轉(zhuǎn)錄組學(xué)應(yīng)用于針灸作用機(jī)制研究的探討

霍 宏，董 旭，崔一之，李晶怡，張 瑩，劉佳惠，叢 婧，王東巖,△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

隨著針灸應(yīng)用的日益普及，對(duì)針灸作用機(jī)制的探究與闡釋成為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)現(xiàn)代化面臨的必然問(wèn)題，應(yīng)運(yùn)而生的是基礎(chǔ)科研技術(shù)與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的碰撞交融[1]。針灸機(jī)制的研究包含了“點(diǎn)-線-面”多個(gè)層次的探索，從單個(gè)的作用因素、縱向的作用途徑到橫向的高通量變化，各層次的研究重點(diǎn)不同，又互為補(bǔ)充。轉(zhuǎn)錄組學(xué)隸屬系統(tǒng)生物學(xué)領(lǐng)域，偏重對(duì)“面”的變化進(jìn)行說(shuō)明，即對(duì)某一時(shí)刻發(fā)生的轉(zhuǎn)錄本改變進(jìn)行總的描述，從數(shù)據(jù)中挖掘轉(zhuǎn)錄過(guò)程發(fā)生的關(guān)鍵改變，進(jìn)而說(shuō)明科學(xué)問(wèn)題。轉(zhuǎn)錄組已在闡釋疾病基因特征性變化及中醫(yī)證候轉(zhuǎn)錄差異等方向廣泛應(yīng)用，技術(shù)較成熟[2]。RNA-Seq等三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)也逐漸被引入穴位特異性、針灸及電針的干預(yù)靶點(diǎn)等研究，為說(shuō)明針灸內(nèi)源性作用機(jī)制進(jìn)行了有益探索?？偨Y(jié)歸納近年來(lái)二者聯(lián)合應(yīng)用的范例，對(duì)后續(xù)研究的方案優(yōu)化大有裨益。

1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究現(xiàn)狀

1.1 概念與特點(diǎn)

轉(zhuǎn)錄組學(xué)(Transcriptome)是指從整體水平闡釋目標(biāo)組織、細(xì)胞所有轉(zhuǎn)錄本表達(dá)變化的學(xué)科。轉(zhuǎn)錄本能夠記錄遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)錄為RNA的過(guò)程，根據(jù)RNA是否屬于編碼蛋白質(zhì)(mRNA)，可將記錄所有RNA總和的廣義轉(zhuǎn)錄組細(xì)化為狹義轉(zhuǎn)錄組。除編碼蛋白質(zhì)的信使RNA(Messenger RNA，mRNA)外，非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)又可細(xì)分為核糖體RNA(rRNA)、小核RNA(snRNA)和微小RNA(microRNA)等[3]。mRNA是蛋白質(zhì)合成的橋梁，ncRNA亦參與蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程，都對(duì)不同生物過(guò)程起到重要影響。研究者可根據(jù)高通量結(jié)果，選取差異性較高的族群進(jìn)行有針對(duì)性的后續(xù)研究。

1.2 技術(shù)更迭

轉(zhuǎn)錄組方法主要包括芯片技術(shù)與測(cè)序技術(shù)：①芯片技術(shù)以cDNA為代表，核心為探針序列的設(shè)計(jì)，其缺點(diǎn)為對(duì)未知序列以及低豐度的基因難以檢測(cè)，且假陽(yáng)性較高。芯片技術(shù)后續(xù)又發(fā)展為全長(zhǎng)cDNA(Full-length cDNA，F(xiàn)L-cDNA)檢測(cè)與表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tag，EST)等文庫(kù)構(gòu)建法[4]。②測(cè)序技術(shù)高速發(fā)展，目前已經(jīng)歷三代變遷。一代測(cè)序以Sanger開(kāi)創(chuàng)的基因表達(dá)系列分析法(Serial analysis of gene expression，SAGE)為代表，后演變?yōu)榇蠓秶叫袦y(cè)序(Massively parallel signature sequencing，MPSS)[5]。二代RNA 測(cè)序(RNA Sequencing，RNA-Seq)以Illumina公司的Solexa、Hiseq技術(shù)與ABI公司的Solid技術(shù)為代表，將橋式PCR與熒光標(biāo)記堿基作為核心，具有通量高、誤差小和成本低的特點(diǎn)，至今仍廣泛應(yīng)用[6]。目前，隨著單細(xì)胞成為基礎(chǔ)研究熱點(diǎn)，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(single-cell RNA sequencing，scRNA-seq)也逐漸開(kāi)始應(yīng)用于不同領(lǐng)域[7]。

