不同濃度氯化鈣浸種處理對(duì)水稻防御酶活性和抗褐飛虱的影響

吳小保, 鄧倩倩, 宋 佳, 王 駿, 葉 茂,*

(1.貴州大學(xué)昆蟲研究所, 貴陽 550025; 2.貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽 550025;3.農(nóng)業(yè)部貴陽作物有害生物科學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)站, 貴陽 550025)

褐飛虱Nilaparvatalugens屬半翅目(Hemiptera)飛虱科(Delphacidae)，是我國及東南亞稻區(qū)的主要害蟲，以成、若蟲群集于稻株基部，用口針刺吸莖葉組織汁液，損耗稻株養(yǎng)分，使谷粒不飽滿，千粒重減輕，為害嚴(yán)重時(shí)引起稻株基部變黑、導(dǎo)致稻株癱瘓倒伏(李春鳳等, 2019)。目前施用化學(xué)農(nóng)藥仍是防治褐飛虱的主要手段，長(zhǎng)期連續(xù)或不合理施用已導(dǎo)致褐飛虱對(duì)很多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性(王彥華和王鳴華, 2006)。

植物對(duì)昆蟲的防御有“組成型”和“誘導(dǎo)型”之分，其中組成型防御反應(yīng)是指植物在受害蟲攻擊前就存在的物理和化學(xué)的防御特征，誘導(dǎo)型抗性則是指植物在遭受植食性昆蟲為害或病原微生物侵染后，會(huì)迅速啟動(dòng)其防御信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活植物體內(nèi)各種誘導(dǎo)防御反應(yīng)，然后通過生理、生化及形態(tài)特征等多方面的變化對(duì)蟲害或者病害產(chǎn)生抗性(Katarina and Aleksa, 2012)。然而，植物在遇到昆蟲襲擊后要產(chǎn)生有效的誘導(dǎo)防御需要一段時(shí)間，這種誘導(dǎo)的滯后性使得植物可能在這段時(shí)間受到嚴(yán)重為害(Frostetal., 2008)，為了彌補(bǔ)誘導(dǎo)型抗性的這個(gè)弱點(diǎn)，植物逐漸進(jìn)化形成了誘發(fā)抗性機(jī)制(defence priming)，即當(dāng)受到某些生物或者非生物環(huán)境因子刺激后，植物會(huì)進(jìn)入防御警備狀態(tài)，提前做好抗蟲防御準(zhǔn)備(Conrathetal., 2006; 王杰等, 2018)，這就好比給植物打了“預(yù)防針”，一旦受到害蟲襲擊時(shí)，植物會(huì)產(chǎn)生更加快速和強(qiáng)烈的抗蟲防御反應(yīng)(Mauchetal., 2017)。目前已有大量研究發(fā)現(xiàn)植食性昆蟲的口腔分泌物(Albornetal., 2007; Schmelzetal., 2007)、昆蟲產(chǎn)卵(Bandolyetal., 2015)、昆蟲自身的氣體揮發(fā)物(Helmsetal., 2013)、蟲害誘導(dǎo)植物揮發(fā)物(Erbetal., 2015)、有益微生物如植物促生根際細(xì)菌和叢枝菌根真菌(Vanetal., 2008; Songetal., 2013)可以誘發(fā)植物抗蟲性。此外，一些非金屬元素如硅、氮和硒等也能誘發(fā)植物對(duì)病蟲害產(chǎn)生防御，例如，Ye等(2013)發(fā)現(xiàn)預(yù)先施硅處理的水稻植株，當(dāng)其遭受稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis為害時(shí)，葉片茉莉酸(jasmonic acid, JA)迅速合成，多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)、過氧化物酶(peroxidase, POD)等防御酶活性顯著高于未施硅處理的水稻植株，水稻對(duì)稻縱卷葉螟的抗性明顯增強(qiáng)；楊浪(2017)發(fā)現(xiàn)施硅處理的水稻植株被褐飛虱取食后，葉鞘苯丙氨酸解氨酶(phenylalanline ammonia lyase, PAL)、多酚氧化酶、過氧化物酶和β-1,3-葡聚糖酶(β-1, 3 glucanase,β-1, 3-GA)等防御酶活性顯著高于未施硅處理的對(duì)照，水稻對(duì)褐飛虱的抗性明顯增強(qiáng)。一定濃度的重金屬元素如鎘、銅、鋅和鎳也可以誘發(fā)植物的抗性，如Winter等(2012)發(fā)現(xiàn)用含有80 μmol/L銅的營養(yǎng)液培養(yǎng)的玉米植株，當(dāng)植株遭受草地貪夜蛾Spdopterafrugiperda幼蟲取食為害時(shí)，根系會(huì)快速產(chǎn)生并積累活性氧，葉片JA含量明顯增加，誘導(dǎo)植株釋放更多的揮發(fā)物吸引天敵。有趣的是，Worrall等(2012)發(fā)現(xiàn)利用JA浸泡番茄種子，可以誘發(fā)增強(qiáng)番茄植株對(duì)朱砂葉螨Tetranychuscinnabarinus、煙草天蛾Manducasexta幼蟲、桃蚜Myzuspersicae以及灰霉病Botrytiscinerea的抗性，用氨基丁酸(β-amino butryric acid, BABA)浸種處理可以明顯增強(qiáng)番茄植株對(duì)灰霉病的抗性，并且兩種物質(zhì)浸種處理都不影響番茄植株的生長(zhǎng)和發(fā)育。

