HPLC法測定冠心寧注射液中依地酸二鈉的含量

宋娜娜，李響明*，周永妍，張睿智，丁艷譜，楊 琴，孫勝斌，3，姜國志，3

(1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430；2.河北省中藥注射液工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 051430；3.中藥注射劑新藥技術(shù)開發(fā)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 051430)

冠心寧注射液為黃棕色至棕紅色的澄明液體，為供臨床靜脈滴注的濃溶液，由丹參、川芎水提精制而成的滅菌水溶液[1]。具有活血化瘀、通脈養(yǎng)心的功效，用于冠心病心絞痛的治療。現(xiàn)代藥理研究表明，冠心寧注射液具有擴(kuò)張冠狀動脈，促進(jìn)冠脈側(cè)支循環(huán)，增加冠脈血流量，降低心肌耗氧量，耐缺氧，增加心肌收縮力，減慢心率，改善心臟功能，改善心肌缺血，改善微循環(huán)、抑制血液凝固、促進(jìn)纖溶、改善血流變的作用[2-3]，臨床應(yīng)用越來越廣泛。

中藥制劑化學(xué)成分復(fù)雜，含有一定量的金屬離子，在金屬離子的催化作用下可發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)，從而影響制劑的穩(wěn)定性。因此，在冠心寧注射液生產(chǎn)中常添加金屬絡(luò)合劑依地酸二鈉，以減緩金屬離子的影響，維持制劑的穩(wěn)定。冠心寧注射液的使用方式為靜脈滴注，臨床風(fēng)險相對較大，因此對添加的輔料要求較高。目前未見針對冠心寧注射液中依地酸二鈉含量的檢測項(xiàng)目及檢測方法的文獻(xiàn)報道。為全面真實(shí)地反映生產(chǎn)企業(yè)輔料的用量，探索貯存期內(nèi)輔料的變化規(guī)律，切實(shí)保障廣大患者的用藥安全，有必要研究開發(fā)一種適用于冠心寧注射液中依地酸二鈉含量的測定方法。

中國藥典測定硫代硫酸鈉含量的方法有碘量法[4]、滴定法[5]，滴定液的配制和標(biāo)定要求嚴(yán)格，且耗時較長。而中藥注射液自身顏色較重，對以顏色變化判斷滴定終點(diǎn)的方法有干擾；再者中藥注射劑中除已知成分和輔料外，還有很多未知成分，增加了準(zhǔn)確測定的難度。因此，本研究建立了測定冠心寧注射液中依地酸二鈉含量的高效液相色譜法，該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于冠心寧注射液中輔料的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，QuatPump泵，DAD檢測器，全自動進(jìn)樣器，Agilent OpenLAB 2.3色譜工作站。

1.2 試劑及試藥

二水合乙二胺四乙酸二鈉(分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司生產(chǎn))；40%四丁基氫氧化銨溶液(薩恩化學(xué)試劑股份有公司)；三氯化鐵(分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司生產(chǎn))；甲酸(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；水為純化水。冠心寧注射液由神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

XB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，Serial No.6042312(Shimadzu，Inc.)；C18保護(hù)柱(5 μm，10 mm×4.6 mm，Alltech)。流動相含3.0%甲醇和0.1%甲酸的水溶液(用40%四丁基氫氧化銨溶液調(diào)pH=3.5)；檢測波長：258 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：40 ℃。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取二水合乙二胺四乙酸二鈉對照品27.54 mg置25 mL棕色容量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液5 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加入10 mg/mL三氯化鐵溶液0.3 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min，備用。

2.3 供試品溶液的制備

精密吸取冠心寧注射液4 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，精密加入10 mg/mL三氯化鐵溶液0.3 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備

按處方制備缺依地酸二鈉陰性制劑，按“2.3”項(xiàng)下的方法制備，即得。

2.5 專屬性

分別精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下方法測定，結(jié)果顯示陰性對照無干擾，說明該方法專屬性較強(qiáng)。見圖1。

圖1 陰性樣品溶液與供試品溶液色譜

2.6 線性

分別精密吸取對照品溶液0.4、0.6、1.0、1.6、1.8、2.0 mL置2 mL棕色量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻，制成20.00、30.00、50.00、80.00、90.00、100.00 μg/mL的對照品溶液，以各對照品濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=24.405x-71.264，r=0.999 9。表明依地酸二鈉在20.00～100.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 依地酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.7 穩(wěn)定性考察

分別取對照品溶液和冠心寧注射液(180715A2)按“2.3”項(xiàng)下方法處理，分別于0、2、4、8、12、24 h時連續(xù)測定，結(jié)果表明對照品溶液與供試品溶液各峰峰面積的RSD分別為0.53%、1.05%，均<2%，說明對照品與供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 精密度試驗(yàn)