1.3 數(shù)據(jù)注釋與分析

在得到的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中，針對(duì)具有顯著差異變化的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行生物信息分析，能夠進(jìn)一步闡釋差異基因的生物學(xué)功能，挖掘出結(jié)果的深層次意義。在數(shù)據(jù)分布展示中，應(yīng)用頻率較高的處理為聚類分析，聚類熱圖能夠?qū)?shù)據(jù)無(wú)監(jiān)督地根據(jù)相似度大小劃分至不同簇，從而展示在同等條件下差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本[8]。另外，基于基因數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異RNA進(jìn)行功能富集分析，能夠?qū)NA靶點(diǎn)的已知研究信息進(jìn)行闡釋，常見(jiàn)富集方式為基因本體論(Gene Orthology，GO)注釋與京都基因組(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)注釋[9-10]。GO富集能夠從生物過(guò)程BP(biological process，BP)、細(xì)胞成分(cell component，CC)和分子功能(molecular fuction，MF)角度展示差異RNA的生物學(xué)功能，而KEGG富集則突出強(qiáng)調(diào)差異RNA參與調(diào)控的信號(hào)通路，從而進(jìn)一步分析該RNA與相關(guān)蛋白在通路、疾病的作用。

2 穴位特異性的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

轉(zhuǎn)錄組學(xué)應(yīng)用于探究穴位特異性的優(yōu)勢(shì)在于：可在單因素干預(yù)的情況下，探究多個(gè)組織的不同改變。Wu等[11]設(shè)置針刺大鼠雙側(cè)足三里組與無(wú)刺激大鼠對(duì)照組，分別對(duì)比了穴位皮膚、延髓、腦皮質(zhì)、海馬、肺、脾、腎、子宮和大腿肌肉等9個(gè)組織的轉(zhuǎn)錄差異。結(jié)果顯示，在針灸處理過(guò)的皮膚中，分別有169個(gè)基因上調(diào)和231個(gè)基因下調(diào)。其他各個(gè)器官的轉(zhuǎn)錄表達(dá)也發(fā)生變化。通過(guò)建立蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(Protein protein interaction，PPI)，發(fā)現(xiàn)除海馬和肺外，細(xì)胞骨架和細(xì)胞粘附是各器官中改變最大的類別，“炎癥和免疫反應(yīng)”則在肺部差異明顯。受針刺影響的過(guò)程網(wǎng)絡(luò)中約有60%與炎癥和免疫反應(yīng)有關(guān)，神經(jīng)沖動(dòng)與γ-氨基丁酸能的傳遞是神經(jīng)生理最相關(guān)的過(guò)程。另外，通過(guò)與疾病基因庫(kù)的交叉對(duì)比，篩選出針刺足三里干預(yù)肺、腦基因調(diào)控從而產(chǎn)生作用最大的前20種疾病，為預(yù)測(cè)和解釋針灸在各種器官中的治療潛力提供了基礎(chǔ)。亦有學(xué)者探究多穴組合刺激產(chǎn)生的特異性轉(zhuǎn)錄改變，Yin等針刺大鼠大椎、雙側(cè)風(fēng)門(mén)與肺俞，應(yīng)用SAGE法對(duì)比了肺組織的轉(zhuǎn)錄組改變，并通過(guò)qRT-PCR法對(duì)3個(gè)主要差異基因進(jìn)行了驗(yàn)證。GO富集結(jié)果顯示針刺主要干預(yù)了細(xì)胞生物合成過(guò)程、細(xì)胞脂質(zhì)代謝過(guò)程和轉(zhuǎn)運(yùn)，KEEG富集顯示，在信號(hào)通路中影響最大的是SNARE相關(guān)囊泡運(yùn)動(dòng)，可能為刺激該穴位組調(diào)控的最相關(guān)生物學(xué)過(guò)程[12]。

