綿羊肺炎支原體內(nèi)蒙古分離株DnaJ基因克隆表達及其免疫原性研究

戴伶俐，王 娜，劉 威，白 帆，張 帆，張月梅，宋 越，楊 斌，陳 偉，趙世華，達來寶力格

（內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）能夠引起綿羊和山羊非典型肺炎。該病臨床上表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕、漸進性消瘦、腹瀉和滲出性間質(zhì)性肺炎［1］，給養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。在我國甘肅、遼寧、四川、新疆、內(nèi)蒙古等地從患有肺炎的綿羊體內(nèi)分離到該病原體［2］。近年來，研究人員對內(nèi)蒙古自治區(qū)羊呼吸道疫病進行了流行病學(xué)調(diào)查研究及病原分離鑒定工作［3-5］，發(fā)現(xiàn)綿羊肺炎支原體是引起綿羊、山羊呼吸道疾病的主要病原體，是嚴(yán)重威脅綿羊、山羊健康的重要病原之一。

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是細菌在應(yīng)激條件下產(chǎn)生的一組對細菌自身具有保護作用的蛋白，有助于細菌快速適應(yīng)環(huán)境，其誘導(dǎo)合成對于病原菌在宿主體內(nèi)存活至關(guān)重要［1，6］。對多種病原菌的研究發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白能夠有效刺激宿主體液免疫和細胞免疫，對病原菌有顯著的免疫保護效應(yīng)，是較好的疫苗候選蛋白［7-10］。由DnaJ基因編碼的DnaJ蛋白是保守的HSP40家族成員，是熱休克蛋白HSP70分子伴侶蛋白，在多種生理活動和應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。近年來，越來越多的研究表明，DnaJ蛋白是細菌的毒力蛋白，具有良好的免疫原性［10-13］。DnaJ蛋白具有黏附—侵襲作用，在病原菌與宿主相互作用過程中發(fā)揮重要作用［12］。

綿羊肺炎支原體熱休克蛋白HSP70被證明是具有免疫活性的蛋白［9，14-15］，但對其伴侶蛋白DnaJ的研究尚屬空白。該研究對綿羊肺炎支原體內(nèi)蒙古分離株NM03-MO的DnaJ基因進行克隆表達，并對其序列進行分析與預(yù)測，初步驗證其表達產(chǎn)物的免疫原性，為綿羊肺炎支原體感染機制研究以及新型疫苗研制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株與表達載體

綿羊肺炎支原體內(nèi)蒙古分離株NM03-MO，于2017年由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所分離鑒定并保存。pColdⅠ載體由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。

1.1.2 主要試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA marker、質(zhì)粒小量提取試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞、大腸桿菌BL21（DE3），購自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeSTARHSDNA Polymerase熱啟動高保真聚合酶、pMD19-Tsimple克隆載體、IPTG、氨芐青霉素、瓊脂糖、PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Eco RⅠ、Bam HⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自NEB（北京）公司；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購自碧云天生物科技有限公司；驢抗綿羊IgG（H+L）-HRP抗體購自艾美捷生物科技有限公司。

