rèn)為，雌激素是影響女性EM發(fā)生和發(fā)展的因素之一，因此可以通過調(diào)控女性體內(nèi)激素的方式，對(duì)患者進(jìn)行治療[12]。但是，這種方法因?yàn)槭峭ㄟ^人為方式干預(yù)體內(nèi)激素水平，對(duì)用藥劑量要求比較嚴(yán)格，如果劑量較低治療效果不明顯，如果劑量較大副作用又會(huì)比較嚴(yán)重[13]。有研究指出，除了會(huì)造成患者不育或者癌變等不良影響外，EM給患者帶來的困擾主要來自于病灶部位所帶來的疼痛[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，EM患者腸道菌群的變化與其病灶部位的疼痛程度具有相關(guān)性[15]。其主要原因是因?yàn)镋M患者腸道菌群中屬于變形菌門中的致病菌比例大量增加，導(dǎo)致進(jìn)入血液中的LPS增加，進(jìn)而刺激可誘導(dǎo)EM病灶部位出現(xiàn)疼痛的前列腺素E2濃度大量增加[16]。芒針療法是中醫(yī)傳統(tǒng)的治療方法，具有活血化瘀的治療效果[17]。而中醫(yī)認(rèn)為，從病機(jī)上而言，EM屬于“血瘀證”的范疇，因此適用于芒針治療[18]。而大量臨床試驗(yàn)也表明，芒針對(duì)EM的疼痛治療具有良好的效果[19]。還有研究發(fā)現(xiàn)，芒針對(duì)腸道疾病患者的腸道微生物群具有調(diào)控作用[20]。因此，本研究推測(cè)血瘀是產(chǎn)生EM病灶的主要原因，而使患者病灶部位出現(xiàn)疼痛的原因之一就是腸道菌群發(fā)生了變化。所以，本研究用芒針?biāo)俅讨委熍c藥物治療相結(jié)合，檢測(cè)其治療效果，并從腸道菌群角度分析其對(duì)EM疼痛的治療效果。之所以選擇火針進(jìn)行治療是因?yàn)?，芒針又稱為長(zhǎng)針，與單純的針刺比較，芒針取穴少、針感強(qiáng)，可以一針透多穴，起到行氣、活血和通絡(luò)的作用，尤其是芒針的針尖可到達(dá)組織的深層，對(duì)人體起到了“松、順”的效果，從而達(dá)到通則不痛的效果，因此具有極佳的鎮(zhèn)痛作用。在本研究所選擇的針刺穴位中，十七椎屬于奇穴,主要作用是對(duì)痛經(jīng)和子宮出血具有很好的治療效果，氣海穴可以破氣血瘀滯，關(guān)元穴可以固本培益，子宮穴屬于經(jīng)外奇穴,與氣海穴和關(guān)元穴配合具有治療月經(jīng)痛的效果，公孫穴除了具有一定的止痛作用外還具有健脾的作用，而阿是穴則遠(yuǎn)端陽(yáng)性反應(yīng)點(diǎn)具有較好的止痛作用。米非司酮是一種激素類藥物，可以抑制雌激素對(duì)病灶部位的刺激，從而起到治療的效果。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，治療前所有患者的NRS評(píng)分均較高，而在給予治療后疼痛癥狀都有所緩解，但芒針聯(lián)合藥物治療對(duì)疼痛的治療效果要顯著高于單獨(dú)使用藥物治療。這說明芒針可以提高對(duì)EM患者疼痛的治療效果，減少藥物使用，進(jìn)而減少藥物副作用對(duì)患者造成的不良影響。而對(duì)患者治療后血清中的LPS、PGE2和E2濃度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用藥物治療的患者的LPS、PGE2顯著高于芒針組，而E2水平差異卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明芒針對(duì)EM患者的雌激素水平無(wú)顯著影響，但卻可以下調(diào)患者體內(nèi)疼痛刺激物質(zhì)PGE2的濃度，這可能是因?yàn)槊⑨樦委煹幕颊唧w內(nèi)LPS水平較低。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，LPS還能夠造成人體內(nèi)炎性因子的大量增加，進(jìn)而加劇病灶部位的病變程度。本研究發(fā)現(xiàn)，給予芒針聯(lián)合治療后，與單獨(dú)用藥患者比較，促炎性因子TNG-α和IL-1的濃度顯著降低，而炎癥抑制因子IL-10的濃度顯著增加。這說明芒針也可能通過LPS的途徑減少了患者體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步提高治療效果。而人體內(nèi)的LPS主要來源于腸道菌群中的致病菌大量繁殖，造成腸道黏膜屏障被破壞，使得大量LPS進(jìn)入體內(nèi)，進(jìn)而對(duì)患者健康造成影響。α-多樣性是衡量動(dòng)物體內(nèi)微生物豐度的重要指標(biāo)，如果α-多樣性顯著下降，則說明患者體內(nèi)的微生物穩(wěn)態(tài)被破壞，不利于患者的健康。由于條件限制，無(wú)法直接取患者的腸道內(nèi)容物進(jìn)行檢測(cè)，所以本研究對(duì)患者治療后1個(gè)月經(jīng)周期的糞便中微生物進(jìn)行分析，通過對(duì)多樣性分析發(fā)現(xiàn)，芒針組的α多樣性要顯著高于單獨(dú)使用藥物組，說明芒針治療后有助于幫助患者恢復(fù)腸道穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)患者腸道健康。厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門是動(dòng)物腸道內(nèi)主要益生菌所在的分類，而變形菌門中則主要是腸道的致病菌種[21]。通過對(duì)患者治療后糞便的微生物區(qū)系研究發(fā)現(xiàn)，芒針組的厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門顯著高于單獨(dú)用藥組，而變形菌門則顯著降低。這與腸道微生物多樣性相配合分析發(fā)現(xiàn)，芒針可以通過增加腸道內(nèi)的益生菌、減少致病菌比例的方式，使腸道內(nèi)環(huán)境趨于健康的穩(wěn)態(tài)，減少致病菌對(duì)腸道屏障的破壞，進(jìn)而減少了致病性的LPS在患者體內(nèi)的擴(kuò)散，從而減輕EM病灶部位疼痛給患者帶來的痛苦，提高治療效果，降低藥物使用給患者帶來的不良影響。

4 結(jié)論

芒針治療是中醫(yī)常用的治療手段，具有活血化瘀的作用，與普通治療方法聯(lián)合應(yīng)用能顯著提高對(duì)EM的治療效果。但有關(guān)芒針治療EM的機(jī)理還不甚清晰，本研究以EM患者為治療對(duì)象，從腸道菌群角度研究芒針研究治療EM的機(jī)理后發(fā)現(xiàn)，配合芒針治療后，患者的疼痛指數(shù)顯著降低，這可能是因?yàn)槊⑨槍?duì)EM患者腸道微生物的多樣性和組成結(jié)構(gòu)具有顯著改善作用，降低了患者血清中的脂多糖、前列腺素E2和炎性因子水平，從而提高了治療效果。