3 電針刺激量的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

針灸及電針的刺激量改變對(duì)臨床療效產(chǎn)生不同影響，針對(duì)刺激量、刺激方式的研究能夠進(jìn)一步優(yōu)化針刺方案，機(jī)制研究則能夠?qū)Ψ桨竷?yōu)選的原因進(jìn)行科學(xué)闡釋[13-14]。Wang等應(yīng)用cDNA微陣列技術(shù)研究了低頻(2 Hz)和高頻(100 Hz)電針足三里、三陰交對(duì)大鼠弓狀核轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)2 Hz電針能夠調(diào)控154個(gè)基因，比100 Hz電針調(diào)控的66個(gè)基因更多，且GO與KEGG結(jié)果顯示差異基因的功能與神經(jīng)傳導(dǎo)密切相關(guān)。研究者挑選了6個(gè)差異基因進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組吻合。另外，在下丘腦中，6個(gè)差異基因中的5個(gè)卻無(wú)明顯差異，說(shuō)明電針頻率帶來(lái)的調(diào)控變化是在弓狀核中特異性響應(yīng)的，這可能與弓狀核聚集了許多重要神經(jīng)元群相關(guān)[15]。

4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在針灸干預(yù)疾病機(jī)制研究中的應(yīng)用

4.1 疼痛

針刺在緩解不同原因的疼痛中被廣泛應(yīng)用，Wang等[16]證實(shí)在電針刺激大鼠足三里穴、三陰交后，大鼠的傷害感受性閾值增高，進(jìn)一步應(yīng)用cDNA微陣列法測(cè)定不同敏感度大鼠第5、6腰椎脊髓背角的轉(zhuǎn)錄組變化，結(jié)果顯示在高敏感度大鼠中，與神經(jīng)活性配體-受體相互作用有關(guān)的基因受到更明顯的調(diào)控，而低敏感度大鼠中促炎性細(xì)胞因子釋放的相關(guān)基因受到更顯著上調(diào)，apelin-Aplnr系統(tǒng)將是可能參與電針鎮(zhèn)痛的新候選系統(tǒng)。在后續(xù)研究中，該課題組對(duì)電針鎮(zhèn)痛的時(shí)間效應(yīng)進(jìn)行了深入探究，將對(duì)照組與2 Hz、100 Hz電針組分為1 h、24 h亞組，證實(shí)低頻電針療效高于高頻電針，并對(duì)脊髓背角也進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?；蚬δ芨患@示，脊髓背角中變化的基因富集在突觸傳遞、行為和形態(tài)3個(gè)類別中，而導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)被調(diào)控的基因除上述3類還與神經(jīng)系統(tǒng)表型相關(guān)。結(jié)果說(shuō)明電針調(diào)控疼痛感受閾值的模式在不同中樞神經(jīng)系統(tǒng)不盡相同[17]。Hu等[18]對(duì)山羊進(jìn)行了電針與對(duì)照組的鎮(zhèn)痛機(jī)制探究，中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)的RNA-seq結(jié)果表明：電針調(diào)控疼痛閾的相關(guān)因素包括腦啡肽原、阿片黑皮素原前強(qiáng)啡肽、地西泮結(jié)合抑制劑和前蛋白轉(zhuǎn)化酶1抑制劑，而谷氨酸能突觸、GABA能突觸、MAPK、核糖體和泛素蛋白酶體相關(guān)作用通路也發(fā)揮了重要作用。Zhou等[19]通過(guò)建立弗氏完全佐劑模型探究電針的鎮(zhèn)痛作用于慢性炎性疼痛的轉(zhuǎn)錄組變化，RNA-seq顯示鈣電壓門(mén)控通道亞基(Cacna1e)和鈣電壓門(mén)控通道輔助亞基(Cacng5)可能參與了慢性炎性疼痛的調(diào)節(jié)。