2.8.1 進(jìn)樣精密度 取對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，依法測定，計(jì)算對照品峰面積的RSD為0.54%，<2.0%。

2.8.2 重復(fù)性試驗(yàn) 平行取批號為180715A2的冠心寧注射劑6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制成6份供試品溶液，每份進(jìn)樣1次，連續(xù)測定，根據(jù)外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算得依地酸二鈉平均含量為0.129 1 mg/mL，RSD為2.57%，說明該方法重復(fù)性良好。見表1。

表1 依地酸二鈉含量測定重復(fù)性試驗(yàn)

2.8.3 中間精密度 由另一名分析人員在不同日期按重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下方法重新配制6份供試品溶液，進(jìn)樣測定，將測定結(jié)果與重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，共12份樣品的測定結(jié)果表明，兩組12次測定結(jié)果RSD均<5.0%，說明該方法精密度良好。見表2。

表2 依地酸二鈉含量測定中間精密度試驗(yàn)

2.9 加樣回收試驗(yàn)

精密量取冠心寧注射液2.0 mL，置于10 mL棕色量瓶中，加入0.099 5 mg/mL的乙二胺四乙酸二鈉對照品溶液2.6 mL，再加入10 mg/mL的三氯化鐵溶液0.3 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min濾過，共平行操作6份。根據(jù)外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算總含量，再減去注射液樣品中依地酸二鈉含量，其差值除以加入的相應(yīng)對照品含量，得回收率。計(jì)算所得的平均回收率(%)及RSD(%)見表3。

表3 依地酸二鈉含量測定加樣回收試驗(yàn)

2.10 檢測限與定量限

選擇適宜濃度的對照品溶液進(jìn)樣，使得信噪比為3∶1，計(jì)算對照品的進(jìn)樣量，即得檢測限；信噪比為10∶1時，計(jì)算對照品的進(jìn)樣量，即得定量限。依地酸二鈉的檢測限為0.54 ng，定量限為1.6 ng。

2.11 耐用性

分別考察不同色譜柱(XB-C18、Kromasil C18、Phenomenex Gemini-C18)、不同柱溫(20、25、30 ℃)、不同流速(0.8、0.9、1.0 mL·min-1)、不同pH值(3.0、3.5、4.0)以及不同濃度甲酸溶液(0.1%、0.13%、0.15%)的流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨上述色譜條件的改變，各色譜峰的分離度變化不大，說明該方法的耐用性較好。

2.12 注射液中依地酸二鈉的含量測定

精密量取每批冠心寧注射液4.0 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，平行2次，根據(jù)外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算依地酸二鈉含量。見表4。

表4 10批注射液中依地酸二鈉的含量測定

3 討論

目前測定依地酸二鈉含量的研究或質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中多采用滴定法和比色法。但這兩種方法很難分辨依地酸二鈉螯合物和其他物質(zhì)形成的螯合物，專屬性相對較差，對測定結(jié)果有干擾，故本研究考慮采用專屬性較高的HPLC法[6-8]。HPLC法測定含量是通過檢測依地酸二鈉的金屬螯合物來實(shí)現(xiàn)定量的。

依地酸二鈉可與色譜柱的不銹鋼表面發(fā)生作用，致使依地酸二鈉的響應(yīng)值低，且峰形嚴(yán)重拖尾，依地酸二鈉易與金屬離子螯合形成穩(wěn)定的水溶性螯合物。綜上，本研究首選使其與金屬離子形成螯合物再測定含量，不僅成功避免了依地酸二鈉對色譜柱的損害，還提高了檢測靈敏度，改善了峰形。有研究指出依地酸二鈉與三價鐵離子形成的螯合物穩(wěn)定系數(shù)較高[7]，故本研究采用硫酸鐵溶液、三氯化鐵溶液與依地酸二鈉和鐵離子形成穩(wěn)定的螯合物，且該螯合物具有穩(wěn)定的紫外吸收，在258 nm處有最大吸收。目前采用高效液相色譜法測定注射劑中依地酸二鈉含量的研究，多為化藥制劑[9-11]，關(guān)于中藥注射液產(chǎn)品中該輔料的報道不多。本研究所用方法可以準(zhǔn)確測定冠心寧注射液中依地酸二鈉的含量，可作為評價該輔料投料準(zhǔn)確性的一種技術(shù)手段，也為進(jìn)一步探索該輔料在有效期內(nèi)的變化規(guī)律提供了參考依據(jù)，為該產(chǎn)品的輔料控制研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究通過全面的方法學(xué)驗(yàn)證，建立了可靠、高效、專屬性強(qiáng)的測定冠心寧注射液中輔料依地酸二鈉含量的高效液相色譜法，為冠心寧注射液的全面質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)，同時也為其他含依地酸二鈉制劑的質(zhì)量控制研究提供了思路。