有網(wǎng)脈和無網(wǎng)脈金線蓮雜交及分子鑒定

任嘉欣，石 研，羅 怡，曾黎輝

(福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院，福州 350002)

金線蓮(Anoectochilusroxburghii)為蘭科(Orchidaceae)開唇蘭屬(Anoectochilus)多年生草本植物，別名金石蠶、金線蘭、金線入骨消[1]等，市場上按照地域稱福建金線蓮、臺灣金線蓮、浙江金線蓮、廣西金線蓮等。金線蓮對于急慢性肝炎、高血脂、心血管疾病和輔助抗腫瘤等方面療效顯著，關(guān)于它的研究熱度一直持續(xù)。此外，金線蓮還被大量用于煲湯和制茶，同時還具有較高的觀賞價值[2]。福建道地金線蓮野生種質(zhì)資源中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)有網(wǎng)脈金線蓮(俗稱金線蓮“母”)和無網(wǎng)脈金線蓮(俗稱金線蓮“公”)混雜，黃穎楨等[3]在對福建金線蓮種質(zhì)資源調(diào)查時也發(fā)現(xiàn)，野生環(huán)境中有網(wǎng)脈植株和無網(wǎng)脈植株有伴隨生長的現(xiàn)象，并將其歸位同種植物，認(rèn)為有無網(wǎng)脈是性狀分離所致。

雜交育種是植物領(lǐng)域最常見的育種方式之一，目前已廣泛應(yīng)用于金線蓮育種，但雜交結(jié)實率低及胚敗育等問題仍然存在。滕人達(dá)[4]報道，尖葉金線蓮和圓葉金線蓮人工雜交授粉后胚胎敗育比例較高，認(rèn)為受精后障礙和親本物種間染色體或基因組遺傳不兼容是雜交結(jié)實率低的主要因素。韓怡等[5]認(rèn)為花粉活力直接影響授粉、受精及種子結(jié)實率。金線蓮植株花朵在散粉當(dāng)天花粉就具有活力，花粉活力隨時間推移先上升后下降；貯藏的溫度和時間與花粉貯藏期間的活力相關(guān)性很大，花粉活力隨著貯藏時間的延長而逐漸降低，且室溫條件下花粉活力下降速度最快，4 ℃和-20 ℃條件下降速度減慢。同時，滕人達(dá)[4]認(rèn)為金線蓮存在著雜交不親和性，主要表現(xiàn)在柱頭和花粉識別方面。易彬[6]在溫室栽培金線蓮的雜交授粉試驗中發(fā)現(xiàn)，異花授粉結(jié)實率最高；邵清松報道，蘭科植物中三分之一的植物都是通過欺騙性傳粉來進行物種繁衍的[7]，且大多都是異花傳粉，這種異花傳粉的方式結(jié)實率高，而自花傳粉的結(jié)實率低。目前已有人工異花授粉結(jié)實率的相關(guān)研究，但未見對不同網(wǎng)脈類型金線蓮授粉結(jié)實率的報道，人工異花授粉可改變金線蓮結(jié)實率低的問題，對于其資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新具有重要的理論價值與現(xiàn)實意義。

金線蓮全草均可入藥，其性平味甘，主要化學(xué)成分為多糖、黃酮、揮發(fā)油、三萜、甾體、氨基酸及其配糖體類等，具有降血糖、抗高血壓、保肝、抗HBV等藥理活性，而金線蓮主要有效成分為黃酮、黃酮苷、金線蓮苷、多糖等[8]。顧慧芬等[9]報道，不同地區(qū)野生金線蓮的總黃酮和多糖含量存在差異，且多糖含量的差異明顯大于總黃酮含量差異。黃曉萱等[10]測定了尖葉、大圓葉、小圓葉品系金線蓮中金線蓮苷含量，結(jié)果表明3個品系均含有金線蓮苷成分，但其含量在同一品系各批次金線蓮間相差較大，可能與種苗來源、產(chǎn)地等因素有關(guān)，而在不同品系同地種植金線蓮間相差不大。那么，福建金線蓮主要藥用成分及其含量在有網(wǎng)脈植株和無網(wǎng)脈植株之間可能存在著明顯差異，同時也受到產(chǎn)地的影響。目前，由于缺少對金線蓮品種(系)的高效鑒別和鑒定手段，嚴(yán)重影響了福建省金線蓮特色產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展[11]。因此，亟待開發(fā)快速鑒定金線蓮品種(系)及其近緣雜交品種的有效方法。

