基于苦味閾值濃度的藥物分子苦度定量方法研究

高曉潔，白明學(xué)，桂新景，王艷麗，王君明，姚 靜，張 璐，施鈞瀚，李學(xué)林，劉瑞新*

基于苦味閾值濃度的藥物分子苦度定量方法研究

高曉潔1，白明學(xué)1，桂新景2, 3, 4, 5, 6，王艷麗2, 3, 4, 5, 6，王君明3，姚 靜2, 3, 4, 5, 6，張 璐2, 3, 4, 5, 6，施鈞瀚2, 3, 4, 5, 6，李學(xué)林2, 3, 4, 5, 6，劉瑞新2, 3, 4, 5, 6*

1. 鄭州市中醫(yī)院 制劑室，河南 鄭州 450007 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450000 3. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008 4. 河南省中藥飲片臨床應(yīng)用現(xiàn)代化工程研究中心，河南 鄭州 450000 5. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450000 6. 河南省中藥臨床藥學(xué)中醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450000

建立僅與藥物分子屬性有關(guān)的藥物分子苦度（molecule bitterness，MB）的定量方法。采用口嘗法，以鹽酸小檗堿為標(biāo)準(zhǔn)苦味物質(zhì)，以不同濃度的鹽酸小檗堿、奎寧、苦參堿、延胡索乙素、穿心蓮內(nèi)酯、梔子苷、葛根素、柚皮苷、-精氨酸、熊果苷、益母草堿、檸檬苦素、獐牙菜苦苷、蘆薈苷、龍膽苦苷、鹽酸青藤堿、氧化苦參堿、京尼平苷、槐定堿的水溶液為載體，采用“最小極限法”預(yù)測(cè)苦味閾值濃度（bitterness threshold concentration，BTC），并基于此計(jì)算其MB；以鹽酸小檗堿、苦參堿、氧化苦參堿、穿心蓮內(nèi)酯、葛根素的水溶液為載體，采用電子舌測(cè)得不同濃度溶液的響應(yīng)值，基于口嘗法測(cè)得的鹽酸小檗堿的BTC，預(yù)測(cè)其他4種苦味單體的BTC，進(jìn)而預(yù)測(cè)其MB。采用口嘗法，測(cè)得感知到苦味的人數(shù)比例與苦味單體的濃度之間符合威布爾曲線關(guān)系，然后由擬合的曲線計(jì)算出BTC，進(jìn)而測(cè)得了19種苦味單體的MB；在BTC試驗(yàn)的測(cè)定范圍內(nèi)，電子舌傳感器僅對(duì)鹽酸小檗堿和苦參堿的測(cè)定得到有效數(shù)據(jù)，但對(duì)其產(chǎn)生響應(yīng)的傳感器不同，不同傳感器之間信息相互獨(dú)立，基于電子舌未能得到苦參堿的BTC。采用口嘗法建立了基于BTC的MB的測(cè)定方法，并測(cè)定出19種苦味單體的MB；雖未能建立基于電子舌的MB預(yù)測(cè)方法，但是為后續(xù)苦度定量方法研究提供借鑒。

最小極限法；苦味閾值濃度；分子苦度；口嘗法；電子舌；鹽酸小檗堿；苦參堿

長(zhǎng)久以來(lái)，人們對(duì)藥物苦味的評(píng)價(jià)多是通過(guò)定性的描述來(lái)表達(dá)，如無(wú)法忍受的苦、有點(diǎn)苦、幾乎沒(méi)有苦味等，缺乏對(duì)其客觀定量的表達(dá)。已有的藥物苦度定量方法多存在測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、適用范圍窄等問(wèn)題，沒(méi)有一套科學(xué)、可行、規(guī)范的測(cè)試體系，這對(duì)開(kāi)展藥物的掩味研究是非常不利的。因此，采用一定的方法對(duì)藥物苦度進(jìn)行測(cè)量，使其可以用準(zhǔn)確的數(shù)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行表達(dá)，是非常必要的。

在食品領(lǐng)域，人們?cè)鴩L試定量測(cè)定苦度。如常通過(guò)計(jì)算所含全部異構(gòu)化α-酸（啤酒苦味的主要來(lái)源）的量來(lái)測(cè)定啤酒的苦度，其表示方式有歐洲苦度單位（Europe bitterness units，EBU）[1-2]、國(guó)際苦度單位（international bitter units，IBU）[3]等。然而，在藥學(xué)領(lǐng)域，尤其在中藥學(xué)領(lǐng)域，由于苦味成分復(fù)雜，通過(guò)計(jì)算單位體積內(nèi)某種特定苦味成分含量的方法，很難應(yīng)用于藥物的苦度測(cè)量。

