馬陰道微生態(tài)制劑的制備工藝研究

張 昱，蘇少鋒，常 嶸，白 娜，張子玉，張澤云，張振奇，朱崇瑤，程 超

（1.集寧師范學院生命科學與技術學院，內蒙古 集寧區(qū) 012000；2.內蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院，內蒙古 呼和浩特010031）

陰道是一個復雜、動態(tài)的微生態(tài)體系。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）在陰道微生物菌群中占主導地位，因其能夠抑制病原體增殖，被認為是健康陰道微生物菌群中的優(yōu)勢物種［1］。乳酸菌的存在是評價陰道健康水平的重要指標之一，而缺乏乳酸菌會破壞陰道微生物菌群平衡，降低免疫屏障功能，繼而引發(fā)由細菌、真菌和衣原體感染以及寄生蟲病等［2］。蒙古馬作為我國的優(yōu)秀馬種之一，遺傳、育種、繁殖與生殖健康息息相關。生殖健康水平與蒙古馬的受胎率、產(chǎn)肉量、產(chǎn)奶量、飼料消耗量等密切相關，影響馬養(yǎng)殖業(yè)的生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益，對現(xiàn)代馬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有決定性作用。目前，獸醫(yī)臨床針對馬生殖道疾病的治療手段主要是抗生素療法和中藥療法。抗生素治療可明顯改變馬生殖道內的微生態(tài)環(huán)境，造成菌群種類失調，進而導致治療效果不佳、復發(fā)率高等問題。中藥以其低毒性、不易產(chǎn)生病原微生物耐藥性等優(yōu)點被廣泛應用，但存在治療周期長、見效緩慢等缺點。

微生態(tài)制劑是運用微生態(tài)學原理，將對宿主有益無害的益生菌或益生菌促生長物質經(jīng)特殊工藝制成的制劑。微生態(tài)制劑因無殘留、無耐藥性、無毒副作用、效果顯著、不污染環(huán)境等優(yōu)點成為抗生素的理想替代品，可減少畜禽產(chǎn)品中的藥物殘留和耐藥性有害菌的污染，目前被應用于飼料、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥保健和食品等領域［3］。微生態(tài)制劑研究更側重菌種的篩選及開發(fā)，生產(chǎn)工藝復雜，制備環(huán)節(jié)技術要求較高［4］。當前，市售動物用微生態(tài)制劑產(chǎn)品的質量品質及效果良莠不齊，為了進一步推動動物用微生態(tài)制劑的生產(chǎn)和發(fā)展，需要優(yōu)化生產(chǎn)工藝，提高生產(chǎn)質量［5］。該研究以前期從健康母馬陰道內分離篩選的優(yōu)勢乳酸菌菌株為研究對象，對微生態(tài)制劑制備工藝的關鍵參數(shù)進行優(yōu)化，以期為確定最佳的治療馬陰道炎癥微生態(tài)制劑的制備工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

格氏乳桿菌（Lactobacillus gasseri），由內蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院研究團隊從健康蒙古馬母馬陰道中分離、鑒定并保存。

1.1.2 主要試劑

淀粉、微粉硅膠、微晶纖維素、乳糖、蔗糖、葡萄糖、大豆胨、酵母粉、胰酪蛋白胨，購自江蘇聯(lián)瑞新材料股份有限公司。

1.1.3 主要儀器設備

多功能藥用機，型號：DGN-Ⅱ，購自上海辰環(huán)機械制造有限公司；真空冷凍干燥機，型號：SCIENTZ-10YG/A，購自寧波新芝凍干設備有限公司；發(fā)酵設備，型號：KRH-PJ-50L，購自鎮(zhèn)江東方生物工程設備技術有限責任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌粉制備工藝

1.2.1.1 菌株發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

采用Box-Behnken試驗設計，以不同碳源（乳糖、蔗糖、葡萄糖）以及不同氮源（大豆胨、酵母粉、胰酪蛋白胨）為因素，以活菌數(shù)及存活率為響應值，運用Design-Expert軟件進行分析，篩選出最佳的菌株培養(yǎng)基。碳源對格氏乳桿菌發(fā)酵性能影響的響應面試驗因素水平設計見表1，氮源對格氏乳桿菌發(fā)酵性能影響的響應面試驗因素水平設計見表2。