在艾灸鎮(zhèn)痛的機(jī)制研究中，Yin等[20]對(duì)比了健康大鼠和慢性炎性疼痛大鼠在艾灸足三里后，皮膚組織發(fā)生的轉(zhuǎn)錄組改變，GO與KEGG分析顯示，艾灸對(duì)健康大鼠的皮膚干預(yù)主要與生理?xiàng)l件下的代謝有關(guān)，而對(duì)于慢性炎性疼痛大鼠，差異基因則與抗原加工傳遞途徑、細(xì)胞毒性等免疫相關(guān)途徑更加相關(guān)。結(jié)果證實(shí)即使在相同刺激條件下，疼痛模型中艾灸部位的信號(hào)通路也有不同的激活情況。

4.2 抑郁

為了探究針灸抗抑郁的機(jī)制，Wang等[21]采用RNA-seq法針對(duì)額葉的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了組間兩兩比較，對(duì)照組-模型組與氟西汀組-針刺組的差異集中在下調(diào)表達(dá)的基因，主要功能為神經(jīng)發(fā)育、炎癥、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞通訊。GO分析結(jié)果主要涉及細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、分子功能和質(zhì)膜外部情況，KEGG差異主要為趨化因子信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路和胞質(zhì)DNA感應(yīng)途徑，以上結(jié)果與先前報(bào)道中觀察到的重要病理特征相吻合。該課題組后續(xù)對(duì)海馬的轉(zhuǎn)錄組亦進(jìn)行了測(cè)序，結(jié)果表明氟西汀和針灸都能很好地緩解慢性約束應(yīng)激所致的抑郁樣行為，而從轉(zhuǎn)錄組學(xué)的角度而言，針刺起著更廣泛的作用，兩者差異集中表現(xiàn)在應(yīng)激誘導(dǎo)的生物過(guò)程改變，包括趨化性、炎癥反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、衰老、糖皮質(zhì)激素刺激反應(yīng)、免疫反應(yīng)、藥物反應(yīng)和細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)[22]。王瑜通過(guò)RNA-seq法對(duì)慢性束縛應(yīng)激模型抑郁大鼠進(jìn)行針灸機(jī)制探究，KEGG分析顯示針刺對(duì)抑郁樣行為的改善可能與海馬、額葉、垂體顯著上調(diào)基因所參與的組氨酸代謝、P-丙氨酸代謝、甘氨酸、絲氨酸與蘇氨酸代謝和葉綠素代謝有關(guān)；顯著下調(diào)基因主要參與Toll樣受體通路、趨化因子信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路和胞質(zhì)DNA傳感通路等；GO分析突出展示了炎癥反應(yīng)、對(duì)糖皮質(zhì)激素刺激的應(yīng)答、趨化作用、免疫應(yīng)答、凋亡負(fù)調(diào)控和趨化因子活化等主要相關(guān)生物過(guò)程[23]。

Zheng等[24]構(gòu)建母體分離抑郁模型，通過(guò)對(duì)比母體分離組、電針治療組與假針刺治療組的行為學(xué)差異確認(rèn)針灸療效，隨后對(duì)大鼠前額葉皮層進(jìn)行RNA-seq測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在模型組9個(gè)下調(diào)的基因中，其中3個(gè)(Ucp3，Cplx3，Dbp)可以通過(guò)電針處理逆轉(zhuǎn)。值得一提的是，研究者后續(xù)又進(jìn)行了LncRNA、MicroRNA及circRNA 3個(gè)類別的網(wǎng)絡(luò)聚類分析，通過(guò)構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步確認(rèn)了潛在靶基因。

4.3 帕金森

目前帕金森的藥物治療不良反應(yīng)較大，針灸療法以其安全性逐漸走進(jìn)國(guó)際視野，Yeong-Gon等對(duì)帕金森模型進(jìn)行了針灸穴位與非穴位的療效-機(jī)制探究，結(jié)果顯示針刺百會(huì)和印堂可降低紋狀體和黑質(zhì)區(qū)的酪氨酸羥化酶免疫反應(yīng)。與模型組比較，針灸能夠上調(diào)紋狀體中12個(gè)基因，下調(diào)19個(gè)基因。KEGG富集結(jié)果顯示，參與細(xì)胞間隙連接通訊的Gja4、Tuba8和參與MAPK信號(hào)通路的Ntf3在針刺穴位組被向下調(diào)節(jié)[25]。課題組在后續(xù)研究中對(duì)丘腦的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序顯示，針刺穴位組上調(diào)了18個(gè)基因，下調(diào)了14個(gè)基因，提示針刺具有對(duì)丘腦中多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞變性的抑制作用[26]。