味道的產(chǎn)生，本質(zhì)上是物質(zhì)分子溶于唾液，與舌頭上的味蕾受體相結(jié)合，產(chǎn)生不同的電信號(hào)，從而感應(yīng)出不同的味道。1972年Kier對(duì)甜味AH/B系統(tǒng)理論進(jìn)行了擴(kuò)展，提出著名的AH,B,X甜味三角理論。即A和B是空間相距0.25～0.40 nm的帶負(fù)電荷的2個(gè)原子，其中A與帶正電的質(zhì)子結(jié)合成為AH，AH在整體上可認(rèn)為是酸，B為質(zhì)子受體，可認(rèn)為是堿，而X為疏水（親油）結(jié)合基團(tuán)，該基團(tuán)在與AH、B分別相距0.35 nm和0.55 nm的地方與二者構(gòu)成AH,B,X甜味三角形（生甜團(tuán)）[4]。與甜味受體模型非常相似，苦味物質(zhì)分子與受體之間的結(jié)合也可以用AH/B結(jié)構(gòu)來(lái)表示，苦味助味基取決于其疏水性結(jié)構(gòu)。許多化學(xué)結(jié)構(gòu)迥異的化合物都具有苦味，如生物堿、糖苷、萜類(lèi)、苦味肽以及金屬離子等，苦味的產(chǎn)生除了與苦味分子的形狀、大小有關(guān)，也與所含官能團(tuán)的性質(zhì)及其在分子中的位置相關(guān)。因此，研究者們把與藥物濃度無(wú)關(guān)，而僅與藥物分子的屬性相關(guān)的苦度，稱之為分子苦度（molecule bitterness，MB）。本研究旨在建立基于苦味閾值濃度（bitterness threshold concentration，BTC）的MB的測(cè)量方法，為藥物的苦度評(píng)價(jià)提供量化指標(biāo)，并為藥物掩味研究奠定基礎(chǔ)，開(kāi)拓藥物的商業(yè)價(jià)值，提高藥物的服用效果。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BCA2248-CW電子天平、CP225D十萬(wàn)分之一電子天平，德國(guó)Sartorius公司；HK250科導(dǎo)臺(tái)式超聲清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；AM-5250B磁力攪拌器，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；HH-S4A電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；TS-5000Z型電子舌，日本Insent公司。

1.2 材料

苦味單體：鹽酸小檗堿購(gòu)自于四川省玉鑫藥業(yè)有限公司，批號(hào)為140406，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.62%；奎寧購(gòu)自于北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司，批號(hào)為C10017584，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為＞98.5%；苦參堿、延胡索乙素、穿心蓮內(nèi)酯、梔子苷、葛根素、柚皮苷、-精氨酸、熊果苷、益母草堿等均購(gòu)自于西安嘉天生物科技有限公司，批號(hào)分別為JT20140418、JT20141010、JT20141026、JT20150214、JT20141102、JT20150222、20140412、JT20150401、JT20150326，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為98.12%、98.12%、98.28%、98.12%、98.54%、98.08%、98.0%、99.59%、98.05%；檸檬苦素、獐牙菜苦苷、蘆薈苷、龍膽苦苷、鹽酸青藤堿、氧化苦參堿、京尼平苷、槐定堿均購(gòu)自于西安昊軒生物科技有限公司，批號(hào)分別為HXNMKS- 150210、HXZYCKG-150326、HXLHG-140815、LDKG20150411、YSQTJ20150315、YHKSJ20150409、JNPG20150415、HDJ20150415，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為98.26%、98.12%、98.12%、98.10%、98.20%、98.50%、98.60%、98.20%。

2 方法與結(jié)果

2.1 口嘗法評(píng)價(jià)

2.1.1 志愿者篩選 經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)后，課題組對(duì)招募的志愿者進(jìn)行了包括苦味敏感度等在內(nèi)的嚴(yán)格篩選，最終選擇22名健康志愿者（男7名、女15名）作為受試者，在試驗(yàn)前簽訂知情同意書(shū)。

2.1.2 評(píng)價(jià)方法 將樣品按照濃度由低到高的順序進(jìn)行編號(hào)并置于口嘗紙杯中，并在樣品序列中隨機(jī)加入1個(gè)陰性樣品（純化水），然后志愿者按編號(hào)順序?qū)悠泛诳谥?，?jì)時(shí)15 s，此間口腔做漱口動(dòng)作，使舌根和舌側(cè)的苦味感受區(qū)能夠充分感受藥物是否具有苦味，將結(jié)果填入“藥物苦味評(píng)價(jià)表”中，然后吐出樣品，漱口5次，至口腔內(nèi)無(wú)苦味，1～2 min后測(cè)定下1個(gè)樣品。

2.1.3 基于BTC的MB 采用最小極限法測(cè)定37 ℃下標(biāo)準(zhǔn)苦味物質(zhì)和其他各苦味單體水溶液的BTC，即半數(shù)志愿者嘗到苦味的最低濃度。以鹽酸小檗堿為標(biāo)準(zhǔn)苦味物質(zhì)，在鹽酸小檗堿的BTC下，其MB定為1，則其他苦味分子的MB＝r/。其中r表示標(biāo)準(zhǔn)苦味物質(zhì)的BTC；表示未知苦味分子的BTC。通常情況下，不同苦味分子的BTC相差較大，因此導(dǎo)致不同物質(zhì)的MB數(shù)值上差別很大。為此，引入“分子苦度指數(shù)”（MB-index，MBI），即將MB取自然對(duì)數(shù)，以減少數(shù)量級(jí)差別。