1.1.3 試驗動物

血清制備用綿羊為斷奶小尾寒羊。

1.2 試驗方法

1.2.1 DnaJ基因克隆與測序

按照細菌基因組提取試劑盒提取支原體NM03-MO株基因組DNA。根據(jù)GenBank支原體參考基因組序列，設(shè)計DnaJ基因CDS區(qū)PCR擴增引物MO-DNAJ-F（5′-CGCGGATCCGCGGCAAAACAAGATTACTAT-3′）和MO-DNAJ-R（5′-CCGGAATTCCGGTTATTCAAACTCTTTTAG-3′）。以NM03-MO基因組DNA為模板，采用PCR方法擴增DnaJ基因CDS區(qū)。PCR反應(yīng)體系為50 μL：5×PrimeSTARBuffer 10μL，dNTPMixture（2.5 mmol/L each）4μL，MO-DNAJ-F（10μmol/L）1 μL，MO-DNAJ-R（10μmol/L）1μL，NM03-MO基因 組DNA 1μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/μL）0.5μL，無菌去離子水32.5μL。擴增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，設(shè)置52、55、58、60℃4個不同退火溫度，優(yōu)化試驗條件，退火時間為30 s，72℃延伸60 s，30個循環(huán)；72℃終延伸10 min；4℃保溫。理論PCR擴增片段長度為1 128 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，切下目的片段凝膠塊，用PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒回收目的片段，按照說明書連接pMD19-Tsimple載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆菌于氨芐青霉素抗性液體培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)，按照試劑盒說明書操作提取質(zhì)粒，經(jīng)過PCR鑒定，將含有目的片段的陽性克隆質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.2 DnaJ蛋白序列分析

目的片段序列用NCBI在線BLSAT軟件進行初步序列比對。采用DNAstar 7.1.0和Mega7.0軟件將DnaJ基因序列翻譯為氨基酸序列并分析其進化關(guān)系。利用生物信息搜索引擎ExPASy中的在線分析軟件ComputepI/Mw（https：//web.expasy.org/compute_pi/）和Protparam（https：//web.expasy.org/protparam/）分析和預(yù)測蛋白質(zhì)理論等電點。利用DNAstar 7.1.0中的Protean軟件和Phyre在線分析軟件（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）分析和預(yù)測蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)。從Uniprot網(wǎng)站（https：//www.uniprot.org/）分別下載MO 14811株、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pneumoniae）ATCCBAA-334株、大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）K12株DnaJ氨 基 酸 序列， 序 列 號 分 別 為A0A014NQY5、P95830、P08622，利用Phyre在線分析軟件預(yù)測其三級結(jié)構(gòu)，與分離株NM03-MO對比蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)差異。

1.2.3 pColdⅠ-DnaJ重組表達載體構(gòu)建

選擇經(jīng)過測序鑒定序列正確的帶有目的片段的克隆載體，使用Eco RⅠ和Bam HⅠ對其進行雙酶切，切膠回收DnaJ基因目的片段，用T4 DNA連接酶將其與經(jīng)Eco RⅠ和Bam HⅠ雙酶切的pColdⅠ線性化載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆菌，提取質(zhì)粒，進行雙酶切鑒定，完成pColdⅠ-DnaJ重組表達載體構(gòu)建。

1.2.4 DnaJ重組蛋白表達與純化

將pColdⅠ-DnaJ表達載體轉(zhuǎn)化BL21（DE3）表達感受態(tài)細胞中，經(jīng)過PCR擴增和酶切鑒定，篩選陽性表達菌株。表達菌經(jīng)16℃0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后收集菌體，加入蛋白純化試劑盒裂解液裂解菌體后，超聲產(chǎn)物4℃12 000 r/min離心10 min，上清液和沉淀分別進行SDS-PAGE電泳。按照His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說明書操作，從上清液中提取重組DnaJ蛋白。

1.2.5 DnaJ重組蛋白免疫原性研究

利用綿羊肺炎支原體NM03-MO株制備滅活疫苗免疫斷奶綿羊，免疫5周后，ELISA檢測其抗體效價達到1∶3 200以上，頸靜脈采血分離血清，該血清作為Western blot檢測用一抗。重組DnaJ蛋白純化產(chǎn)物和表達菌裂解產(chǎn)物進行Western blot檢測，一抗1∶1 000室溫孵育2 h，用HRP標(biāo)記的驢抗綿羊IgG抗體作為二抗，1∶5 000稀釋后室溫孵育40 min，ECL顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 NM03-MO株DnaJ基因克隆測序結(jié)果