鈣是植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的重要營養(yǎng)元素，已有大量研究發(fā)現(xiàn)采用葉面噴施和根灌等方法對(duì)小麥、水稻等作物外施適宜濃度的鈣可以顯著提高它們對(duì)干旱、高溫、低溫、鹽害以及重金屬等不良非生物逆境的抗性(徐芬芬等, 2009; 王鵬等, 2017; Yangetal., 2018; Silveiraetal., 2020)。然而，目前外源鈣在調(diào)控植物響應(yīng)生物逆境脅迫方面的研究相對(duì)較少，并且主要集中于對(duì)植物抗病性方面的研究，例如Debona等(2017)用水培的方法，分別以含有0.26, 2.6和5 mmol/L Ca(NO3)2·4H2O的溶液培養(yǎng)小麥植株，研究結(jié)果表明外源鈣可以增強(qiáng)細(xì)胞壁以抑制稻瘟病侵染和病斑的擴(kuò)展，更有趣的是外源鈣還可以誘導(dǎo)小麥JA, SA和H2O2防御信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵基因的表達(dá)以及幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶和多酚氧化酶等酶的活性的升高，說明SA和 JA防御信號(hào)通路在鈣誘導(dǎo)的抗病過程中發(fā)揮著重要的作用。在植物抗蟲性方面，Zeng等(2020)采用噴施、根灌和浸種方式對(duì)菜豆進(jìn)行外源CaCl2處理均可誘導(dǎo)提高菜豆PAL, 脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)和POD等防御酶活性，增強(qiáng)菜豆植株對(duì)西花薊馬Frankliniellaoccidentalis的抗性。

利用外源物質(zhì)誘導(dǎo)提高植物抗逆性，具有抗逆性廣、用量小、見效快和效益高等特點(diǎn)，同時(shí)又能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，是發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)的一項(xiàng)重要技術(shù)。本研究分別用10, 20, 30, 40和50 mmol/L CaCl2溶液浸泡水稻種子，待水稻長(zhǎng)至分蘗期時(shí)，檢測(cè)分析不同濃度CaCl2浸種處理對(duì)水稻防御酶PAL, POD, PPO和β-1,3-GA活性的誘導(dǎo)以及對(duì)褐飛虱存活率的影響，為合理利用外源鈣誘導(dǎo)提高田間水稻抗蟲性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1植物和昆蟲：供試水稻品種為中花11。褐飛虱采自貴州黃平田間種群，實(shí)驗(yàn)室人工氣候室(溫度28±2℃, RH 80%, 光周期14L∶10D)內(nèi)用感蟲水稻品種TN1飼養(yǎng)、繁殖10代以上供實(shí)驗(yàn)用。