2.1.4 樣品配制 將鹽酸小檗堿配制成濃度分別為3.83、7.65、11.50、15.30、23.00、30.60、61.20 μmol/L的溶液；將苦參堿配制成濃度分別為0.10、0.20、0.31、0.41、0.61、0.81、1.63 mmol/L的溶液；將穿心蓮內(nèi)酯配制成濃度分別為1.15、1.38、1.73、2.07、2.60、3.11、3.89 mmol/L的溶液；將延胡索乙素配制成濃度分別為1.39、1.85、2.78、3.70、5.55、7.40、11.10 mmol/L的溶液；將獐牙菜苦苷配制成濃度分別為0.05、0.08、0.10、0.15、0.20、0.31、0.41 mmol/L的溶液；將檸檬苦素配制成濃度分別為3.60、5.40、7.20、10.80、14.40、21.60、28.80 μmol/L的溶液；將葛根素配制成濃度分別為0.41、0.62、0.83、1.24、1.65、2.48、3.30 mmol/L的溶液；將奎寧配制成濃度分別為9.23、12.30、18.50、24.60、36.90、49.20、73.80 μmol/L的溶液；將蘆薈苷配制成濃度分別為15.40、23.10、30.80、46.20、61.60、92.30、123.00 μmol/L的溶液；將柚皮苷配制成濃度分別為0.16、0.23、0.31、0.47、0.63、0.94、1.25 mmol/L的溶液；將鹽酸青藤堿配制成濃度分別為20.21、26.93、40.42、53.85、80.84、107.70、161.80 μmol/L的溶液；將梔子苷配制成濃度分別為0.13、0.19、0.25、0.38、0.51、0.76、1.01 mmol/L的溶液；將京尼平苷配制成濃度分別為0.47、0.71、0.94、1.42、1.89、2.83、3.78 mmol/L的溶液；將熊果苷配制成濃度分別為0.73、1.10、1.47、2.20、2.94、4.41、5.97 mmol/L的溶液；將氧化苦參堿配制成濃度分別為3.64、4.87、7.28、9.74、14.56、19.48、29.13 μmol/L的溶液；將益母草堿配制成濃度分別為0.12、0.18、0.24、0.36、0.48、0.71、0.95 mmol/L的溶液；將-精氨酸配制成濃度分別為19.80、26.48、39.60、52.95、79.20、105.90、158.00 mmol/L的溶液；將槐定堿配制成濃度分別為6.87、9.04、13.73、18.09、27.47、36.18、54.94 μmol/L的溶液；將龍膽苦苷配制成濃度分別為14.49、20.71、29.58、42.26、60.37、86.24、123.20 μmol/L的溶液。

2.1.5 離群值的剔除 由于實(shí)驗(yàn)對(duì)象為生物樣本，且不同受試者之間存在個(gè)體差異，實(shí)驗(yàn)測(cè)試數(shù)據(jù)可能有個(gè)別異常值。因此，根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GBT12315- 2008中8.2.1個(gè)人表現(xiàn)判定Spearman相關(guān)系數(shù)的規(guī)定，對(duì)所有評(píng)價(jià)員的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，當(dāng)對(duì)陰性樣品的評(píng)價(jià)仍為“1”，或者違反韋伯-費(fèi)希納定律：刺激量與刺激強(qiáng)度成正比的規(guī)律，則剔除該評(píng)價(jià)員對(duì)該組樣品的評(píng)價(jià)結(jié)果。

2.1.6 口嘗測(cè)試結(jié)果 對(duì)上述19種苦味單體的口嘗評(píng)價(jià)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，19種苦味單體濃度的對(duì)數(shù)與感知到到苦味的人數(shù)比例成正相關(guān)關(guān)系，與韋伯-費(fèi)希納定律一致[7-8]。因此，分別對(duì)19種苦味單體感知到苦味的人數(shù)比例為0～100%的范圍內(nèi)對(duì)不同濃度（）下感知苦味的人數(shù)比例（0）分別做威布爾曲線和對(duì)數(shù)曲線，二者關(guān)系式如下。采用“規(guī)劃求解”建立威布爾曲線和Excel建立對(duì)數(shù)曲線，19種苦味單體不同的濃度（）與感知到苦味的人數(shù)比例（0，在0～100%）之間的擬合方程見(jiàn)表1。其中0代表感知到苦味的人數(shù)比例，代表濃度，e是自然數(shù)對(duì)數(shù)的底數(shù)，是樣品濃度個(gè)數(shù)。

0＝1()＝[1－e?(C－)/k] （1）

0＝1()＝ln＋（2）

表示濃度，、、、、、為待定參數(shù)

由上述擬合方程的2可知，19種苦味物質(zhì)的威布爾模型均優(yōu)于對(duì)數(shù)曲線模型，因此，采用威布爾模型建立19種苦味物質(zhì)不同濃度下感知到苦味的人數(shù)比例0模型。以鹽酸小檗堿為標(biāo)準(zhǔn)苦味物質(zhì)，按照“2.1.3”項(xiàng)所述方法分別計(jì)算19種苦味單體的BTC、MB以及MBI，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 電子舌測(cè)定