CDDP (conserved DNA-derived polymorphism)分子標(biāo)記技術(shù)是依據(jù)植物中功能基因和基因家族的保守氨基酸序列設(shè)計引物，實現(xiàn)快速鑒定不同物種的分子標(biāo)記手段[12]。由于CDDP是基于功能基因片段設(shè)計的引物，因此擴增得到的標(biāo)記片段可能是目的基因的一部分或與基因緊密連鎖，是一種顯性標(biāo)記，具有良好的多態(tài)性，在分子標(biāo)記輔助育種、遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源鑒定等方面有重要的應(yīng)用價值[13]。目前CDDP分子標(biāo)記技術(shù)已在其他藥用植物遺傳多樣性分析及種質(zhì)資源鑒定等方面廣泛應(yīng)用[14]。近年來，用于金線蓮的分子標(biāo)記技術(shù)主要有ISSR[3]、SSR[15]等，而鮮見關(guān)于CDDP分子標(biāo)記應(yīng)用方面的報道。本研究利用ISSR和CDDP聯(lián)合標(biāo)記方法對福建道地金線蓮有網(wǎng)脈、無網(wǎng)脈親本及其雜交后代進行鑒定和遺傳多樣性分析，為合理利用道地金線蓮種質(zhì)資源以及金線蓮品種選育提供技術(shù)支撐，同時為金線蓮的安全使用和品質(zhì)提供有效保障。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試材料為福建武夷山道地金線蓮種質(zhì)資源‘武夷1號’，在種植過程會出現(xiàn)有網(wǎng)脈植株(民間稱之為金線蓮“母”植株)和無網(wǎng)脈植株(金線蓮“公”植株)，選擇生長狀態(tài)良好的林下仿生栽培的有網(wǎng)脈、無網(wǎng)脈植株測定藥用成分，并作為雜交親本，授粉雜交及雜交后代培育在福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院園藝植物遺傳育種研究所進行。在雜交后代培育過程中我們發(fā)現(xiàn)少數(shù)缺少橫脈的中間脈型，其與無網(wǎng)脈植株葉面的主要區(qū)別是否具有縱向主脈，其余性狀與無網(wǎng)脈植株極為相似。本試驗雜交后代均為F1代，為方便后代脈型統(tǒng)計，暫將缺少橫脈植株歸為無網(wǎng)脈植株。

選取金線蓮有網(wǎng)脈、無網(wǎng)脈親本植株葉片，雜交組合A(♀有網(wǎng)脈×♂無網(wǎng)脈)子代中有網(wǎng)脈、無網(wǎng)脈植株葉片分別混樣，于液氮處理后-80 ℃保存，用于基因組DNA提取。Taq Master Mix購自諾維贊生物技術(shù)有限公司，實驗中使用的21條CDDP引物和10條ISSR引物由白鯨生物有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 雜交授粉選取金線蓮父本花后3 d的花粉，母本在現(xiàn)蕾后去雄，取開放后3～4 d的花朵進行授粉。用鑷子在父本蕊柱上取出黃色且具有粘性的花粉塊，置于已去除花粉塊的母本柱頭蕊腔內(nèi)。授粉后掛牌標(biāo)記，24 h內(nèi)不澆水。試驗共設(shè)4個雜交組合(♀×♂)：A(有網(wǎng)脈×無網(wǎng)脈)、B(無網(wǎng)脈×有網(wǎng)脈)、C(無網(wǎng)脈×無網(wǎng)脈)、D(有網(wǎng)脈×有網(wǎng)脈)。

