桑黃多糖的分離純化、生物活性及其產(chǎn)品開發(fā)研究進(jìn)展

李彥穎 張 祺 陳曉華 張安強(qiáng)*

（1. 浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州 310014；2. 浙江千濟(jì)方醫(yī)藥科技有限公司，浙江 杭州 311710）

桑黃別稱桑臣、桑耳或胡孫眼等[1]，是一種珍貴的藥用真菌，隸屬于擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科，在過去長(zhǎng)期列為針層孔菌屬（Phellinus），主要包括火木針層孔菌（Phellinus igniarius）、裂蹄針層孔菌（P. linteus）和鮑氏針層孔菌（P. baumii）[2]。桑黃通常寄生于桑、柳、楊、樺、山楂等闊葉樹上，又分為桑樹桑黃、楊樹桑黃、樺樹桑黃等不同種類[3]。桑黃的種類及學(xué)名一直存在爭(zhēng)議，隨著桑黃新屬的發(fā)現(xiàn)，桑樹桑黃學(xué)名被定為Sanghuangporus sanghuang，目前所知的桑黃孔菌屬有14種，市售常見的多為楊樹桑黃（S. vaninii）和暴馬桑黃（S. baumii）[4]。

桑黃味苦，性寒無毒，具有十分重要的藥用價(jià)值。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)桑黃含有多糖、萜類、黃酮類、吡喃酮類、酚類、香豆素類、甾體類、生物堿類等藥用活性物質(zhì)[5]。多糖是其主要活性成分之一，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、降血糖、抗炎癥、抗氧化、護(hù)肝等生物活性[5,6]。

1 桑黃多糖的提取、分離純化及其結(jié)構(gòu)分析

1.1 桑黃多糖的提取

桑黃多糖主要從子實(shí)體、菌絲體及發(fā)酵液中提取，目前常用的提取方法有熱水浸提法、酶提取法、堿提法、超聲波提取法和微波提取法等（表1）。為縮短提取周期、提高多糖得率及降低生產(chǎn)成本，還可多種方法協(xié)同提取，如超聲波協(xié)同酶法、超聲波輔助熱水提取等。提取過程的溫度、料液比、提取時(shí)間、萃取介質(zhì)、超聲功率等條件均會(huì)影響多糖得率，故須對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化。

表1 桑黃多糖的提取工藝

1.2 桑黃粗多糖分離純化前的預(yù)處理

桑黃粗多糖常含有大量蛋白質(zhì)、色素及低聚糖等小分子雜質(zhì)，因而在粗多糖分離純化前須對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理。傳統(tǒng)的脫蛋白質(zhì)方法有Sevag法、三氯乙酸沉淀法、蛋白酶水解法、鞣酸法、鹽酸法等[16]。其中Sevag法在真菌多糖中應(yīng)用較為廣泛，即根據(jù)蛋白質(zhì)在氯仿等有機(jī)溶劑中變性的特點(diǎn)，將多糖溶液、氯仿、正丁醇的比例調(diào)節(jié)為25∶5∶1或25∶4∶1，振蕩搖勻，然后離心除去凝膠狀的變性蛋白質(zhì)，但需多次重復(fù)處理才能收到較好的效果[17]。三氯乙酸沉淀法是在有機(jī)酸的作用下，使蛋白質(zhì)分子形成不可逆沉淀。在多糖水溶液中加入等體積的5%～10%三氯乙酸，混勻后靜置過夜，離心除去沉淀，重復(fù)操作多次可得到無蛋白多糖[18]。

去除蛋白質(zhì)之后，通常采用活性炭、大孔樹脂、H2O2等對(duì)粗多糖提取液進(jìn)行脫色處理[19]。由于多糖提取液中富含酮類、酚類、醌類等物質(zhì)，這類色素大多呈負(fù)性離子，使用活性炭法脫色并不能達(dá)到很好的效果，而過氧化氫法對(duì)于負(fù)性離子有很好的脫色作用[20]。相比于采用活性炭、過氧化氫等脫色方法，樹脂法脫色率較高，脫色的多糖生物活性較好[21]。另外，桑黃多糖中的小分子雜質(zhì)如低聚糖、無機(jī)鹽等可通過透析、超濾等方法除去[22]。