2.2.1 TS-5000Z電子舌簡(jiǎn)介 TS-5000Z電子舌，是采用了類(lèi)似于人類(lèi)舌頭味覺(jué)細(xì)胞工作原理的人工脂膜傳感器技術(shù)，可以客觀數(shù)字化的評(píng)價(jià)食品或藥品等樣品的酸味、甜味、苦味、咸味、鮮味、澀味的先味，同時(shí)還可以分析苦味、澀味、鮮味的回味。這個(gè)傳感器技術(shù)的響應(yīng)狀態(tài)同人的舌頭對(duì)味道的響應(yīng)極為相似，味覺(jué)傳感器上的脂膜通過(guò)與呈味物質(zhì)之間的靜電作用或者疏水性相互作用產(chǎn)生膜電勢(shì)的變化，并將該電勢(shì)作為傳感器的輸出信號(hào)傳輸?shù)诫娔X進(jìn)行分析，以此認(rèn)知味強(qiáng)度及味特征。

2.2.2 樣品制備

（1）正極清洗液配制：準(zhǔn)確稱量7.46 g氯化鉀，用500 mL蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，然后?zhǔn)確加入300 mL無(wú)水乙醇溶液，邊攪拌邊加入準(zhǔn)確稱量的0.56 g氫氧化鉀，溶解完畢后，轉(zhuǎn)移到1000 mL量瓶中，定容，即得。

（2）負(fù)極清洗液配制：準(zhǔn)確量取300 mL無(wú)水乙醇，與500 mL蒸餾水震蕩混合，然后加入8.3 mL的濃鹽酸攪拌混合轉(zhuǎn)移到1000 mL量瓶中，定容，即得。

表1 19種苦味單體不同的濃度C與感知到苦味的人數(shù)比例P0的擬合方程

Table 1 Fitting equation between different concentration (C) of 19 bitter monomers and the proportion (P0) of people who felt bitter

苦味物質(zhì)n威布爾曲線對(duì)數(shù)曲線 鹽酸小檗堿5P0＝1.03 [1－e?(C＋5.32)3.12/7 723.71]，R2＝0.968 3，P＜0.01P0＝0.52 lnC－0.63，R2＝0.938 7，P＜0.01 苦參堿5P0＝1.01 [1－e?(C－0.10)1.33/0.10]，R2＝0.996 0，P＜0.01P0＝0.58 lnC＋1.34，R2＝0.979 8，P＜0.01 穿心蓮內(nèi)酯6P0＝1.02 [1－e?(C－1.38)0.87/0.62]，R2＝0.997 0，P＜0.01P0＝0.91 lnC－0.10，R2＝0.862 2，P＜0.01 延胡索乙素6P0＝0.95 [1－e?(C－1.85)2.08/2.76]，R2＝0.994 5，P＜0.01P0＝0.59 lnC－0.26，R2＝0.879 7，P＜0.01 獐牙菜苦苷5P0＝1.08 [1－e?(C－0.08)1.74/0.03]，R2＝0.999 8，P＜0.01P0＝0.75 lnC＋1.84，R2＝0.968 5，P＜0.01 檸檬苦素5P0＝1.00 [1－e?(C－3.08)3.99/7 723.71]，R2＝0.999 3，P＜0.01P0＝0.81 lnC－1.45，R2＝0.927 7，P＜0.01 葛根素5P0＝0.98 [1－e?(C－0.41)2.19/0.05]，R2＝0.998 5，P＜0.01P0＝0.73 lnC＋0.78，R2＝0.853 6，P＜0.05 奎寧6P0＝1.02 [1－e?(C－9.23)0.62/2.86]，R2＝0.992 2，P＜0.01P0＝0.53 lnC－0.94，R2＝0.812 7，P＜0.05 蘆薈苷6P0＝0.99 [1－e?(C＋3.17)3.20/131 481.94]，R2＝0.992 3，P＜0.01P0＝0.57 lnC－1.47，R2＝0.919 1，P＜0.01 柚皮苷4P0＝39.50 [1－e?(C－0.07)0.55/23.58]，R2＝0.994 5，P＜0.01P0＝0.52 lnC＋1.37，R2＝0.989 8，P＜0.01 鹽酸青藤堿5P0＝1.00 [1－e?(C－15.22)2.33/7 723.72]，R2＝0.997 3，P＜0.01P0＝0.77 lnC－2.55，R2＝0.986 2，P＜0.01 梔子苷6P0＝0.65 [1－e?(C＋1.09)11.34/121.86]，R2＝0.989 7，P＜0.01P0＝0.39 lnC＋0.72，R2＝0.968 5，P＜0.01 京尼平苷4P0＝0.93 [1－e?(C－0.47)4.13/0.05]，R2＝0.982 8，P＜0.01P0＝0.95 lnC＋0.48，R2＝0.934 1，P＜0.05 熊果苷5P0＝1.02 [1－e?(C－0.46)1.47/1.20]，R2＝0.967 2，P＜0.01P0＝0.64 lnC＋0.32，R2＝0.960 8，P＜0.01 氧化苦參堿7P0＝0.96 [1－e?(C＋8.93)4.12/139 736.52]，R2＝0.964 0，P＜0.01P0＝0.44 lnC－0.37，R2＝0.955 1，P＜0.01 益母草堿4P0＝1.00 [1－e?(C－0.05)1.63/0.08]，R2＝1.000 0，P＜0.01P0＝0.43 lnC＋1.13，R2＝0.922 1，P＜0.05 L-精氨酸6P0＝0.91 [1－e?(C＋68.98)9.70/1.0×1020]，R2＝0.990 8，P＜0.01P0＝0.58 lnC－1.69，R2＝0.945 5，P＜0.01 槐定堿7P0＝0.98 [1－e?(C－6.87)1.64/59.73]，R2＝0.999 3，P＜0.01P0＝0.55 lnC－1.08，R2＝0.950 1，P＜0.01 龍膽苦苷5P0＝1.02 [1－e?(C－14.49)1.71/187.41]，R2＝0.999 2，P＜0.01P0＝0.76 lnC－2.09，R2＝0.974 5，P＜0.01