1.1.2試劑：CaCl2購買于成都金山化學(xué)試劑有限公司(www.cdjinshan.com)，純度>96%;鈣離子螯合劑乙二醇四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid, EGTA)和離子通道抑制劑氯化鑭(lanthanum chloride, LaCl3)夠買于北京百奧萊博科技有限公司，純度>99%; L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)、愈創(chuàng)木酚(2-methoxyphenol)購買于索萊寶生物公司(www.solanbio.com)，純度>99%;昆布多糖(laminarin)購買于索萊寶生物公司(www.solanbio.com)，純度>98%;鄰苯二酚(catechol)購買于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，純度>99%。

1.2 水稻浸種處理和褐飛虱取食

1.2.1CaCl2浸種處理：挑選飽滿、健康的種子，經(jīng)10% H2O2消毒10 min后用蒸餾水沖洗3～5次。分別用10, 20, 30, 40和50 mmol/L CaCl2溶液浸種，以不含CaCl2的無菌蒸餾水浸種為對(duì)照(CK)，48 h后倒掉溶液，將種子放置到培養(yǎng)箱催芽，待水稻種子露白后播種于方形瓷盤中，一周后挑選健康且生長(zhǎng)一致的水稻幼苗移栽到塑料杯中，所有水稻幼苗放置于無蟲網(wǎng)罩中培養(yǎng)，待水稻長(zhǎng)至分蘗期時(shí)供實(shí)驗(yàn)用。

1.2.2EGTA和LaCl3浸種處理：種子挑選和滅菌方法同1.2.1節(jié)。分別用含有1 mmol/L EGTA的CaCl2(20 mmol/L)溶液和含有1 mmol/L LaCl3的CaCl2(20 mmol/L)溶液浸種，對(duì)照水稻分別用含有1 mmol/L EGTA和1 mmol/L LaCl3的無菌蒸餾水浸種，浸種方法和水稻植株培養(yǎng)方法同1.2.1節(jié)。

1.2.3褐飛虱取食處理：上述各處理水稻植株，待水稻長(zhǎng)至分蘗期后，在每株水稻主莖上用parafilm膜制作一個(gè)取食袋，再將20頭3齡褐飛虱若蟲接入取食袋取食24 h。

1.3 褐飛虱存活率的測(cè)定

1.2.1和1.2.2節(jié)各處理水稻植株主莖接15頭2齡褐飛虱若蟲，用透明玻璃管(直徑30 mm，高300 mm)罩住植株，底部用棉花包住根部固定(保持濕潤(rùn))，頂部用尼龍網(wǎng)封口，每天觀察和記錄各水稻植株上褐飛虱存活的數(shù)量，取食7 d后計(jì)算其存活率。各處理20次重復(fù)。

1.4 酶活性的測(cè)定

1.2.1節(jié)各處理水稻植株，每株水稻主莖接20頭褐飛虱3齡若蟲取食24 h，取被取食葉鞘檢測(cè)過氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶和β-1,3-葡聚糖酶活性。以未經(jīng)褐飛虱取食的植株為對(duì)照。稱取水稻葉鞘0.1 g，液氮研磨成粉末，在液氮未揮發(fā)前轉(zhuǎn)入離心管，加入相應(yīng)提取液研磨勻漿后轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，在渦旋振蕩儀上渦旋振蕩10 s，低溫冷凍離心機(jī)中12 000 r/min低溫(4℃)離心15 min，取上清液(酶液)檢測(cè)各防御酶活性。每個(gè)處理各設(shè)6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.4.1苯丙氨酸解氨酶(PAL): 參照Xu等(2021)方法進(jìn)行，稍加修改，在酶標(biāo)板中依次加入70 μL 0.02 mol/L L-苯丙氨酸，200 μL 0.05 mol/L Tris-HCl(pH 8.8)，20 μL酶液(對(duì)照加入15 μL PAL提取液)，在40℃水浴中30 min，加入250 μL 5 mol/L HCl終止反應(yīng)，然后在酶標(biāo)儀290 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，以O(shè)D值變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

