血清炎癥因子在糖尿病性心肌病患者中的表達(dá)及其對(duì)心肌細(xì)胞線粒體功能的影響

朱雅倩, 胡高超, 瞿星光

(湖北省枝江市人民醫(yī)院/湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院枝江分院 重癥醫(yī)學(xué)科, 湖北 宜昌, 443000)

糖尿病性心肌病(DCM)是臨床常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥，患者臨床表現(xiàn)為心肌功能不全，影像學(xué)檢查可見(jiàn)左心室膨大，收縮能力下降，但患者無(wú)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓病等其他心血管疾病。DCM最終進(jìn)展為心力衰竭，甚至引發(fā)心源性休克和猝死，嚴(yán)重威脅糖尿病患者的生命健康[1]。DCM的發(fā)病機(jī)制已有較多研究，通常認(rèn)為慢性高血糖引發(fā)活性氧(ROS)過(guò)度積累，進(jìn)一步通過(guò)影響心肌細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)和糖脂代謝穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體功能異常，最終影響心肌功能[2]。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥因子與DCM的發(fā)病密切相關(guān)。

IL-1β和IL-18是炎癥小體介導(dǎo)釋放的一類(lèi)炎癥因子，在腫瘤和多種感染性疾病中發(fā)揮了重要作用[5]。研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍、SIRT3等可以通過(guò)調(diào)控炎癥小體的活性，影響心肌細(xì)胞功能，干預(yù)DCM的發(fā)病。但I(xiàn)L-1β和IL-18是否與DCM發(fā)病存在關(guān)聯(lián)的研究較少。本研究觀察IL-1β和IL-18在DCM患者外周血中的表達(dá)水平，并分析其對(duì)心肌細(xì)胞線粒體功能的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019—2021年診斷為DCM的患者104例為研究對(duì)象(DCM組)。納入標(biāo)準(zhǔn): 符合2010年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)發(fā)布的2型糖尿病(T2DM)診斷標(biāo)準(zhǔn)者; 就診前半年內(nèi)出現(xiàn)心力衰竭、心律失常、胸悶和端坐呼吸等心肌功能異常的癥狀和體征者; 影像學(xué)檢查顯示左心室舒張功能減退者。排除標(biāo)準(zhǔn): 合并冠心病、先天性心臟病、高血壓性心臟病、病毒性心肌炎等其他繼發(fā)心肌病者; 合并其他感染性疾病、自身免疫性疾病、肝腎功能不全等疾病患者。另選取90例健康志愿者作為健康對(duì)照組。

1.2 試劑和材料

IL-1β和IL-18 Human ProcartaPlexTMSimplex檢測(cè)試劑盒、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司; 重組人IL-1β、重組人IL-18細(xì)胞因子購(gòu)自美國(guó)R&D system公司; CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒、JC-1線粒體活性檢測(cè)試劑、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物科技公司; 鼠源抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體、抗Clevead-Caspase-3(C-Casp3)抗體和抗GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 血清IL-1β、IL-18檢測(cè): 臨床采集健康志愿者和DCM患者外周血血清樣本，凍存于-80 ℃超低溫冰箱。使用IL-1β和IL-18 Human Procarta PlexTMSimplex細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒，在LuminexTM200設(shè)備平臺(tái)檢測(cè)各組血清樣本的IL-1β、IL-18表達(dá)水平。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組: 人心肌細(xì)胞系A(chǔ)C16購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基中。AC16細(xì)胞分為對(duì)照組、IL-1β組和IL-18組。對(duì)照組僅用完全培養(yǎng)基培養(yǎng), IL-1β組和IL-18組分別加入終濃度為10 ng/mL的重組人IL-1β或IL-18, 放置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn): AC16細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞。在分組培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑, 37 ℃孵育1 h。隨后利用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm的吸光值，并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖活力。