表2 19種苦味單體的BTC、MB、MBI

Table 2 BTC, MB and MBI of 19 bitter monomers

名稱BTC/(μmol?L?1)MBMBI 氧化苦參堿7.551.347 30.298 1 鹽酸小檗堿10.171.000 00.000 0 檸檬苦素11.680.870 4?0.138 8 奎寧12.110.839 8?0.174 6 槐定堿16.730.607 7?0.498 0 龍膽苦苷31.370.324 1?1.126 6 蘆薈苷32.550.312 4?1.163 5 鹽酸青藤堿55.170.184 3?1.691 0 獐牙菜苦苷177.630.057 2?2.860 4 柚皮苷184.480.055 1?2.898 2 益母草堿221.680.045 9?3.081 9 苦參堿236.070.043 1?3.144 8 梔子苷484.180.021 0?3.863 1 葛根素641.480.015 9?4.144 5 京尼平苷929.700.010 9?4.515 6 熊果苷1 325.890.007 7?4.870 5 穿心蓮內(nèi)酯1 744.090.005 8?5.144 7 延胡索乙素3 263.420.003 1?5.771 2 L-精氨酸43 748.660.000 2?8.366 9

（3）參比液配制：準(zhǔn)確稱量2.24 g氯化鉀和0.045 g酒石酸用500 mL水溶解，然后轉(zhuǎn)移到1000 mL量瓶中，定容，即得。

（4）待測(cè)樣品溶液配制：鹽酸小檗堿、苦參堿、穿心蓮內(nèi)酯、葛根素、氧化苦參堿溶液配制方法同“2.1.4”項(xiàng)下各樣品溶液的配制方法。

2.2.3 電子舌測(cè)試方法 TS-5000Z型電子舌測(cè)量程序：首先在清洗液中清洗90 s，接著用參比液清洗120 s、繼續(xù)用新的參比液清洗120 s，傳感器在平衡位置歸零30 s，達(dá)到平衡條件后，開(kāi)始測(cè)試，測(cè)試時(shí)間30 s；在2組參比液中分別短暫清洗3 s，傳感器插入新的參比液中測(cè)試回味30 s。循環(huán)測(cè)試4次，去掉第1次循環(huán)，取后3次平均數(shù)據(jù)作為測(cè)試結(jié)果。每次清洗、平衡和測(cè)試回味的液體均分布在不同樣品杯中。

2.2.4 指標(biāo)選擇 TS-5000Z味覺(jué)分析系統(tǒng)中常用的指標(biāo)有先味（relative value，）及回味（change of membrane potential caused by adsorption，CPA）[5-6]，二者分別表示如下。

＝s－r（3）

CPA＝r′－r（4）

r為傳感器在參比液中的電勢(shì)值，s為傳感器在待測(cè)樣品中的電勢(shì)值，r′為傳感器在參比液中短暫清洗后的電勢(shì)值

2.2.5 傳感器的選擇 TS-5000Z電子舌共有C00、AN0、BT0、AE1、GL1、CA0、CT0 7根傳感器，其中C00和AE1傳感器有先味和回味2種味覺(jué)信息，而AN0和BT0傳感器只輸出回味值。因此本實(shí)驗(yàn)選取跟苦味有關(guān)的4根傳感器，分別為C00、AN0、BT0、AE1傳感器，共輸出6種味覺(jué)信息值，具體見(jiàn)表3。

表3 傳感器味覺(jué)信息

Table 3 Sensors taste information

傳感器名稱對(duì)應(yīng)的味覺(jué)味覺(jué)信息 先味回味 C00酸性苦味苦味（bitterness）酸性苦味（aftertaste-B） AN0堿性苦味?堿性苦味（B-bitterness2） BT0堿基鹽類(lèi)苦味?堿基鹽類(lèi)苦味（H-bitterness） AE1澀味澀味（astringency）澀味（aftertaste-A）

?表示沒(méi)有先味指標(biāo)