1.4.2過氧化物酶(POD): 參照Xu等(2021)方法，稍加修改，在酶標(biāo)板中依次加入5 μL 0.1 mol/L pH 7.2的磷酸緩沖液，100 μL 0.1 mol/L愈創(chuàng)木酚，100 μL 0.8% H2O2，5 μL酶液后立即放入酶標(biāo)儀在470 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，以O(shè)D值變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

1.4.3多酚氧化酶(PPO): 參照Xu等(2021)方法，稍加修改，反應(yīng)混合液：120 μL 0.05 mol/L pH 5.5磷酸緩沖液，35 μL 0.05 mol/L兒茶酚(鄰苯二酚)，20 μL酶液；在37℃孵育15 min后，酶標(biāo)儀測(cè)525 nm處OD值。以O(shè)D值變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

1.4.4β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-GA): 0.1 mL粗提取液，0.4 mL 1 mL/mg昆布多糖40℃水浴30 min后，加1 mL DNS試劑，沸水浴10 min，冷卻后再加6 mL蒸餾水，在540 nm處測(cè)定吸光值，求吸光度差值(A樣品-A水)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求出產(chǎn)生葡萄糖量。一個(gè)酶活力單位(U)定義為每克鮮植物組織每秒產(chǎn)生1 μg葡萄糖的量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 22.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同處理間的差異顯著性用Duncan氏多重比較法分析(P<0.05)，用SigmaPlot 12.5軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 CaCl2浸種處理對(duì)水稻葉鞘苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影響

研究結(jié)果表明，未經(jīng)褐飛虱若蟲取食時(shí)，在種子階段經(jīng)過各濃度CaCl2浸種處理的水稻植株其葉鞘PAL酶活性之間沒有顯著差異(P>0.05)，而褐飛虱取食24 h后，各濃度CaCl2浸種處理水稻植株葉鞘PAL活性都顯著升高(P<0.05)，其中水浸種處理的水稻植株(CK)褐飛虱取食后葉鞘PAL活性顯著比未被取食的植株高59.27%，而10, 20, 30, 40和50 mmol/L CaCl2浸種處理的水稻植株中，褐飛虱取食后葉鞘PAL活性分別比未經(jīng)褐飛虱若蟲取食的植株高79.30%, 103.09%, 181.29%, 70.86%和109.42%。褐飛虱若蟲取食時(shí)，30 mmol/L CaCl2浸種處理的水稻植株其葉鞘PAL活性最高，分別比10, 20, 40和50 mmol/L CaCl2浸種處理的高80.08%, 38.44%, 50.90%和73.88%(圖1)。雙因素方差分析結(jié)果表明CaCl2浸種和褐飛虱若蟲取食的交互作用顯著(P=0.0008)，說明褐飛虱取食顯著誘導(dǎo)了水稻PAL活性，而CaCl2浸種處理顯著增強(qiáng)褐飛虱取食誘導(dǎo)的PAL酶活性。