另有Kim等學(xué)者獨(dú)辟蹊徑，著眼于針刺緩解帕金森藥物——左旋多巴誘發(fā)的非自主運(yùn)動(dòng)等并發(fā)癥，進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄差異探索。該研究的mRNA微陣列顯示，針刺后下丘腦中6個(gè)基因被上調(diào)，4個(gè)基因被下調(diào)，差異最明顯的基因?yàn)镻mch。后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明，Pmch基因通過(guò)針刺治療在下丘腦中被上調(diào)，MCH在帕金森小鼠中具有解毒動(dòng)力學(xué)作用，且MCH拮抗劑能夠阻斷這種作用。在此研究中，轉(zhuǎn)錄組僅作為篩選關(guān)鍵mRNA靶點(diǎn)的基礎(chǔ)手段，突出對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)的驗(yàn)證，思路更完整，對(duì)轉(zhuǎn)錄組后續(xù)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)具有重要啟示[27]。

4.4 高血壓

在針刺調(diào)控血壓的機(jī)制研究中，Ma等[28]對(duì)比針刺干預(yù)后延髓腹外側(cè)的轉(zhuǎn)錄組信息，發(fā)現(xiàn)差異基因功能主要為2種氧化還原敏感途徑——谷胱甘肽代謝和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子途徑，最相關(guān)的信號(hào)通路為MAPK信號(hào)通路，并進(jìn)一步對(duì)4個(gè)代表性基因(Cox5b、Sirt6、Nf1和Gabbr1)進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證，mRNA表達(dá)情況與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。王玉妹通過(guò)太沖組、非穴組、莫索尼定組和模型組的比較確認(rèn)針刺太沖穴的降壓作用，并對(duì)比了延髓、下丘腦和丘腦的轉(zhuǎn)錄組差異，證實(shí)針刺干預(yù)后，延髓中轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的GO功能變化集中在纖毛、睫狀體部和細(xì)胞突起等，下丘腦的變化主要為神經(jīng)肽受體結(jié)合、中樞神經(jīng)元發(fā)育，丘腦中差異功能主要為鈣黏蛋白結(jié)合、中樞神經(jīng)系統(tǒng)分解等。除下丘腦外，延髓、丘腦在太沖組與非穴組的差異基因均無(wú)明顯的GO功能差異，說(shuō)明穴位特異性可能主要與下丘腦的激活相關(guān)[29]。

4.5 胃腸疾病

Ho等[30]對(duì)電針改善結(jié)腸炎的作用機(jī)制進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果顯示電針在結(jié)腸組織中顯著影響IL-1和IL-1β信號(hào)通路，而細(xì)胞受體、Toll樣受體和T細(xì)胞受體等免疫相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)在脾臟中受調(diào)控變化明顯，說(shuō)明炎癥與免疫反應(yīng)是電針改善結(jié)腸炎的重要環(huán)節(jié)。姜帆等在電針干預(yù)術(shù)后腸麻痹小鼠小腸組織的轉(zhuǎn)錄本中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體互作、腫瘤壞死因子、神經(jīng)活性配體與受體互作3條信號(hào)通路可能與電針的調(diào)控作用密切相關(guān)，其關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的生物過(guò)程為細(xì)胞趨化性、白細(xì)胞遷移及炎性反應(yīng)等[31]。在便秘的針灸俞募配穴治療中，李穎進(jìn)行了對(duì)結(jié)腸、海馬的轉(zhuǎn)錄組差異研究，結(jié)果顯示海馬中被顯著性調(diào)控的基因48個(gè)，GO功能主要集中在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激應(yīng)答、抗氧化等方面，相關(guān)通路顯著富集于膽汁分泌相關(guān)途徑；結(jié)腸組織中，顯著性差異基因12個(gè)，GO相關(guān)結(jié)果為免疫反應(yīng)及脂蛋白調(diào)節(jié)，未富集到相關(guān)KEGG通路[32]。