? indicates that there is no taste indicator

2.2.6 電子舌測(cè)試結(jié)果

（1）不同樣品的味覺(jué)特征雷達(dá)圖：圖1顯示了不同樣品的味覺(jué)雷達(dá)圖，其中橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)的單位表示味覺(jué)的單位，1個(gè)單位代表樣品之間濃度相差了20%，經(jīng)專業(yè)人員鑒定20%的濃度差異是正常的人能夠感覺(jué)到的，如果相差低于1個(gè)單位，那么正常的人就不能感覺(jué)到樣品之間的差異[9]。5種樣品的味覺(jué)信息如圖1所示。結(jié)果表明，BT0傳感器和AN0傳感器對(duì)鹽酸小檗堿響應(yīng)顯著，且隨著樣品濃度的增大，苦味回味也呈增大趨勢(shì)；苦參堿此濃度范圍下C00傳感器和AE1傳感器對(duì)苦參堿響應(yīng)顯著，且隨著樣品濃度的增大，苦味和澀味均呈增大趨勢(shì)，苦味和澀味的回味很??；葛根素在測(cè)量濃度范圍內(nèi)AN0傳感器和C00傳感器響應(yīng)顯著，但是AN0傳感器的響應(yīng)值隨著濃度的增加先增大后減小，C00傳感器響應(yīng)無(wú)規(guī)律；對(duì)于氧化苦參堿和穿心蓮內(nèi)酯，所有傳感器的響應(yīng)值均較小，不在最佳輸出范圍內(nèi)。

（2）苦味物質(zhì)BTC的確定：以鹽酸小檗堿為標(biāo)準(zhǔn)苦味物質(zhì)，基于口嘗法，測(cè)得BTC，然后測(cè)得BTC時(shí)的電子舌傳感器響應(yīng)值，對(duì)于未知物質(zhì)，仍然采用電子舌測(cè)得其不同濃度的傳感器響應(yīng)值，在與標(biāo)準(zhǔn)苦味物質(zhì)傳感器響應(yīng)值相同時(shí)，未知物質(zhì)的濃度即為其BTC。

圖1 樣品的味覺(jué)信息雷達(dá)圖

對(duì)不同濃度的鹽酸小檗堿的電子舌AN0和BT0傳感器的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，鹽酸小檗堿濃度的對(duì)數(shù)與AN0傳感器和BT0傳感器的響應(yīng)值（e）呈正相關(guān)關(guān)系，如圖2所示。由表2可知，鹽酸小檗堿的BTC為10.17 μmol/L，在該濃度下，BT0傳感器的響應(yīng)值為8.68，AN0傳感器的響應(yīng)值為3.80。對(duì)于苦參堿，其AN0傳感器和BT0傳感器均無(wú)響應(yīng)，僅C00傳感器有響應(yīng)，但是TS-5000Z電子舌各傳感器測(cè)得的味覺(jué)信息之間相互獨(dú)立，不能相互轉(zhuǎn)換，因此，以鹽酸小檗堿作為標(biāo)準(zhǔn)苦味物質(zhì)，未能計(jì)算出苦參堿的BTC。

圖2 不同濃度的鹽酸小檗堿傳感器響應(yīng)圖

3 討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)苦味物質(zhì)的選擇

在進(jìn)行藥物苦味評(píng)價(jià)時(shí)，一般選擇奎寧作為標(biāo)準(zhǔn)苦味物質(zhì)，但因其相對(duì)不易得、有一定毒性等原因，在中藥苦度評(píng)價(jià)時(shí)，選擇鹽酸小檗堿比奎寧更具有可比性和代表性[10]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇鹽酸小檗堿作為標(biāo)準(zhǔn)苦味物質(zhì)。

3.2 苦味單體的選擇

常見(jiàn)的中藥中具有苦味的化學(xué)成分有生物堿、苷類(lèi)、萜類(lèi)、苦味肽等[11-13]，對(duì)上述19種苦味物質(zhì)進(jìn)行分類(lèi)，其中，鹽酸小檗堿、苦參堿、延胡索乙素、奎寧、氧化苦參堿、鹽酸青藤堿、益母草堿、槐定堿屬于生物堿類(lèi)化合物；獐牙菜苦苷、葛根素、蘆薈苷、柚皮苷、梔子苷、京尼平苷、熊果苷屬于苷類(lèi)化合物；穿心蓮內(nèi)酯、檸檬苦素、龍膽苦苷屬于萜類(lèi)化合物；-精氨酸屬于苦味肽類(lèi)化合物。該部分內(nèi)容的研究均基于口嘗法，選擇的苦味單體載體必須對(duì)人體無(wú)毒害作用，且水溶性要好，由于這些因素的限制，每一類(lèi)化學(xué)成分中選擇的載體數(shù)量不一。