圖1 褐飛虱若蟲取食脅迫時(shí)不同濃度CaCl2浸種處理對(duì)水稻葉鞘中苯丙氨酸解氨酶活性的影響

2.2 CaCl2浸種處理對(duì)水稻葉鞘過氧化物酶(POD)活性的影響

未經(jīng)褐飛虱若蟲取食時(shí)，各濃度CaCl2浸種處理的水稻植株葉鞘中POD活性之間沒有顯著差異(P>0.05)，而褐飛虱若蟲取食24 h后，經(jīng)過CaCl2和水浸種處理的水稻植株(CK)其葉鞘POD活性都顯著升高(P<0.05)，其中水浸種處理的水稻植株，褐飛虱取食后其葉鞘POD活性顯著比未被取食的植株中的高59.88%，而10, 20, 30, 40和50 mmol/L CaCl2浸種處理的水稻植株, 褐飛虱取食后其葉鞘POD活性顯著比未經(jīng)褐飛虱取食的植株中分別高58.00%, 109.16%, 257.86%, 77.82%和63.61%。褐飛虱若蟲取食時(shí)，以30 mmol/L CaCl2浸種處理的水稻植株其葉鞘POD活性最高，分別比10, 20, 40和50 mmol/L CaCl2浸種處理的植株中高116.41%, 55.67%, 58.80%和81.45%(圖2)。雙因素方差分析結(jié)果表明CaCl2浸種和褐飛虱取食的交互作用顯著(P=0.0000)，說明褐飛虱取食顯著誘導(dǎo)了水稻POD活性，而CaCl2浸種處理顯著增強(qiáng)了褐飛虱取食誘導(dǎo)的POD活性。

圖2 褐飛虱若蟲取食脅迫時(shí)不同濃度CaCl2浸種處理對(duì)水稻葉鞘中過氧化物酶活性的影響

2.3 CaCl2浸種對(duì)水稻葉鞘多酚氧化酶(PPO)活性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未經(jīng)褐飛虱取食時(shí)，各處理的水稻植株葉鞘PPO酶活性之間沒有顯著差異(P>0.05)，而接褐飛虱24 h后，經(jīng)過CaCl2和水浸種處理的水稻植株(CK)其葉鞘PPO活性都顯著升高(P<0.05)。水浸種處理的水稻植株中，褐飛虱取食后葉鞘PPO活性顯著比未被取食的植株中的高83.30%。10, 20, 30, 40和50 mmol/L CaCl2浸種處理的水稻植株中, 褐飛虱取食后葉鞘PPO活性顯著比未經(jīng)褐飛虱取食的植株中分別高273.00%, 166.12%, 366.30%, 219.07%和114.15%。褐飛虱若蟲取食時(shí)，10和30 mmol/L CaCl2浸種處理的水稻植株P(guān)PO活性最高，10 mmol/L CaCl2浸種處理的水稻植株，其葉鞘PPO活性分別比20, 40和50 mmol/L CaCl2浸種處理的高25.77%, 31.66%和82.53%, 30 mmol/L CaCl2浸種處理的水稻植株，其葉鞘PPO活性比20, 40和50 mmol/L CaCl2浸種處理的分別高30.25%,36.35%和89.03%(圖3)。雙因素方差分析結(jié)果表明CaCl2浸種和褐飛虱取食的交互作用顯著(P=0.0000)，說明褐飛虱取食顯著誘導(dǎo)了水稻PPO活性，而CaCl2浸種處理顯著增強(qiáng)了褐飛虱取食誘導(dǎo)的PPO活性。

圖3 褐飛虱若蟲取食脅迫時(shí)不同濃度CaCl2浸種處理對(duì)水稻葉鞘中多酚氧化酶活性的影響

2.4 CaCl2浸種對(duì)水稻葉鞘 β-1,3-GA酶活性的影響

研究結(jié)果表明，未經(jīng)褐飛虱若蟲取食時(shí)，各濃度CaCl2浸種處理的水稻植株葉鞘 β-1,3-GA酶活性沒有顯著差異(P>0.05)，而褐飛虱若蟲取食24 h后，經(jīng)過CaCl2和水浸種處理的水稻植株(CK)其葉鞘β-1,3-GA活性都顯著升高(P<0.05)。水浸種處理的水稻植株中，褐飛虱取食后葉鞘β-1,3-GA活性顯著比未經(jīng)褐飛虱取食的植株高26.13%，在10, 20, 30, 40和50 mmol/L CaCl2浸種處理的水稻植株中, 褐飛虱取食后葉鞘 β-1,3-GA活性顯著比未經(jīng)褐飛虱取食的植株分別高48.47%, 56.45%, 51.55%, 30.49%和40.90%。褐飛虱若蟲取食時(shí),10和20 mmol/L CaCl2浸種處理對(duì) β-1,3-GA 酶活性的誘導(dǎo)效果較好，其中10 mmol/L CaCl2浸種處理的水稻其葉鞘 β-1,3-GA活性分別比30, 40和50 mmol/L CaCl2浸種處理的高16.17%, 37.05%和33.36%，20 mmol/L CaCl2浸種處理的水稻其葉鞘 β-1,3-GA 活性分別比30, 40和50 mmol/L CaCl2浸種處理的高20.98%, 42.72%和38.88%(圖4)。雙因素方差分析結(jié)果顯示CaCl2浸種和褐飛虱取食的交互作用顯著(P=0.0150)，說明褐飛虱取食顯著誘導(dǎo)了水稻 β-1,3-GA活性，而CaCl2浸種處理顯著增強(qiáng)了褐飛虱取食誘導(dǎo)的β-1,3-GA活性。