表1 碳源響應面試驗因素設計 單位：%

表2 氮源響應面試驗因素設計 單位：%

1.2.1.2 菌株發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化

采用單因素法測定不同工藝參數(shù)下格氏乳桿菌的活菌數(shù)以及存活率，確定菌株發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)。

1.2.1.2.1 不同初始pH值對格氏乳桿菌生長發(fā)酵性能的影響

將格氏乳桿菌接種于初始pH值為6.0、6.3、6.6、6.9、7.2經(jīng)優(yōu)化的液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液終點活菌數(shù)。試驗重復3次，結果取平均值。

1.2.1.2.2 不同培養(yǎng)溫度對格氏乳桿菌生長發(fā)酵性能的影響

將格氏乳桿菌接種于溫度為34、37、40℃經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液終點的活菌數(shù)。試驗重復3次，結果取平均值。

1.2.1.2.3 不同接種量對格氏乳桿菌生長發(fā)酵性能的影響

將格氏乳桿菌按2%、4%、6%、8%、10%的量接種于經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液終點的活菌數(shù)。試驗重復3次，結果取平均值。

1.2.1.3 菌粉制備

將格氏乳桿菌接種于經(jīng)優(yōu)化的液體培養(yǎng)基，以優(yōu)化的工藝參數(shù)進行厭氧培養(yǎng)至終點，離心棄去上清液，加入脫脂乳攪拌均勻，置于真空冷凍干燥機中進行真空冷凍干燥，將干燥好的菌粉粉碎，置于-20℃冰箱中保存。

1.2.2 微生態(tài)制劑制備工藝

1.2.2.1 輔料配比優(yōu)化

采用Box-Behnken試驗設計，以淀粉、微晶纖維素、微粉硅膠為因素，以活菌數(shù)為響應值，運用Design-Expert進行分析，確定輔料最佳配比。輔料優(yōu)化響應面試驗因素設計見表3。

表3 輔料優(yōu)化響應面試驗因素設計 單位：%

1.2.2.2 設備工藝參數(shù)優(yōu)化

在超凈臺內準確稱量格氏乳桿菌菌粉與上述優(yōu)化配比的輔料進行混合，放入多功能藥用機物料斗，以10、20、40 r/min的轉速，以30°、45°、60°的不同角度混合，待混合好后從物料斗內不同位置取3個樣本，進行活菌數(shù)檢測，確定多功能藥用機在制劑制備過程中最佳的工藝參數(shù)。

1.2.2.3 微生態(tài)制劑制備

根據(jù)上述優(yōu)化的制劑工藝參數(shù)進行微生態(tài)制劑制備。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS20.0和GraphPad Prism6軟件進行方差分析及制圖。P<0.05表示達到顯著水平，P<0.01表示達到極顯著水平。

2 結果與分析

2.1 菌粉制備工藝參數(shù)的優(yōu)化

2.1.1 碳源的確定

碳源各因素經(jīng)過擬合得到的回歸方程均為二次多項式回歸模型方程。

發(fā)酵液活菌數(shù)的回歸方程為：Y=10.70-0.18X1-0.21X2+2.97X3+0.17X1X2+0.017X1X3-0.15X2X3-2.21X12-0.28X22+2.60X32。

菌粉活菌數(shù)的回歸方程為：Y=456.22-0.85X1-3.63X2+50.78X3-0.25X1X2-1.45X1X3-10.50X2X3-116.21X12-43.26X22+34.54X32。

凍干存活率的回歸方程為：Y=48.34+0.80X1+0.72X2-5.07X3-0.60X1X2-0.13X1X3-0.26X2X3-3.42X12-3.67X22-4.88X32。

Design Expert軟件進行的ANOVA分析表明P<0.05，模型是顯著的。發(fā)酵液活菌數(shù)回歸模型的決定系數(shù)為0.459 2，菌粉活菌數(shù)回歸模型的決定系數(shù)為0.756 0，凍干存活率回歸模型的決定系數(shù)為0.859 2，說明該模型擬合程度良好，可用該模型分析與預測最佳碳源配比。