1.2.2 無菌播種采用即采即播的方式。選用植株上已成熟且尚未開裂的蒴果，在超凈工作臺上用75%乙醇浸泡處理30 s，無菌水沖洗2遍，用3%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，無菌水沖洗3遍，置于濾紙上吸干水分，用鑷子和解剖刀縱向切開，取出內(nèi)部種子均勻撒在播種培養(yǎng)基上，先進行24 h暗培養(yǎng)處理，后轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)條件，于溫度(23±2)℃、光照強度2 000～3 000 Lx、光照時間12 h/d條件下進行培養(yǎng)，待雜交幼苗長至2～3 cm，對其性狀進行統(tǒng)計分析。

1.2.3 藥用成分測定金線蓮苷提取參照楊碧云等[16]方法，采用Waters Acquity 超高效液相色譜儀進行檢測，以C18(17 μm，2.1×100 mm)為色譜柱；流動相為水∶乙腈∶甲醇為90∶5∶5等梯度洗脫； 流速為0.2 mL/min；檢測波長為215 nm；柱溫為30 ℃；進樣為5 μL。類黃酮提取采用可見分光光度法，用植物類黃酮試劑盒(蘇州科銘生物科技有限公司)進行提取?？偠嗵呛刻崛〔捎每梢姺止夤舛确ǎ每偠嗵窃噭┖?蘇州科銘生物科技有限公司)進行提取。

1.2.4 基因組DNA的提取采用改良CTAB法[17]提取金線蓮基因組DNA，采用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA，用UV-9000S紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)測定基因組DNA的濃度和質(zhì)量，-20 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.5 ISSR和CDDP標(biāo)記擴增ISSR-PCR擴增體系為25 μL，包含12.5 μL 2×Taq Master Mix，1 μL 10 μmol/L 引物，1 μL DNA(50 ng/μL)，加滅菌ddH2O補齊體積至25 μL。反應(yīng)程序為95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，45～60 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。CDDP擴增體系及程序同ISSR。擴增產(chǎn)物在1×TAE電泳緩沖液中用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，核酸染料染色15 min，JS-2000 凝膠成像分析系統(tǒng) (上海培清科技有限公司) 掃描并保存電泳圖。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析觀察親本性狀及授粉后蒴果的發(fā)育情況，統(tǒng)計其結(jié)實率。記錄不同雜交組合種子萌發(fā)生長的情況，并對幼苗葉脈類型進行區(qū)分，計算其比例。統(tǒng)計ISSR-PCR擴增產(chǎn)物同一位置的條帶，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，利用 Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，利用NTSYS-PC分析軟件按照UPGMA法進行聚類分析，構(gòu)建聚類圖，計算各材料間的遺傳距離和顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 金線蓮親本葉脈性狀及其植株藥用成分含量比較

本試驗所選雜交親本來自于福建武夷山脈，按地區(qū)可稱為武夷山種，命名為‘武夷1號’。有網(wǎng)脈植株擁有明顯的赭石色絹絲光澤網(wǎng)脈，無網(wǎng)脈植株則無網(wǎng)脈，兩者除了葉面網(wǎng)脈顏色有明顯差異之外，其余性狀皆相同(圖1)。

a.有網(wǎng)脈金線蓮; b.無網(wǎng)脈金線蓮圖1 金線蓮親本葉片性狀a. Plant with leaf veins; b. Plant without leaf veinsFig.1 Leaf morphology of Anoectochilus roxburghii parent plants

同時，由表1可知‘武夷1號’有網(wǎng)脈植株和無網(wǎng)脈植株的類黃酮、總多糖和金線蓮苷含量均存在顯著差異(P<0.05)。類黃酮和總多糖含量均表現(xiàn)為有網(wǎng)脈金線蓮顯著高于無網(wǎng)脈金線蓮，有網(wǎng)脈金線蓮的總多糖含量是無網(wǎng)脈金線蓮的1.3倍；而金線蓮苷作為金線蓮主要藥用指標(biāo)之一，表現(xiàn)為無網(wǎng)脈金線蓮的含量顯著高于有網(wǎng)脈金線蓮，分別為6.92和6.31 mg/g。