圖4 褐飛虱若蟲取食脅迫時(shí)不同濃度CaCl2浸種處理對(duì)水稻葉鞘中β-1,3-葡聚糖酶活性的影響

2.5 不同濃度CaCl2浸種水稻對(duì)褐飛虱存活率的影響

褐飛虱2齡若蟲取食10, 20和30 mmol/L CaCl2溶液浸種處理的水稻植株7 d后，存活率分別比取食水浸種處理水稻(CK)的低32.68%, 22.54%和30.28%，但取食40和50 mmol/L CaCl2浸種處理的植株后，褐飛虱若蟲存活率與取食對(duì)照植株的相比無顯著差異(P>0.05)(圖5: A)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CaCl2浸種處理水稻對(duì)褐飛虱存活率的影響，在20 mmol/L CaCl2溶液浸種以及水浸種的同時(shí)分別加入1 mmol/L鈣離子螯合劑EGTA和鈣離子通道抑制劑LaCl3，待水稻植株長(zhǎng)至分蘗期時(shí)，檢測(cè)褐飛虱2齡若蟲取食各處理水稻植株后存活率的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，褐飛虱若蟲取食水、水+EGTA和水+LaCl3浸種處理過的水稻植株后，其存活率之間無顯著差異(P>0.05)(圖5: B)。然而，褐飛虱若蟲取食20 mmol/L CaCl2浸種處理過的水稻植株7 d后，其存活率顯著比取食水浸種處理植株的若蟲低32.18%，取食CaCl2+EGTA和CaCl2+LaCl3處理水稻的褐飛虱其存活率分別比取食CaCl2浸種處理水稻植株的高25.80%和22.12%，表明鈣離子螯合劑EGTA和鈣離子通道抑制劑LaCl3與CaCl2同時(shí)浸種處理水稻顯著抑制了CaCl2對(duì)褐飛虱取食誘導(dǎo)的水稻抗蟲性的影響。

圖5 不同濃度CaCl2單獨(dú)浸種(A)以及20 mmol/L CaCl2分別與1 mmol/L EGTA和LaCl3同時(shí)浸種(B)處理7 d對(duì)水稻抗褐飛虱的影響