利用Design Expert軟件進行二次多元回歸擬合，得到的二次回歸方程的響應面見圖1。

圖1 碳源二次回歸方程響應面圖

通過回歸系數(shù)絕對值大小分析不同碳源對發(fā)酵液活菌數(shù)、菌粉活菌數(shù)、凍干存活率的影響，利用Design-Expert軟件進行試驗結果優(yōu)化。結果表明，3種碳源對格氏乳桿菌發(fā)酵性能影響大小依次為：乳糖（1.366%）>蔗糖（0.674%）>葡萄糖（0.672%）。由此可見，乳糖對格氏乳桿菌發(fā)酵性能影響最大。

2.1.2 氮源的確定

氮源各因素經(jīng)過擬合得到的回歸方程均為二次多項式回歸模型方程。

發(fā)酵液活菌數(shù)的回歸模型方程為：Y=5.41+0.70X1+0.62X2-2.500E-003X3+0.29X1X2+0.10X1X3-0.060X2X3。

菌粉活菌數(shù)的回歸模型方程為：Y=225.80+21.25X1+15.13X2-1.88X3+8.00X1X2+5.00X1X3+1.25X2X3-19.28X12-9.03X22-11.02X32。凍干存活率的回歸模型方程為：Y=47.69-0.88X1-1.63X2-0.41X3-0.45X1X2+0.27X1X3+0.80X2X3-2.88X12-2.29X22-3.60X32。

利用Design Expert軟件進行ANOVA分析表明P<0.05，模型是顯著的。發(fā)酵液活菌數(shù)回歸模型的決定系數(shù)為0.921 3，菌粉活菌數(shù)回歸模型的決定系數(shù)為0.891 7，凍干存活率回歸模型的決定系數(shù)為0.884 4，說明該模型擬合程度良好，可用該模型分析與預測最佳氮源配比。

利用Design Expert軟件進行二次多元回歸擬合，得到的二次回歸方程的響應面見圖2。

圖2 氮源二次回歸方程響應面圖

通過回歸系數(shù)絕對值大小分析不同氮源對發(fā)酵液活菌數(shù)、菌粉活菌數(shù)、凍干存活率的影響，利用Design-Expert軟件進行試驗結果優(yōu)化。結果表明，3種氮源對格氏乳桿菌發(fā)酵性能影響大小依次為：大豆胨（0.626%）>胰酪蛋白胨（0.614%）>酵母粉（0.504%）。由此可見，大豆胨對格氏乳桿菌發(fā)酵性能影響最大。

2.1.3 初始pH值的確定

由圖3可知，初始pH值為6.6時格氏乳桿菌發(fā)酵活菌數(shù)最高。

圖3 不同初始pH值對格氏乳桿菌生長發(fā)酵性能的影響

2.1.4 培養(yǎng)溫度的確定

由圖4可知，40℃時格氏乳桿菌發(fā)酵活菌數(shù)最高。

圖4 不同培養(yǎng)溫度對格氏乳桿菌生長發(fā)酵性能的影響

2.1.5 接種量的確定

由圖5可知，當接種量為6%時格氏乳桿菌生長發(fā)酵活菌數(shù)最高。

圖5 不同接種量對格氏乳桿菌生長發(fā)酵性能的影響

2.2 微生態(tài)制劑制備工藝參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 輔料配比的確定

采用Design-Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進行ANOVA分析，不同輔料因素經(jīng)過擬合得到的回歸方程為二次多項式回歸模型方程： Y=70.80+3.25X1+2.88X2-1.38X3+0.25X1X2-1.25X1X3+4.50X2X3-13.90X12-8.15X22-1.65X32。

利用Design-Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進行的ANOVA分析表明P<0.05，模型是顯著的，回歸模型的決定系數(shù)為0.7668，說明該模型擬合程度良好，可用該模型分析與預測最佳輔料配比。通過F檢驗判定模型的準確性，該模型的P值<0.000 1，表明該模型在99%水平上顯著；其失擬值為0.458 6>0.05，未達到顯著水平，表明模型較準確。