以NM03-MO株基因組DNA為模板擴增DnaJ基因片段，PCR退火溫度從52℃到60℃均能夠擴增大小約1 100 bp的特異性目的片段（見圖1），由于退火溫度為60℃條件下擴增目的片段產(chǎn)量低于其他3個溫度條件，擴增效率有所降低，從退火溫度52、55、58℃條件下選擇較高退火溫度以保證PCR擴增特異性，因而選擇58℃為最終PCR退火溫度進行目的片段擴增，切膠回收純化目的片段連接克隆載體pMD19-T載體，構(gòu)建克隆載體pMD19-DnaJ，并將陽性克隆質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，對插入目的片段測序，結(jié)果顯示DnaJ編碼基因全長1 128 bp。

圖1 綿羊肺炎支原體NM03-MO株DnaJ基因PCR擴增結(jié)果

2.2 NM03-MO株DnaJ氨基酸序列分析結(jié)果

NM03-MO株DnaJ基因編碼376個氨基酸（見圖2），其中包含53個強堿性氨基酸（K、R），42個強酸性氨基酸（D、E），101個親水性氨基酸，116個極性氨基酸。預(yù)測分子量為41.65 kDa，等電點9.09。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果表明DnaJ蛋白具有較強的親水性及抗原性（見圖3）。

圖2 綿羊肺炎支原體NM03-MO株DnaJ氨基酸序列

圖3 綿羊肺炎支原體NM03-MO株DnaJ蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果

對下載的支原體和大腸桿菌DnaJ蛋白序列繪制遺傳進化樹，整體支原體DnaJ共處一個大分支，與大腸桿菌分屬不同進化分支。綿羊肺炎支原體DnaJ與豬支原體親緣關(guān)系較近，同屬一個分支（見圖4）。分離株NM03-MO與綿羊肺炎支原體貴州分離株14811株遺傳進化距離最近。

圖4 DnaJ蛋白序列遺傳進化樹

分別對綿羊肺炎支原體內(nèi)蒙古分離株NM03-MO、MO 14811株、S.pneumoniae ATCC BAA-334株和E.coli K12株DnaJ蛋白質(zhì)序列在線預(yù)測其三維結(jié)構(gòu)（見圖5），四者整體結(jié)構(gòu)相似，但在與HSP70相互作用的區(qū)域，如圖5黃色標(biāo)記區(qū)域所示，綿羊肺炎支原體與大腸桿菌和肺炎鏈球菌的DnaJ結(jié)構(gòu)有一定差異。

圖5 DnaJ蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

2.3 DnaJ重組表達載體構(gòu)建

pMD19-DnaJ經(jīng)過Eco RⅠ和Bam HⅠ雙酶切，純化DnaJ基因片段并連接同樣經(jīng)過Eco RⅠ和Bam HⅠ雙酶切線性化的表達載體pColdⅠ，連接轉(zhuǎn)化并挑取陽性克隆菌擴培后，提取質(zhì)粒，進行酶切鑒定（見圖6）。質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物為2條條帶，大片段條帶為載體條帶，約為4 400 bp，小片段條帶為DnaJ目的片段，大小約為1 100 bp；質(zhì)粒單酶切產(chǎn)物約為5 500 bp，與理論大小相符，成功構(gòu)建pColdⅠ-DnaJ重組表達載體。

2.4 DnaJ重組蛋白表達純化

大腸桿菌BL21（DE3）表達重組DnaJ蛋白，經(jīng)過條件優(yōu)化，目的蛋白條帶大小約為42 kDa，如圖6箭頭所示，與蛋白質(zhì)理論大小一致。目的蛋白為上清表達，可直接用鎳柱純化His標(biāo)簽蛋白（見圖7），由于用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒粗提靶蛋白，能夠去除大部分非特異性蛋白，但仍存在一定量的非靶蛋白，需要后續(xù)優(yōu)化純化條件，進一步提純靶蛋白用于后續(xù)實驗。