3.3 BTC預(yù)測(cè)的影響因素

BTC為半數(shù)志愿者能夠感知到苦味的最低濃度，由于評(píng)價(jià)員味覺(jué)靈敏度、個(gè)體差異等因素，測(cè)得的BTC會(huì)存在一定的差異，因此，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)對(duì)評(píng)價(jià)員進(jìn)行規(guī)范化培訓(xùn)，此外，先進(jìn)的味覺(jué)傳感器的使用可以彌補(bǔ)口嘗法主觀性強(qiáng)的缺陷。其次，樣品來(lái)源不同，純度高低不同也會(huì)影響預(yù)測(cè)結(jié)果，因?yàn)楸狙芯恐猩婕暗目辔秵误w均為中藥飲片經(jīng)提取分離得到，中藥飲片化學(xué)成分繁多，最終得到的樣品中仍會(huì)殘留有部分雜質(zhì)，由于味覺(jué)神經(jīng)復(fù)雜的傳遞機(jī)制，殘留的雜質(zhì)可能會(huì)對(duì)苦味的呈現(xiàn)起到協(xié)同或拮抗作用，本研究中使用的單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞98%，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)更高的單體能夠獲得更加準(zhǔn)確的BTC。

3.4 文獻(xiàn)記載的單體BTC與測(cè)得BTC的差異

文獻(xiàn)中記載的部分單體的BTC與實(shí)驗(yàn)測(cè)得的BTC如表4所示。文獻(xiàn)記載的BTC和本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的BTC進(jìn)行配對(duì)檢驗(yàn)，結(jié)果表明2組數(shù)據(jù)間不存在顯著性差異（＞0.05），驗(yàn)證了本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性及實(shí)驗(yàn)方法的可行性。

3.5 基于電子舌的藥物BTC

本研究定義的MB是基于BTC的，進(jìn)行基于電子舌的BTC預(yù)測(cè)時(shí)，樣品溶液濃度的設(shè)定與口嘗法相同，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于氧化苦參堿[17]，在較高的濃度時(shí)C00傳感器對(duì)其有響應(yīng)，且隨著測(cè)試溶液濃度的增高，其響應(yīng)值也隨著增加，但是在對(duì)于口嘗法測(cè)得的BTC時(shí)，其傳感器無(wú)響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于某些化合物，在較低濃度時(shí)，TS-5000Z電子舌傳感器不能與化合物相互作用，進(jìn)而不能實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物的味覺(jué)辨識(shí)。因此，靈敏度更高的傳感器膜的開(kāi)發(fā)，對(duì)于實(shí)現(xiàn)電子舌在藥物BTC預(yù)測(cè)方面具有重要意義。

表4 文獻(xiàn)中記載的單體BTC與實(shí)驗(yàn)測(cè)得的BTC的差異

Table 4 BTC difference of monomers between recorded in literature and measured experimentally

單體名稱BTC/(μmol?L?1) 文獻(xiàn)記載實(shí)測(cè) 奎寧10.00[14]12.11 鹽酸小檗堿6.62[10]10.17 柚皮苷34.45[15-16]184.48 檸檬苦素2.13[15]11.68

本研究以生物堿類(lèi)化合物鹽酸小檗堿作為標(biāo)準(zhǔn)苦味物質(zhì)，對(duì)于TS-5000Z電子舌，其AN0和BT0兩根苦味傳感器能對(duì)其產(chǎn)生特異性響應(yīng)，而苦味傳感器C00則不響應(yīng)，這3根傳感器的響應(yīng)值之間相互獨(dú)立，彼此之間不能轉(zhuǎn)化，因此，若某種苦味物質(zhì)采用TS-5000Z傳感器測(cè)定時(shí)，對(duì)AN0和BT0傳感器能夠產(chǎn)生響應(yīng)，則可以采用本研究的方法預(yù)測(cè)其BTC，而本研究選擇的載體，沒(méi)有對(duì)AN0傳感器和BT0傳感器產(chǎn)生響應(yīng)的物質(zhì)，在后續(xù)的研究中，應(yīng)擴(kuò)大研究載體，篩選能夠?qū)N0傳感器和BT0傳感器產(chǎn)生響應(yīng)的物質(zhì)，對(duì)此方法的可行性進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，可嘗試選擇不同味覺(jué)辨識(shí)機(jī)制的味覺(jué)傳感器，建立對(duì)所有苦味物質(zhì)均適用的預(yù)測(cè)BTC的方法。

3.6 苦味的呈味機(jī)制探討

苦味分子可略分2類(lèi)[18-19]：一類(lèi)含僅具有限水溶性的疏水親脂性物質(zhì)，諸如萜類(lèi)等；另一類(lèi)含強(qiáng)極性化合物，這類(lèi)物質(zhì)若不僅能有效地干擾苦味受體的靜電相互作用，也仍能形成強(qiáng)的疏水相互作用，如奎寧、咖啡因等生物堿[20]。有研究表明，一些結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物具有類(lèi)似的苦味性質(zhì)，然而其空間同分異構(gòu)體構(gòu)型不同往往又表現(xiàn)出不同的性質(zhì)。如，-色氨酸是典型的苦味化合物，然而其D型的對(duì)應(yīng)異構(gòu)體卻表現(xiàn)出了甜味的性質(zhì)；槲皮素只有輕微的澀味，但是其相同濃度的同分異構(gòu)體卻具有很強(qiáng)的苦味；橘皮苷沒(méi)有苦味，然而其位置異構(gòu)體卻具有很強(qiáng)的苦味[21]。此外化合物的苦味有時(shí)還與其所處的環(huán)境存在著密切關(guān)系，如亞麻油酸在溶液中只有很弱的苦味，而在乳劑中卻表現(xiàn)出很強(qiáng)的苦味[22-23]。