由圖6可知，淀粉的添加量不變，活菌數(shù)隨微晶纖維素接種量的增加而增加，當接種量超過0.8%時，活菌數(shù)開始下降。

圖6 微晶纖維素和改性淀粉對格氏乳桿菌活菌數(shù)的影響

由圖7可知，微粉硅膠的添加量不變，隨著微晶纖維素接種量的增加，活菌數(shù)先增加后降低，該圖中活菌數(shù)可取到最大值。等高線為橢圓形，說明溫度與接種量的交互作用顯著。

圖7 微晶纖維素和微粉硅膠對格氏乳桿菌活菌數(shù)的影響

由圖8可知，微粉硅膠的添加量不變，隨著淀粉接種量的增加，活菌數(shù)先升高后降低。等高線為橢圓形，說明淀粉與微粉硅膠的交互作用顯著。

圖8 微粉硅膠和改性淀粉對格氏乳桿菌活菌數(shù)的影響

利用Design-Expert軟件進行試驗結果優(yōu)化，得到優(yōu)化結果為：當微粉硅膠添加量為0.952%、微晶纖維素添加量為0.59%、淀粉添加量為98.56%時，格氏乳桿菌活菌數(shù)可達最高。

2.2.2 多功能藥用機轉速的確定

由表4可知，多功能藥用機在轉速為20 r/min時，格氏乳桿菌的活菌數(shù)比在其他兩個轉速下制備制劑顯著升高（P<0.05），說明該條件下的工藝參數(shù)為最佳混勻工藝參數(shù)。

表4 轉速對制劑活菌數(shù)的影響（n=3，X±S）

2.2.3 多功能藥用機混合角度的確定

由表5可知，多功能藥用機在混合角度為60°時，格氏乳桿菌的活菌數(shù)比在其他兩個轉速下制備制劑顯著升高（P<0.05），說明該條件下的工藝參數(shù)為最佳混勻工藝參數(shù)。

表5 混合角度對制劑活菌數(shù)的影響結果（n=3，X±S）

3 討論

蒙古馬分娩后，子宮頸處于擴張狀態(tài)，環(huán)境、皮膚和糞便中的病原微生物從生殖道進入子宮，引發(fā)蒙古馬產(chǎn)后子宮內膜炎，從而導致繁殖率降低、產(chǎn)肉和產(chǎn)奶量下降，造成嚴重的經(jīng)濟損失，影響蒙古馬養(yǎng)殖業(yè)的高質量發(fā)展［6］。目前，傳統(tǒng)治療母馬生殖道疾病的方法是抗生素療法，但抗生素在殺死病原菌的同時，抑制了正常菌群的增殖，為致病性耐藥菌株提供了生長環(huán)境，因此，生產(chǎn)中急需新型藥物的開發(fā)。

乳酸菌是陰道中重要的優(yōu)勢菌群，在保障生殖健康方面發(fā)揮著重要作用［7］。陰道乳酸菌在奶牛、豬、犬、大鼠、小鼠、兔、倉鼠、綠長尾猴等動物中均有研究。乳酸菌在母馬陰道中同樣分布廣泛，對生殖道炎癥有明顯的緩解作用［8］。微生態(tài)制劑因無殘留、無耐藥性、無毒副作用、效果顯著、不污染環(huán)境等優(yōu)點成為抗生素的理想替代品，可減少畜禽產(chǎn)品中的藥物殘留和耐藥性有害菌的污染。微生態(tài)制劑類產(chǎn)品用于動物疾病，重在預防，可以最大限度地發(fā)揮動物的生產(chǎn)潛能［9］。

該研究針對前期從健康母馬陰道內分離篩選的優(yōu)勢乳酸菌菌株，利用發(fā)酵學方法及藥物制備學技術，將菌株的菌粉及制劑配方和工藝參數(shù)優(yōu)化出來，并根據(jù)優(yōu)化的配方及工藝參數(shù)制備預防和治療馬體陰道炎癥的微生態(tài)制劑，為馬體陰道炎癥微生態(tài)制劑的制備提供理論基礎。