3 結(jié)論和討論

植物的誘導(dǎo)抗性又稱獲得性免疫，指植物在一定的生物或非生物因子的刺激作用下，通過信號(hào)傳導(dǎo)激活植物的天然防御機(jī)制，涉及到組織、細(xì)胞、分子結(jié)構(gòu)與功能的一系列變化，而各種生理生化代謝首先是以防御酶的催化來實(shí)現(xiàn)的(王杰等, 2018; 孟琳欽等, 2019; 蒲恒滸等, 2019; 王琦等, 2019)。苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物合成木質(zhì)素、酚類等次生代謝物質(zhì)的關(guān)鍵酶(黃珊珊等, 2012)，多酚氧化酶(PPO)能將植物中的酚類物質(zhì)氧化為影響昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的高毒性醌類物質(zhì)，阻礙昆蟲對(duì)植物營養(yǎng)的利用，減緩昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育并促使其死亡(雷東鋒等, 2004; 田旭濤等, 2013)，而過氧化物酶(POD)有助于木質(zhì)素的合成，強(qiáng)化植物細(xì)胞壁，阻礙刺吸式害蟲取食(賈貞等, 2004)。這3個(gè)防御酶的活性與植物抗蟲性密切相關(guān)，抗褐飛虱的水稻品種如Rathu Heenati(RH)品種中，褐飛虱取食顯著誘導(dǎo)植株P(guān)AL酶活性升高(劉裕強(qiáng)等, 2005)；吳碧球等(2016)研究表明水稻抗褐飛虱品種IR56遭受褐飛虱脅迫后，葉鞘PAL, POD和PPO活性顯著升高，通過回歸模型檢驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)IR56水稻品種植株的PAL, POD和PPO活性與抗褐飛虱的能力成正比。β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-GA)是一種廣泛存在于高等植物中的水解酶，與植物的木質(zhì)素和韌皮部組織都密切相關(guān)(李春娟等, 2004; 狄浩, 2013)，刺吸式口器害蟲煙粉虱Bemisiatabaci和麥雙尾蚜Diuraphisnoxia取食可顯著誘導(dǎo)β-1,3-GA活性(Van der Westhuizenetal., 1998; 王洪濤等, 2011)。

營養(yǎng)元素氮、鉀和硅等，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑如茉莉酸、茉莉酸甲酯、水楊酸甲酯等可以誘導(dǎo)增強(qiáng)植物防御酶的活性，從而增強(qiáng)植物抗蟲性(Yeetal., 2013; 叢春雷等, 2014; 吳碧球等, 2016; 楊浪, 2017; 蒲恒滸等, 2019; 徐松鶴等, 2019)。鈣是植物重要的營養(yǎng)元素，Zeng等(2020)分別用10, 30和50 mmol/L CaCl2對(duì)菜豆進(jìn)行浸種、根灌和葉片噴施處理，發(fā)現(xiàn)3種處理方式都能誘導(dǎo)菜豆葉片POD, β-1,3-GA和LOX的活性，每種處理方式中均以10 mmol/L CaCl2的誘導(dǎo)效果較好。余朝閣等(2012)發(fā)現(xiàn)用20 mmol/L CaCl2噴施番茄植株葉片可以顯著誘導(dǎo)PAL, POD和PPO活性，增強(qiáng)植株對(duì)灰霉病的抗性，而當(dāng)噴施Ca2+螯合劑EGTA和鈣通道抑制劑LaCl3時(shí)，植株對(duì)灰霉病的抗性被不同程度地抑制。本研究發(fā)現(xiàn)褐飛虱取食顯著誘導(dǎo)了水稻PAL, POD, PPO和 β-1,3-GA活性(圖1-4)，說明這些酶在水稻防御褐飛虱的過程中發(fā)揮著重要作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在沒有褐飛虱取食脅迫的情況下，CaCl2浸種處理的水稻植株其葉鞘PAL, POD, PPO和 β-1,3-GA 活性與水浸種處理的對(duì)照植株相比均沒有明顯差異，然而當(dāng)其遭受褐飛虱取食時(shí)，這些防御酶的活性升高的幅度都高于被取食的對(duì)照植株升高的幅度(圖1-4)，該結(jié)果表明經(jīng)過CaCl2浸種處理的水稻，當(dāng)其受褐飛虱為害時(shí)會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)烈的防御反應(yīng)。但不同濃度CaCl2對(duì)不同防御酶活性的誘導(dǎo)效果不同，其中30 mmol/L CaCl2浸種處理對(duì)PAL和POD活性的誘導(dǎo)效果最好(圖1和2)，10和30 mmol/L CaCl2浸種處理對(duì)PPO活性的誘導(dǎo)效果最好(圖3)，10和20 mmol/L CaCl2浸種處理對(duì)β-1,3-GA活性的誘導(dǎo)效果最好(圖4)，可見對(duì)于不同作物和不同害蟲而言，CaCl2處理方式和濃度對(duì)作物防御酶的誘導(dǎo)效果存在一定差異。