苦味化合物在自然界中分布廣泛，縱觀國(guó)內(nèi)外的研究，苦味與化合物的結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系，但是目前仍不能闡明苦味由何而來(lái)。研究者們?cè)J(rèn)為化合物中疏水基團(tuán)決定了分子的苦味，但是如之前所述，同分異構(gòu)體能表現(xiàn)出截然不同的苦味性質(zhì)，這表明空間結(jié)構(gòu)也對(duì)苦味性質(zhì)極為重要。近年來(lái)，很多關(guān)于預(yù)測(cè)化合物苦味的模型被建立起來(lái)，如Rodgers等[24]利用已知的近2萬(wàn)種苦味化合物和非苦味化合物建立的模型，在已知的化合物中，對(duì)苦味化合物的辨別能力達(dá)到72%，但是該模型篩選出來(lái)的化合物只有極少數(shù)（33個(gè)）被驗(yàn)證具有苦味。按照現(xiàn)在的研究成果，對(duì)從未嘗過(guò)的化合物判斷其苦味性質(zhì)還是非常困難的，這也和苦味化合物與受體的結(jié)合機(jī)理有關(guān)，仍需要進(jìn)一步的探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on quantitative method of drug’smolecular bitterness based on bitterness threshold concentration

GAO Xiao-jie1, BAI Ming-xue1, GUI Xin-jing2, 3, 4, 5, 6, WANG Yan-li2, 3, 4, 5, 6, WANG Jun-ming3, YAO Jing2, 3, 4, 5, 6,ZHANG Lu2, 3, 4, 5, 6, SHI Jun-han2, 3, 4, 5, 6, LI Xue-lin2, 3, 4, 5, 6, LIU Rui-xin2, 3, 4, 5, 6

1. Department of Pharmaceutical Preparation, Traditional Chinese Medicine Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou 450007, China 2. Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China 3. Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, China 4. Henan ModernizationEngineering Research Center for Clinical Application of Traditional Chinese Medicine Decoction Pieces, Zhengzhou 450000, China 5. Provincial Co-construction Collaborative Innovation Center for Prevention and Treatment of Respiratory Diseases with Traditional Chinese Medicine, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China 6. Henan Key Laboratory for Clinical Pharmacy of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China

To establish a quantitative method of drugs’ molecular bitterness (MB) which is only related to the properties of the drug molecule itself.In this paper, berberine hydrochloride was used as standard bitter substance and berberine hydrochloride, quinine, matrine, tetrahydropalmatine, andrographolide, gardenoside, puerarin, naringin,arginine, arbutin, leonurine, limonin, swertiamarin, aloin, gentiopicroside, sinomenine hydrochloride, oxymatrine, geniposide, sophoridine with different concentrations solutions were used as research carriers, based on the minimum limit method, the bitterness threshold concentration (BTC) of bitter monomer was predicted by traditional human taste panel method, and calculated the MB using BTC finally; Using berberine hydrochloride, matrine, oxymatrine, andrographolide, puerarin solutions with different concentrations as the carriers, the response value of different concentration solutions were measured by electronic tongue. Then, the BTC of the bitter molecules were predicted, and finally the MB of the bitter monomers was predicted.It was measured that the relationship between the proportion of people who felt bitter and the concentration of bitterness monomer conforms to the Weibull curve by using traditional human taste panel method, then the BTC was calculated from the fitted curve, and finally the MB of 19 kinds of bitter monomers were measured; Within the measurement range of the BTC test, the electronic tongue sensors only got valid data for the measurement of berberine hydrochloride and matrine, but the sensor that responded to them were different, and the information between the different sensors were independent, so the BTC of matrine could not be obtained by using electronic tongue.A method for the determination of MB based on BTC was established by using traditional human taste panel method, and the MB of 19 bitter monomers were determined; Although we failed to establish the MB determination method by using electronic tongue, it can be used as a reference for the further study of quantitative methods of bitterness.

minimum limit method; bitterness threshold; molecular bitterness; traditional human taste panel method; electronic tongue; berberine hydrochloride; matrine

R283.6

A

0253 - 2670(2022)03 - 0696 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.03.007

2021-08-27

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81774452）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（81001646）；2017年國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃中醫(yī)藥現(xiàn)代化重點(diǎn)專項(xiàng)（2017YFC1703402）；河南省中醫(yī)藥拔尖人才培養(yǎng)項(xiàng)目資助（2019ZYBJ07）；河南省高層次人才特殊支持“中原千人計(jì) 劃”-“中原青年拔尖人才”項(xiàng)目（ZYQR201912158）；河南省衛(wèi)生健康中青年學(xué)科帶頭人專項(xiàng)（HNSWJW-2020014）

高曉潔，碩士，主管中藥師，從事中藥制劑的開(kāi)發(fā)以及質(zhì)量控制研究。Tel: (0371)86223662 E-mail: 498577500@qq.com

劉瑞新，博士，主任藥師，從事中藥飲片臨床應(yīng)用現(xiàn)代化關(guān)鍵技術(shù)研究。Tel: (0371)66233562 E-mail: liuruixin7@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]