4.6 其他

壽氏等[33]的芯片分析發(fā)現(xiàn)，缺血性中風(fēng)大鼠有627個(gè)特異表現(xiàn)的基因，而在針刺內(nèi)關(guān)干預(yù)后，其中3個(gè)基因被上調(diào)、358個(gè)基因被下調(diào)，上調(diào)的3個(gè)基因Tph1、Loc684158和Ccdc19主要富集在色氨酸代謝途徑。Tph1的上調(diào)表明針刺可能通過(guò)促進(jìn)腦內(nèi)5-HT的水平而對(duì)中風(fēng)后抑郁產(chǎn)生潛在影響[34]。壽崟等重點(diǎn)關(guān)注了電針雙側(cè)足三里、脾俞穴后，2型糖尿病小鼠血糖水平的改善以及血漿外泌體circRNA的變化，發(fā)現(xiàn)電針能夠上調(diào)2型糖尿病特異性基因21個(gè)，差異circRNA功能主要集中在細(xì)胞大分子代謝過(guò)程，信號(hào)通路以甲狀腺激素信號(hào)通路的改變最為突出。Garcia-Vivas等對(duì)肥胖婦女艾灸后的血清、腹部皮下脂肪進(jìn)行了cDNA微陣列測(cè)定，在芯片包含的45 035個(gè)基因中，8 025個(gè)(17.84%)基因在腹部皮脂中表達(dá)，1 791個(gè)(3.97%)基因被干預(yù)調(diào)控(1 548個(gè)上調(diào)，243個(gè)下調(diào))，其中肥胖相關(guān)基因磷脂酶c(PLCB4、PLCXD3、PLCZ1和PLCB1)的激活值得重點(diǎn)關(guān)注與后續(xù)深入研究[35]。Liu等進(jìn)行了電針干預(yù)亞急性衰老模型轉(zhuǎn)錄組差異的研究，3個(gè)組的轉(zhuǎn)錄本交叉集合顯示，電針能夠逆轉(zhuǎn)亞急性衰老78個(gè)基因的下調(diào)，電針干預(yù)的基因功能以轉(zhuǎn)運(yùn)的正向調(diào)節(jié)、電壓門(mén)控鉀通道復(fù)合物和維生素結(jié)合為主[36]。Cheng等[37]對(duì)兩組接受胚胎移植的育齡不育婦女子宮內(nèi)膜樣本進(jìn)行收集，其中一組曾予針灸及艾灸干預(yù)，兩組樣本差異mRNA的GO功能大多與細(xì)胞運(yùn)輸有關(guān)，主要關(guān)聯(lián)途徑為氧化磷酸化、礦物質(zhì)吸收和代謝相關(guān)途徑等。另外，還對(duì)lncRNA-miRNA-mRNA關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了可視化構(gòu)建，并選取其中5個(gè)差異基因進(jìn)行了驗(yàn)證。Chen等使用RNA-seq技術(shù)研究了針刺對(duì)視神經(jīng)損傷小鼠視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)錄組的影響。結(jié)果顯示，包括31個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的436個(gè)基因在損傷后發(fā)生了變化，其中包括Jun、Ddit3、Atf3和Atf4等與神經(jīng)變性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[38]。

5 小結(jié)