圖6 p ColdⅠ-DnaJ重組表達載體酶切鑒定結(jié)果

圖7 DnaJ重組蛋白表達純化結(jié)果

2.5 DnaJ重組蛋白免疫原性研究

為驗證NM03-MO分離株DnaJ重組蛋白是否具有免疫原性，用分離株制備滅活疫苗免疫斷奶綿羊5周后，分離血清，經(jīng)過Western blot檢測，證明重組DnaJ蛋白能夠與血清抗體結(jié)合（見圖8），從而證明了綿羊肺炎支原體DnaJ蛋白能夠在體內(nèi)刺激機體產(chǎn)生抗體，具有一定的免疫原性。

圖8 DnaJ重組蛋白Western blot結(jié)果

3 討論

綿羊肺炎支原體分子致病機制目前已有研究報道［9，16-18］，但對其結(jié)構(gòu)蛋白功能研究仍屬于空白，嚴(yán)重影響對該疫病的分子致病機制的深入研究及解析，限制了高效特異的診斷方法和疫苗研制。

對于動物呼吸道疫病病原菌的DnaJ蛋白研究主要集中在對肺炎鏈球菌致病性及抗原保護性等方面。DnaJ缺陷型肺炎鏈球菌感染小鼠，能夠降低小鼠對其天然免疫應(yīng)答反應(yīng)強度［19］。豬鏈球菌2型DnaJ蛋白功能與病原菌對溫度敏感性有關(guān)，同時與病原菌對宿主細胞的黏附有關(guān)，因此，動物或人在感染后體溫持續(xù)升高時，該菌可能通過上調(diào)DnaJ蛋白表達，從而提高對宿主細胞的黏附力［20］，增強致病性。此外，DnaJ是一類J結(jié)構(gòu)域蛋白，在肺炎支原體末端細胞器也存在J結(jié)構(gòu)域蛋白，該蛋白能夠與HSP70相互作用，影響末端細胞器的形成、支原體滑行運動以及細胞黏附作用［21］，存在于肺炎支原體末端細胞器的J結(jié)構(gòu)域蛋白是否就是綿羊肺炎支原體DnaJ蛋白，需要對DnaJ蛋白在MO中的定位深入探討。

通過黏膜免疫途徑免疫DnaJ抗原可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生DnaJ抗體，同時刺激宿主提高IL-10、IFN-γ和IL-17A表達水平，可降低肺炎球菌在鼻內(nèi)或肺臟的定殖。小鼠腹腔或黏膜免疫DnaJ蛋白可激發(fā)小鼠體液免疫和細胞免疫反應(yīng)，可抵御多種血清型的肺炎鏈球菌感染［22-23］，DnaJ蛋白能夠誘導(dǎo)保護性的免疫應(yīng)答反應(yīng)，具有作為保守的肺炎鏈球菌蛋白疫苗研制潛力［24］。

雖然熱休克蛋白和伴侶蛋白在真核和原核生物中的序列較為保守［10］，但在不同種屬之間仍然存在一定差異，這種差異也是生物進化形成的一種自保護方式。該研究通過對內(nèi)蒙古分離株NM03-MO株DnaJ序列克隆測序及其表達蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)與綿羊肺炎支原體貴州分離株14811株均存在一定差異，結(jié)構(gòu)差異可能會引起功能性差異，這種結(jié)構(gòu)差異是否與支原體的致病性差異存在一定關(guān)系還有待驗證。

該研究制備的綿羊肺炎支原體DnaJ重組蛋白與綿羊肺炎支原體陽性的綿羊血清有較好的結(jié)合活性，也證明該蛋白在宿主體內(nèi)能激活宿主體液免疫，有較好的免疫原性，但是否能夠刺激機體產(chǎn)生較好的黏膜免疫反應(yīng)，仍有待研究。

4 結(jié)論

成功克隆表達綿羊肺炎支原體內(nèi)蒙古分離株NM03-MO株DnaJ蛋白。重組DnaJ蛋白能夠與血清抗體結(jié)合，具有較好的免疫原性，填補了國內(nèi)外對綿羊肺炎支原體DnaJ蛋白研究的空白，為后續(xù)綿羊肺炎支原體致病機制研究，以及診斷試劑研發(fā)和新型疫苗研制提供試驗支持。