1.3 桑黃多糖的分離純化和結(jié)構(gòu)分析

為了更好地研究多糖的生物學(xué)活性及其與結(jié)構(gòu)組成的關(guān)系，得到一定分子量范圍的均一多糖，須對(duì)多糖混合物進(jìn)行分離純化。目前桑黃多糖的分離純化通常采用離子交換層析和凝膠分子篩層析相結(jié)合的方法等，其純度和分子量可通過高效液相色譜（HPLC）測(cè)定，結(jié)合紅外光譜（IR）、紫外光譜（UV）、質(zhì)譜（MS）、核磁共振（NMR）、甲基化分析、Smith降解等進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定分析?？偨Y(jié)近幾年來桑黃多糖研究的分析結(jié)果見表2。

表2 桑黃多糖的結(jié)構(gòu)分析

2 桑黃多糖的生物活性

2.1 抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移

據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，桑黃多糖具有良好的抑制腫瘤作用，能夠刺激淋巴T、B細(xì)胞的產(chǎn)生，激活巨噬細(xì)胞、活化自然殺傷細(xì)胞從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[32]；能通過促進(jìn)H22荷瘤小鼠血清細(xì)胞因子IL-2、IL6、TNF-α的產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)，對(duì)抑制腫瘤有一定效果[33]。桑黃多糖還可通過改變腫瘤細(xì)胞周期，引起腫瘤細(xì)胞凋亡，桑黃多糖P1下調(diào)了HepG2 細(xì)胞中CaM、CaMKⅡ、EGF、EGFR、K-ras和c-fos基因的表達(dá)水平，提高了細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，說明其可能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞S周（DNA合成期）阻滯從而抑制HepG2細(xì)胞增殖[34]。桑黃蛋白多糖P1對(duì)人肝癌細(xì)胞（HepG2）具有顯著的抗腫瘤活性，P1處理的HepG2細(xì)胞中鈣網(wǎng)蛋白、細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白E和CDK2的表達(dá)顯著下調(diào)，而P27kip1和細(xì)胞周期蛋白A的表達(dá)顯著上調(diào)，說明其作用機(jī)制通過降低鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)和激活P27kip1-cyclin A/D1/E-CDK2途徑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞S期阻滯[35]。

調(diào)節(jié)血管生成的所有分子途徑平衡被破壞時(shí)，就會(huì)引起病理性血管生成，而這一過程可能會(huì)導(dǎo)致包括癌癥在內(nèi)的許多疾病產(chǎn)生[36]。桑黃多糖可有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分化，且抑制作用與桑黃多糖濃度呈正相關(guān)，抑制作用在質(zhì)量濃度為0.5 g/L 時(shí)最強(qiáng)，此外還能降低雞胚尿攮膜（CAM）血管的生成、血管密度和分支等[37]。

在治療癌癥方面，單純的化學(xué)療法不能達(dá)到完全預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的效果，并會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用。桑黃多糖可聯(lián)合化療藥物發(fā)揮積極作用，如聯(lián)合環(huán)磷酰胺可有效抑制肝癌腹水荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞增殖，發(fā)揮減毒增效作用，其機(jī)制可能與下調(diào)PI3K/AKT/mTOR通路的表達(dá)有關(guān)[38]。

2.2 免疫調(diào)節(jié)

研究表明，桑黃多糖可促進(jìn)免疫抑制小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖，提高脾、腹膜自然殺傷（NK）細(xì)胞以及骨髓細(xì)胞活性、細(xì)胞因子水平和T淋巴細(xì)胞數(shù)量[39]。其免疫調(diào)節(jié)包括促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖、增強(qiáng)細(xì)胞吞噬活性和促進(jìn)TNF-和IL-6的分泌[40]。桑黃多糖能夠特異性刺激受體TLR4并激活MyD88和TRIF途徑，顯著提高血清OVA特異性抗體和脾細(xì)胞的增殖[41]。

2.3 降血糖

真菌多糖具有良好的降糖效果，其主要通過影響糖代謝，調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞和增強(qiáng)胰島素敏感性以及增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激而發(fā)揮降血糖功能并緩解糖尿病癥[42]。研究結(jié)果顯示，桑黃多糖可平衡PC/PE比值和激活胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來改善胰島素抵抗，從而顯著降低血糖水平[43]；桑黃多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶有較高的抑制活性，對(duì)葡萄糖的擴(kuò)散有明顯的抑制作用[44]。