1.3.4 線粒體膜電位檢測(cè): 胰酶消化各組AC16細(xì)胞，重懸后取100 μL細(xì)胞懸液，加入100 μL JC-1染色工作液，放置于37 ℃孵育20 min。隨后離心收集細(xì)胞沉淀，漂洗2次，最后用500 μL緩沖液重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞紅色和綠色熒光信號(hào)，并統(tǒng)計(jì)紅色信號(hào)減弱的細(xì)胞比率。

1.3.5 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔檢測(cè): 胰酶消化離心各組AC16細(xì)胞，重懸并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL。取100 μL細(xì)胞懸液，加入鈣黃綠素(Calcein AM)染色液，放置于37 ℃避光孵育30 min。離心收集細(xì)胞，加入500 μL檢測(cè)緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，用流式細(xì)胞儀分析綠色信號(hào)強(qiáng)度，并計(jì)算各組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度(MFI)。

1.3.6 Western blot實(shí)驗(yàn): 收集各組細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液, 4 ℃孵育30 min。隨后離心收集上清全細(xì)胞裂解液，加入5×SDS上樣緩沖液, 100 ℃金屬浴加熱10 min。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白樣品，并轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯膜(PVDF)上。PVDF經(jīng)脫脂奶粉封閉后，分別加入抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體、抗C-Casp3抗體和抗GAPDH抗體稀釋液，室溫孵育2 h。隨后用帶辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，最后加入顯色底物顯示蛋白條帶。用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值，計(jì)算Bax/Bcl-2比值和C-Casp3相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 IL-1β及IL-18在DCM患者血清中的表達(dá)水平

與健康對(duì)照組相比, DCM組患者外周血血清中IL-1β、IL-18水平均呈升高趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組血清IL-1β和IL-18水平比較 ng/L

2.2 IL-1β和IL-18對(duì)心肌細(xì)胞增殖活性的影響

與對(duì)照組相比，在加藥后24 h, IL-1β和IL-18處理的心肌細(xì)胞系A(chǔ)C16細(xì)胞增殖活力略下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 繼續(xù)加藥培養(yǎng)至48、72 h后, IL-1β和IL-18均抑制AC16細(xì)胞的增殖活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞增殖相對(duì)活性

2.3 IL-1β及IL-18對(duì)線粒體膜電勢(shì)的影響

線粒體膜電位由高降低時(shí), JC-1由聚集體轉(zhuǎn)換為單體，紅色熒光水平下降。對(duì)照組JC-1單體比率為(9.17±1.49)%, IL-1β組為(27.55±4.04)%, IL-18組為(20.11±4.81)%; 與對(duì)照組相比, IL-1β組和IL-18組線粒體膜電勢(shì)下降的細(xì)胞比率增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見(jiàn)圖1。

2.4 IL-1β及IL-18對(duì)線粒體膜通透性的影響

用鈣黃綠素標(biāo)記線粒體通透性，流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，與對(duì)照組相比, IL-1β組和IL-18組 AC16細(xì)胞鈣黃綠素?zé)晒鈴?qiáng)度增強(qiáng)，見(jiàn)圖2。對(duì)照組鈣黃綠素平均熒光強(qiáng)度為(37.69±4.49), IL-1β組為(89.51±8.85), IL-18組為(65.72±4.03); IL-1β組、IL-18組鈣黃綠素平均熒光強(qiáng)度均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.5 線粒體依賴(lài)的細(xì)胞凋亡

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, IL-1β或IL-18處理細(xì)胞后, Bax蛋白表達(dá)水平下降, Bcl-2、C-Casp3表達(dá)水平升高，見(jiàn)圖3。對(duì)蛋白表達(dá)水平定量分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比, IL-1β組和IL-18組細(xì)胞Bax/Bcl-2、C-Casp3/GAPDH升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.001), 見(jiàn)表3。