表1 有網(wǎng)脈金線蓮和無網(wǎng)脈金線蓮藥用成分含量

2.2 金線蓮不同雜交組合結(jié)實率和種子萌發(fā)率

不同金線蓮雜交組合的結(jié)實率統(tǒng)計結(jié)果(表2)顯示，相對于其他組合來說，有網(wǎng)脈×有網(wǎng)脈組合(D組合)的結(jié)實率最高(97.37%)，無網(wǎng)脈×無網(wǎng)脈組合(C組合)的結(jié)實率僅次于D組合(84.78%)，有網(wǎng)脈和無網(wǎng)脈正反交組合(A、B組合)的結(jié)實率相對較低。而且，將所得的果實進行無菌播種后，仍是D組合的種子成活率最高(48.65%)，C組合的種子成活率次之(46.15%)，A、B組合的種子成活率相對來說較低。C、D雜交組合之間的結(jié)實率和種子成活率均相差不大，且均高于A、B組合。以上結(jié)果表明同一葉網(wǎng)脈類型的金線蓮進行雜交，相對不同種類葉網(wǎng)脈類型的金線蓮雜交來說，不僅其結(jié)實率明顯較高，而且其果實的可育性也較高；正反交組合相對比，A組合的結(jié)實率和種子成活率分別高于B組合約15%和10%，但總體上成功率相差不大。

表2 不同金線蓮雜交組合結(jié)實率和種子萌發(fā)率

2.3 不同金線蓮雜交組合后代葉網(wǎng)脈性狀分析

隨機選擇1000余株雜交幼苗，對其的葉片網(wǎng)脈性狀進行統(tǒng)計。由表3可知，A、B、C雜交組合后代中均出現(xiàn)有網(wǎng)脈和無網(wǎng)脈兩種脈型的幼苗，而D組合后代中只出現(xiàn)有網(wǎng)脈型的幼苗，可初步推斷有網(wǎng)脈為純合性狀，無網(wǎng)脈為雜合性狀。有網(wǎng)脈和無網(wǎng)脈正反交(A、B組)組合后代中有網(wǎng)脈∶無網(wǎng)脈比例分別為3.43∶1、2.5∶1，C組合無網(wǎng)脈自交后代中有網(wǎng)脈∶無網(wǎng)脈比例為2.7∶1，比例皆約等于3∶1，說明葉網(wǎng)脈性狀應(yīng)是屬于細(xì)胞核遺傳，由常染色體上的等位基因控制，至少是兩對等位基因控制。

表3 金線蓮雜交后代幼苗葉片網(wǎng)脈性狀統(tǒng)計

2.4 ISSR 和CDDP引物的篩選和雜交后代鑒定

分別用無網(wǎng)脈金線蓮和有網(wǎng)脈金線蓮及其雜交后代的基因組DNA為模板，對54條ISSR引物和21條CDDP引物進行篩選，選出擴增條帶較多且清晰、具有明顯特異性條帶的引物共10條(4條ISSR引物和6條CDDP引物)。對篩選出的10條引物設(shè)置梯度退火溫度進行PCR擴增，確定各引物的最佳退火溫度(表4)。

表4 ISSR和CDDP引物及擴增結(jié)果

利用篩選出的4條ISSR引物和6條CDDP引物對雜交親本無網(wǎng)脈、有網(wǎng)脈植株及雜交組合A后代中無網(wǎng)脈金線蓮和有網(wǎng)脈金線蓮植物基因組DNA進行PCR擴增。擴增結(jié)果(表4)顯示，10條引物共擴增345個條帶(位點)，平均每條引物擴增出34.5個條帶(位點);多態(tài)性位點共129個，平均每條引物擴增出12.9個多態(tài)性條帶(位點)，平均多態(tài)性位點百分率為39.5%。