2.4 抗炎

炎癥反應(yīng)是臨床常見的一個(gè)病理過程，研究發(fā)現(xiàn)桑黃多糖可以降低促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12）含量及mRNA轉(zhuǎn)錄，提高抗炎細(xì)胞因子（IL-4和IL-10）含量和mRNA表達(dá)水平，其作用可能與抑制NF-κB易位、增加AMPKα的磷酸化及調(diào)節(jié)抗炎和促炎因子的平衡相關(guān)[45]。桑黃多糖可調(diào)節(jié)PPARα和PPARγ磷酸化以及阻斷MAPK活化，其抗炎機(jī)制可能是參與MAPK和PPAR信號(hào)通路，從而降低炎癥細(xì)胞因子表達(dá)[46]。

2.5 抗氧化

自由基是引起人體疾病和衰老的原因之一，當(dāng)人體內(nèi)的自由基消除過慢或產(chǎn)生過多時(shí)，機(jī)體就會(huì)受到相應(yīng)的損害，從而誘發(fā)各種疾病，加速人體的衰老[47]。桑黃菌絲體多糖體外抗氧化活性的研究結(jié)果表明，其對(duì)ABTS+·和DPPH·的最高清除率分別為73.54%和88.83%，并有較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系[48]。以總抗氧化能力、清除DPPH自由基能力、清除羥基自由基能力、對(duì) Fe2+螯合能力、超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定評(píng)價(jià)桑黃多糖抗氧化活性的研究發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)期的桑黃菌絲體多糖表現(xiàn)不同抗氧化性，生長(zhǎng)期短的菌絲多糖抗氧化性更強(qiáng)，但活性不如子實(shí)體多糖[49]。

2.6 其他

桑黃多糖還具有抗疲勞、抗衰老和護(hù)肝等生物活性。對(duì)小鼠進(jìn)行抗疲勞、耐缺氧能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，桑黃多糖可以有效延長(zhǎng)小鼠游泳時(shí)間以及在缺氧環(huán)境和亞硝酸鈉中毒環(huán)境下的存活時(shí)間[50]。桑黃多糖可以延長(zhǎng)果蠅平均壽命和最長(zhǎng)壽命，提高衰老小鼠血清、腦、肝組織中的超氧化物歧化酶（SOD）活性[51]。

3 桑黃多糖的產(chǎn)品開發(fā)

隨著健康意識(shí)的增強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)豐富、具有保健功效的食藥用菌越來越受消費(fèi)者歡迎。桑黃富含多糖、甾類、三萜、黃酮等生物活性物質(zhì)，可廣泛應(yīng)用于食品、藥品以及護(hù)膚品等各個(gè)領(lǐng)域，其中多糖作為其主要活性成分，具有抗癌、提高免疫力、降低血糖血脂、保護(hù)肝臟、抗氧化等功能，且無毒副作用，成為產(chǎn)品開發(fā)關(guān)注的焦點(diǎn)。學(xué)者以桑黃菌絲多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)化桑黃液體發(fā)酵茶飲料工藝條件，得到具有桑黃特有風(fēng)味、甜爽適口的發(fā)酵茶飲料，其中菌絲多糖含量為0.064 g/100mL[52]。研制出的桑黃發(fā)酵多糖膠囊，以D-半乳糖衰老小鼠為模型，發(fā)現(xiàn)其具有抗衰老效果，且可有效保護(hù)小鼠肝臟細(xì)胞免受免疫性損傷，不表現(xiàn)出毒副作用[53]。研制的富含多糖的桑黃保健口服液，可明顯增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（PM）的吞噬能力，提高小鼠的免疫功能[54]。

4 展 望

桑黃作為一種藥用價(jià)值高的珍貴藥用真菌，需求量逾來逾大，開發(fā)前景廣闊。近年來，桑黃的人工栽培技術(shù)不斷成熟，促進(jìn)了桑黃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)桑黃多糖的結(jié)構(gòu)和生物活性的研究不斷深入，研發(fā)出一系列以桑黃多糖為主要成分的產(chǎn)品。雖然關(guān)于桑黃多糖的提取分離、初步結(jié)構(gòu)鑒定和藥理作用的報(bào)道較多，但桑黃多糖的單糖組成、分子量、溶解度和鏈構(gòu)象等在生物活性中的作用尚未得到充分的認(rèn)識(shí)，應(yīng)進(jìn)一步探究，為桑黃更好地應(yīng)用于食品、藥品、保健品和化妝品等領(lǐng)域提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支持，實(shí)現(xiàn)桑黃多糖產(chǎn)品大規(guī)模、大范圍地投入市場(chǎng)。