針灸機(jī)制的探究與眾多科學(xué)問(wèn)題的發(fā)展相同，都是在宏觀-微觀之間螺旋式上升的過(guò)程。轉(zhuǎn)錄組的研究即屬一個(gè)階段的“宏觀”，但仍具有數(shù)據(jù)冗雜、定量欠精確等局限性[39]。本研究整理了近10年轉(zhuǎn)錄組應(yīng)用于針灸研究的設(shè)計(jì)策略，對(duì)實(shí)驗(yàn)分組方式、取材部位及主要數(shù)據(jù)處理方法進(jìn)行了歸納。見(jiàn)表1。在正文中對(duì)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果亦進(jìn)行了總結(jié)，可為后續(xù)研究提供指向性線索。在技術(shù)方面，由于現(xiàn)階段各研究所側(cè)重的學(xué)說(shuō)與基礎(chǔ)設(shè)施條件不同，故對(duì)各家所采用的取穴、轉(zhuǎn)錄組方法未做出明確統(tǒng)計(jì)，以上條件可根據(jù)自身要求及研究目的進(jìn)行有的放矢的調(diào)整。從目前已發(fā)表的成果來(lái)看，相關(guān)研究的設(shè)計(jì)整體思路模式大致可總結(jié)如下：①設(shè)計(jì)問(wèn)題，確認(rèn)疾病與治療方式，設(shè)計(jì)分組，建立模型；②通過(guò)生物學(xué)、影像學(xué)等表型檢測(cè)確認(rèn)療效；③樣品取材，高通量測(cè)序；④數(shù)據(jù)整理，功能分析；⑤說(shuō)明結(jié)果，呈現(xiàn)機(jī)制假說(shuō)。轉(zhuǎn)錄組分析能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)宏觀數(shù)據(jù)的挖掘與闡釋，但如何再?gòu)暮暧^上升到微觀，是研究能否更加深入的關(guān)鍵。本研究提及Kim等[27]針對(duì)帕金森患者左旋多巴并發(fā)癥的針灸干預(yù)研究，在一定程度上實(shí)現(xiàn)了宏觀向微觀的轉(zhuǎn)變，在得到轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)后，研究者進(jìn)一步針對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因設(shè)計(jì)了邏輯關(guān)系較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)尿?yàn)證實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)靶點(diǎn)基因的上調(diào)、抑制，在一定程度上實(shí)現(xiàn)了假說(shuō)的閉環(huán)，雖然中間環(huán)節(jié)仍需進(jìn)一步探索，但相較其他許多研究已足顯嚴(yán)謹(jǐn)，其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路值得借鑒。

表1 轉(zhuǎn)錄組在針灸機(jī)制研究中的研究策略比較

大數(shù)據(jù)研究的趨勢(shì)逐漸滲入到醫(yī)學(xué)研究的每個(gè)角落，系統(tǒng)生物學(xué)與組學(xué)研究無(wú)疑是理念與技術(shù)更迭中的代表，而組學(xué)又可細(xì)分為基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組及脂質(zhì)組等，以上高通量技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到疾病特點(diǎn)探索與治療機(jī)制挖掘中[40-41]。中醫(yī)學(xué)重視整體、統(tǒng)一的觀念，但如何將其具象地表達(dá)并具有科學(xué)性，一直是科研工作者們追求的目標(biāo)。以中藥的作用機(jī)制探索為例，通過(guò)藥材成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)、疾病差異基因數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)挖掘(如中藥藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)、GeneCrads數(shù)據(jù)庫(kù)等[42-43])，探究傳統(tǒng)醫(yī)藥針對(duì)不同疾病、不同證型的作用靶點(diǎn)和作用途徑，近年來(lái)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，系統(tǒng)藥理學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等新興學(xué)科應(yīng)運(yùn)而生[44]。反觀針灸相關(guān)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究，雖亦能夠應(yīng)用組學(xué)等高通量方法，但卻囿于手法、個(gè)體差異等因素，無(wú)法建立固定數(shù)據(jù)庫(kù)，故如何對(duì)新技術(shù)加以妥善運(yùn)用，突破目前的研究局限，是每一個(gè)針灸科研人都該思索的問(wèn)題。

綜上，在針灸的相關(guān)研究中引入轉(zhuǎn)錄組學(xué)等高通量技術(shù)，既是挖掘針灸基礎(chǔ)效應(yīng)的機(jī)遇，又是對(duì)研究者科研思維、研究設(shè)計(jì)的挑戰(zhàn)。如何深層次理解、把握多個(gè)學(xué)科間的交叉關(guān)聯(lián)，克服技術(shù)局限，突破研究困境，將成為取得科學(xué)突破的要點(diǎn)。相信在多學(xué)科、多領(lǐng)域互融互利的趨勢(shì)引領(lǐng)下，針灸基礎(chǔ)研究能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)代化新進(jìn)展。