從圖2可以看到，10條引物在不同擴增片段長度下出現(xiàn)了差異性片段(圖2方框)，均能有效區(qū)分親本無網(wǎng)脈金線蓮和有網(wǎng)脈金線蓮，表現(xiàn)為在同一位置大部分有網(wǎng)脈植株沒有擴增片段，而無網(wǎng)脈植株擴增出條帶；或一部分無網(wǎng)脈金線蓮和有網(wǎng)脈金線蓮擴增片段大小不同。10條引物中有2條(UBC866和WRKY-R3B)可同時用于鑒定雜交后代，主要表現(xiàn)為雜交組合A后代中有網(wǎng)脈植株擴增出父本無網(wǎng)脈的片段(圖2長方框)，經(jīng)過多次重復(fù)實驗證明擴增片段穩(wěn)定存在，可證明為雜交后代。

M.DL2000；W.無網(wǎng)脈金線蓮親本；Y.有網(wǎng)脈金線蓮親本；ZW.雜交組合A后代中的無網(wǎng)脈植株；ZY.雜交組合A后代中的有網(wǎng)脈植株。每4列為一組，1-4.UBC881；5-8.UBC835；9-12.UBC866；13-16.UBC873；17-20.CHI1；21-24.WRKY-F1；25-28.WRKY-R2；29-32.WRKY-R3B；33-36.ANS1；37-40.WRKY-R1。圖中長方框顯示可同時區(qū)分親本和鑒定親后代關(guān)系的差異性片段，短方框顯示只可區(qū)分親本的差異性片段圖2 ISSR和CDDP對金線蓮雜交組合A親本及雜交后代的鑒定M. DL2000; W. A. roxburghii without leaf veins; Y. A. roxburghii with leaf veins; ZW. A. roxburghii without leaf veins in combination A hybrid offspring; ZY. A. roxburghii with leaf veins in combination A hybrid offspring. 1-4. UBC881; 5-8. UBC835; 9-12. UBC866; 13-16. UBC873; 17-20.CHI1; 21-24. WRKY-F1; 25-28. WRKY-R2; 29-32. WRKY-R3B; 33-36. ANS1; 37-40. WRKY-R1. The long boxs in the figure are the differential segments that can distinguish the parents and the parent-child relationship at the same time, and the short boxs are the differential segments that can only distinguish the parentsFig.2 Identified the hybrid parents and hybrid combination of a progeny of A. roxburghii by ISSR and CDDP

2.5 金線蓮親本及其雜交后代遺傳多樣性分析

根據(jù)ISSR/CDDP-PCR擴增結(jié)果，雜交親本及其雜交后代的聚類分析結(jié)果(圖3)顯示：金線蓮親本及其雜交后代的遺傳距離在0.81～0.85之間；同時親本無網(wǎng)脈金線蓮與有網(wǎng)脈金線蓮的遺傳距離約為0.04，存在遺傳差異。

1.無網(wǎng)脈親本；2.有網(wǎng)脈親本；3.無網(wǎng)脈雜交后代；4.有網(wǎng)脈雜交后代圖3 金線蓮親本及其雜交后代的聚類結(jié)果1. Parent without leaf veins; 2. Parent with leaf veins; 3. Hybrid offspring without leaf veins; 4. Hybrid offspring with leaf veinsFig.3 Cluster diagram of parents and hybrid progeny of A. roxburghii