褐飛虱存活率是水稻植株抗性的重要指標(biāo)(Yangetal., 2021)，通過檢測(cè)褐飛虱若蟲的存活率，我們發(fā)現(xiàn)褐飛虱若蟲取食10, 20和30 mmol/L CaCl2浸種處理水稻植株7 d后，其存活率均顯著低于取食對(duì)照植株的褐飛虱，但取食40和50 mmol/L CaCl2浸種處理的植株后，褐飛虱若蟲的存活率無顯著差異(圖5: A)，表明不同濃度CaCl2浸種處理水稻對(duì)褐飛虱存活率的影響不同，中低濃度的CaCl2處理的水稻植株對(duì)褐飛虱的抗性較強(qiáng)。在非生物逆境中，研究者們也發(fā)現(xiàn)中低濃度外源鈣處理顯著增強(qiáng)了植物對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫的抗性，如Roy等(2019)在水稻種子階段用10和15 mmol/L CaCl2浸泡處理，發(fā)現(xiàn)其浸種處理均能提高植物的耐鹽性，但低濃度10 mmol/L CaCl2浸種處理的效果更好；同樣地，蔡喜悅等(2013)發(fā)現(xiàn)高濃度的Ca2+抑制了復(fù)羽葉欒樹Koelreuteriabipinnata的發(fā)芽率，中低濃度的Ca2+(10和15 mmol/L)改善了其發(fā)芽特性，同時(shí)增強(qiáng)復(fù)羽葉欒樹K.bipinnata抗旱性的能力強(qiáng)于高濃度的CaCl2處理。

EGTA和LaCl3分別是鈣離子螯合劑和鈣離子通道抑制劑，Ding等(2019)利用EGTA和LaCl3噴施處理茶樹，發(fā)現(xiàn)EGTA和LaCl3阻礙了植株中的Ca2+信號(hào)的傳遞，茶樹抗寒能力減弱，由此說明茶樹抗寒能力與Ca2+信號(hào)的傳遞密切相關(guān)。劉勇和郅軍銳(2018)的研究發(fā)現(xiàn)葉面噴施50 mmol/L CaCl2明顯增強(qiáng)了菜豆對(duì)西花薊馬的抗性，而EGTA和LaCl3抑制了外源鈣對(duì)菜豆抗蟲性的誘導(dǎo)。Wang等(2021)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過氯化鈣浸種處理的小麥植株，當(dāng)其遭受麥二叉蚜Schizaphisgraminum取食時(shí)，葉片鈣調(diào)素蛋白活性，鈣離子含量、鈣信號(hào)通路TaCaM基因和胼胝質(zhì)合成基因(TaGSL2,TaGSL10和TaGSL19)表達(dá)上調(diào)幅度都明顯高于水浸種處理的對(duì)照植株，表明內(nèi)源鈣信號(hào)傳遞是外源鈣誘導(dǎo)增強(qiáng)小麥抗蟲性的關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)取食EGTA+CaCl2和LaCl3+CaCl2浸種處理水稻植株的褐飛虱若蟲，其存活率均高于取食CaCl2浸種處理植株的若蟲(圖5: B)，表明EGTA和LaCl3顯著抑制了CaCl2誘導(dǎo)的水稻抗蟲性，表明在種子階段水稻內(nèi)源鈣信號(hào)傳遞在外源鈣誘導(dǎo)水稻抗褐飛虱的過程中扮演著重要角色。

綜上，本研究結(jié)果表明通過浸種方式對(duì)水稻進(jìn)行外源鈣處理，可以使水稻植株進(jìn)入防御警備狀態(tài)，當(dāng)水稻遭受褐飛虱取食為害時(shí)，水稻會(huì)產(chǎn)生更高的抗蟲防御酶活性，增強(qiáng)水稻對(duì)褐飛虱的抗性，然而氯化鈣誘發(fā)增強(qiáng)水稻抗蟲性的分子機(jī)理還有待深入研究。