表3 各組凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平

3 討 論

炎癥小體在炎癥反應(yīng)中被激活，并通過(guò)激活Caspase-1對(duì)IL-1β-pro和IL-18-pro進(jìn)行剪切，促進(jìn)炎癥因子IL-1β和IL-18的釋放[8]。研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，炎癥小體的活化與心血管疾病的發(fā)病具有顯著相關(guān)性，但其下游的IL-1β和IL-18在DCM疾病和心肌損傷中的功能尚未闡明。

本研究通過(guò)檢測(cè)外周血血清中IL-1β和IL-18的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了IL-1β和IL-18在DCM患者外周血中顯著升高，提示IL-1β和IL-18可能參與了DCM疾病的發(fā)生和進(jìn)展。研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制炎癥小體及下游IL-1β, 可以保護(hù)敗血癥引發(fā)的心肌損傷; 在急性心肌梗死中，使用IL-1β的中和抗體可以促進(jìn)心肌細(xì)胞排毒和修復(fù)。關(guān)于IL-18的研究[13]也證實(shí)，在腎上腺素引發(fā)的心肌炎癥反應(yīng)中，炎癥小體的活化增加了IL-18的剪切，促進(jìn)了心臟炎癥損傷。這些研究都提示高水平的IL-1β和IL-18可以直接引起心肌損傷。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)人心肌細(xì)胞AC16研究發(fā)現(xiàn), IL-1β和IL-18可以抑制AC16細(xì)胞的增殖活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), IL-1β和IL-18不僅可降低心肌細(xì)胞線粒體膜電位，也增強(qiáng)了線粒體通透性。

當(dāng)前研究對(duì)DCM具體的致病因素仍不明確，研究[14-15]認(rèn)為高血糖引發(fā)的過(guò)氧化物積累和心肌細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，可進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞自噬和凋亡。在細(xì)胞自噬和凋亡的激活中，線粒體都發(fā)揮了重要作用。線粒體不僅為心肌細(xì)胞提供ATP, 促進(jìn)心肌收縮，也是心肌細(xì)胞糖脂代謝和活性氧產(chǎn)生的重要場(chǎng)所。線粒體膜電位的下降會(huì)影響線粒體氧化還原穩(wěn)態(tài)，減少ATP的合成; 線粒體通透性的增加則促進(jìn)了細(xì)胞色素c的釋放，進(jìn)一步激活了線粒體依賴(lài)的細(xì)胞凋亡[16]。本研究也發(fā)現(xiàn), IL-1β和IL-18處理的AC16心肌細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)水平升高，而B(niǎo)cl-2表達(dá)水平下降, Bax/Bcl-2比值顯著升高。Bax上調(diào)會(huì)促進(jìn)其形成二聚體，打開(kāi)線粒體膜通道，降低線粒體膜電位，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放。而生理?xiàng)l件下, Bcl-2可以與Bax相互作用，抑制Bax, 維持線粒體膜電位[17]。對(duì)Bax、Bcl-2表達(dá)水平的分析結(jié)果與既往研究中線粒體膜電位下降、線粒體通透性增加的結(jié)果相一致，表明IL-1β和IL-18作用于心肌細(xì)胞，可以促進(jìn)線粒體依賴(lài)的細(xì)胞凋亡。

本研究也存在不足，體外實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)存在一定的局限性，本研究后續(xù)將結(jié)合藥物誘導(dǎo)的DCM疾病模型小鼠以及小鼠原代心肌細(xì)胞，深入探究IL-1β和IL-18在調(diào)控DCM疾病進(jìn)展及心肌細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制。

綜上所述, DCM疾病進(jìn)展中，炎癥小體相關(guān)的炎癥因子IL-1β和IL-18表達(dá)水平升高。IL-1β和IL-18則通過(guò)抑制線粒體活性，促進(jìn)線粒體依賴(lài)的細(xì)胞凋亡影響心肌細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)心肌損傷。本研究揭示了炎癥小體相關(guān)因子促進(jìn)心肌細(xì)胞損

傷的作用，為深入了解DCM的發(fā)病機(jī)制提供了新視角。