3 討 論

本研究以福建道地金線蓮種質(zhì)資源為親本進行雜交試驗。金線蓮雜交授粉過程結(jié)實率直接受花粉活力程度的影響，不同植物的柱頭可授期持續(xù)時間不同，花期長短、開花的天數(shù)和柱頭的分泌物都對柱頭的可授性有影響[18]。金線蓮花朵的柱頭在開花當(dāng)天就具有可授性[19]。邵清松等[20]研究稱人工異株異花授粉的結(jié)實率遠(yuǎn)高于人工自花授粉，結(jié)實率最高可達(dá)66.3%，并認(rèn)為在金線蓮花后第3天花粉對花后第4天柱頭人工異花授粉雜交，可顯著提高結(jié)實率。易彬[6]研究結(jié)果表明在金線蓮花后第1天對其進行人工異花授粉雜交結(jié)實率最高(83.61%)。本實驗選取金線蓮開花后第2天的花朵作為父本，開花后第3～4天的花朵作為母本，最高結(jié)實率可達(dá)97.37%，結(jié)果與邵清松研究結(jié)果較為接近。邵清松選用的親本是臺灣種金線蓮與福建武夷山種金線蓮，均在自然條件下開花后進行投粉，而易彬選用的是江西種金線蓮，是在溫室中于8～9月進行授粉，結(jié)實率不同也可能是由于授粉環(huán)境或供試金線蓮品種不同導(dǎo)致柱頭和花粉活性不同。本實驗中金線蓮正反交成功率相差不大，這與何荊洲等[21]的研究結(jié)果不一致，原因可能是何荊洲等選用的金線蓮品種差異較大，葉片性狀和花色均有差異，而本實驗中選用的親本同來源自福建武夷山地區(qū)，只有葉網(wǎng)脈性狀不同。

植物類黃酮是金線蓮的重要活性物質(zhì)，對人體來說也具有良好的抗氧化、抗病毒等生理活性，還有較強的細(xì)胞毒活性，其含量的多少直接影響著金線蓮的藥效，郭巧生等[22]研究認(rèn)為黃酮是金線蓮的主要活性成分。張勛等[23]對37批金線蓮樣品的測定結(jié)果表明，金線蓮總黃酮含量范圍為1.207～3.179 mg/g。朱美瑛[24]對福建、廣西和臺灣3個地區(qū)的金線蓮組培苗藥用含量進行了比較，結(jié)果顯示福建金線蓮總黃酮含量最高達(dá)到15.74 mg/g，遠(yuǎn)高于廣西和臺灣金線蓮，而其總多糖含量為67.45 mg/g，遠(yuǎn)低于廣西和臺灣地區(qū)的金線蓮。本實驗中金線蓮親本植株的類黃酮含量與朱美瑛結(jié)果相近，而多糖含量則低于其結(jié)果值，這可能是由于種植方式不同所致，但總體上福建道地金線蓮藥用成分含量較高。黃曉萱等[10]研究測定了尖葉、大圓葉、小圓葉 3 個不同品系金線蓮的金線蓮苷含量，3個品系均含有金線蓮苷成分，其金線蓮苷含量均值分別為 23.41%、 25.17%和 21.14%，不同品系間相差不大，這與本實驗結(jié)果一致。本實驗中有網(wǎng)脈金線蓮類黃酮和總多糖含量顯著高于無網(wǎng)脈金線蓮含量，而其金線蓮苷含量則略低于無網(wǎng)脈金線蓮，說明福建道地金線蓮不同品系間的藥用成分含量差異較大。

關(guān)于有網(wǎng)脈與無網(wǎng)脈金線蓮(“公”與“母”)是否為同一品種(系)植物，目前有較大爭議。鄭純等[25]認(rèn)為葉片網(wǎng)脈的明顯程度與不同生態(tài)環(huán)境的光合作用有關(guān)；王海閣[26]認(rèn)為目前金線蓮組培苗大多來源于野生，經(jīng)栽培后存在一定的遺傳分化；胡珊梅等[27]在對福建永安同一采集區(qū)的野生公、母金線蓮進行DNA指紋鑒定，發(fā)現(xiàn)兩者的指紋圖譜部分位點相同，但又有各自特征性位點，認(rèn)為其存在較大的遺傳基因變異，且建議分別獨立成種；謝卓宓等[28]在對不同金線蓮種質(zhì)資源樣品進行染色體核型分析時發(fā)現(xiàn)，同一地區(qū)的有線、無線種的SOD、POD、CAT活性和染色體的核型均存在差異。本實驗通過對同一地區(qū)來源的有網(wǎng)脈、無網(wǎng)脈植株進行藥用含量分析，發(fā)現(xiàn)兩種植株類黃酮、總多糖含量存在顯著差異；通過雜交發(fā)現(xiàn)有網(wǎng)脈為純合性狀，無網(wǎng)脈植株自交后代出現(xiàn)性狀分離。由于雜交后代中出現(xiàn)除有網(wǎng)脈和無網(wǎng)脈以外的中間脈型，但因其葉面性狀與無網(wǎng)脈植株極為相似，在統(tǒng)計后代葉網(wǎng)脈性狀時暫將其歸為無網(wǎng)脈植株。這也可能是雜交組合A、B、C中有網(wǎng)脈和無網(wǎng)脈植株比例近似3∶1的原因之一。但從遺傳上可以證明有網(wǎng)脈植株和無網(wǎng)脈植株存在遺傳差異，應(yīng)該屬于不同品種(系)，對于雜交后代中缺少橫脈這種中間脈型的成因還有待進一步研究。通過ISSR和CDDP分子標(biāo)記，可以有效區(qū)分有網(wǎng)脈和無網(wǎng)脈金線蓮。遺傳多樣性分析結(jié)果顯示親本間遺傳距離為0.04，說明無網(wǎng)脈金線蓮和有網(wǎng)脈金線蓮之間存在遺傳差異，但親緣關(guān)系較近。綜合以上結(jié)果推斷，來源于武夷山脈的有網(wǎng)脈金線蓮和無網(wǎng)脈金線蓮是不同品種(系)。

目前ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在鑒定金線蓮偽品及遺傳多樣性分析方面應(yīng)用較多。趙會賢等[29]利用ISSR技術(shù)對20份福建省內(nèi)不同地區(qū)金線蓮樣本進行篩選和擴增，并根據(jù)UPGMA聚類分析結(jié)果，在遺傳距離0.78時將20份金線蓮樣品分為3類，用以區(qū)分不同地區(qū)和品種。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可以在分子水平上很好地揭示福建省內(nèi)金線蓮的遺傳多樣性。但由于ISSR分子標(biāo)記大多為顯性標(biāo)記，在解決雜交系統(tǒng)、計算雜合度和父系分析等問題時效果不佳[30]。CDDP分子標(biāo)記作為新型分子標(biāo)記技術(shù)，在金線蓮種質(zhì)資源鑒定方面還未見報道。CDDP分子標(biāo)記法是基于單引物反應(yīng)，只對目標(biāo)基因的保守區(qū)域進行擴增，保守區(qū)域的序列變異往往較少，可能產(chǎn)生與植物農(nóng)藝性狀相關(guān)的標(biāo)記，因此在鑒定近緣種及雜交后代方面有較大優(yōu)勢[31]。本實驗從54條ISSR引物和21條CDDP引物中各篩選出1條可以用于鑒定雜交后代，說明CDDP用于雜交后代的鑒定效率更高。同時可以看出通過CDDP分子標(biāo)記對親本間保守功能區(qū)域序列的擴增，其多態(tài)性優(yōu)于ISSR分子標(biāo)記。目前分子標(biāo)記方法的聯(lián)合應(yīng)用，即用兩種或兩種以上分子標(biāo)記方法對植物遺傳特征進行分析研究，可以彌補不同分子標(biāo)記間的缺陷和不足，使分析結(jié)果更加全面、有效[32]。現(xiàn)階段關(guān)于ISSR、RAPD等標(biāo)記方法間的比較研究較多，但還未見CDDP標(biāo)記方法的對比研究。本實驗聯(lián)合應(yīng)用ISSR和CDDP兩種分子標(biāo)記區(qū)分有網(wǎng)脈和無網(wǎng)脈金線蓮并鑒定雜交后代關(guān)系，達(dá)到較好效果。