甘薯紫外光受體IbUVR8基因克隆及表達(dá)特性分析

李國(guó)良，林趙淼，張 鴻，許泳清，邱永祥，邱思鑫

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方薯類(lèi)觀測(cè)試驗(yàn)站，福州 350013)

光是影響植物生長(zhǎng)和發(fā)育最重要的環(huán)境因子之一，不僅可以為植物進(jìn)行光合作用提供輻射能量，而且可以作為信號(hào)分子調(diào)控其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[1]。位于紫外區(qū)的UV-B對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有雙重作用，高強(qiáng)度的UV-B對(duì)植物體產(chǎn)生損傷，影響植物正常的生理功能，是逆境因子；但低強(qiáng)度的UV-B可以調(diào)控植物光形態(tài)建成和生理反應(yīng)，是信號(hào)調(diào)控因子[2]。植物體內(nèi)含有多種可以感受光照并產(chǎn)生信號(hào)傳遞的光受體，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的植物光受體包括感受紅光和遠(yuǎn)紅光的光敏色素(phytochromes，phyA-E)、感受藍(lán)光/UV-A的隱花色素(cryptochromes，cry1和cry2)和向光色素(phototropins、phot1和phot2)[3-4]，以及感受中波紫外線(UV-B)的受體UVR8(UV RESISTANCE LOCUS8)[5]。自從擬南芥UVR8基因被第一個(gè)克隆鑒定以來(lái)，玉米[6]、番茄[7]、白樺樹(shù)[8]、胡楊[9]、蘋(píng)果[10]和紫花苜蓿[11]等越來(lái)越多植物的UVR8基因也被相繼克隆出來(lái)，并被證實(shí)與其體內(nèi)類(lèi)黃酮物質(zhì)的合成調(diào)控密切相關(guān)。

甘薯屬于旋花科番薯屬植物，是中國(guó)傳統(tǒng)的糧食經(jīng)濟(jì)作物[12]。葉菜型甘薯是指以幼嫩莖葉等作為食用部位的一種蔬菜專(zhuān)用型甘薯品種。研究表明，甘薯莖葉含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、氨基酸、維生素以及礦物質(zhì)等[13]。福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所于2016年育成了國(guó)內(nèi)第一個(gè)紫葉葉菜型甘薯品種‘福菜薯23號(hào)’，因其葉片含有大量花青苷類(lèi)物質(zhì)而呈紫色，是研究甘薯花青素形成機(jī)理的優(yōu)良材料。已有研究表明，紫外光UV-B對(duì)植物花青素的積累有促進(jìn)作用，植物通過(guò)UVR8接收到UV-B信號(hào)后，引起了體內(nèi)MYB、bHLH和WD40等3種轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)，從而激活花青素合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因，最終促進(jìn)花青素的合成[14-15]。目前，UV-B對(duì)甘薯葉片花青素合成是否具有相同的作用尚不清楚，本研究從‘福菜薯23號(hào)’中分離到IbUVR8的基因全長(zhǎng)序列，為深入研究IbUVR8在甘薯中的花青素合成調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育的葉菜型甘薯品種‘福菜薯23號(hào)’(紫葉)和‘福菜薯18號(hào)’(綠葉)、以及‘觀賞黃葉’(黃葉)3種不同葉色甘薯均種植于科研育種基地內(nèi)。為了研究3種葉色甘薯不同組織及脅迫處理后IbUVR8的表達(dá)，將生長(zhǎng)一致的3種葉色甘薯種植于培養(yǎng)盆中，放置在生長(zhǎng)室(28 ℃，70%濕度，14 h光照和10 h黑暗)中培養(yǎng)。

大腸桿菌E.coli JM109、TransStart Top Green qPCR SuperMix、RNA提取試劑、Trans 2K DNA Marker、pEASY-T1載體等購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司。PCR擴(kuò)增引物(表1)和DNA測(cè)序由上海生工生物科技有限公司完成。其他常規(guī)化學(xué)藥品及試劑，除特別說(shuō)明外，均購(gòu)自Sigma公司或國(guó)產(chǎn)AR級(jí)試劑。

表1 試驗(yàn)中所涉及到的引物及其核苷酸序列

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甘薯cDNA第一鏈的合成液氮研磨后, 參照TaKaRa RNAiso plus提取甘薯葉片的RNA。采用Thermo Fisher RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成甘薯cDNA第一鏈， 逆轉(zhuǎn)錄的程序?yàn)椋?2 ℃孵育60 min，72 ℃變性5 min， -20 ℃保存。

1.2.2IbUVR8保守序列的同源克隆根據(jù)NCBI公布的馬鈴薯UVR8序列，采用CODEHOP方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。以‘福菜薯23號(hào)’cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后再72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增得到DNA片段回收純化后，連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化鑒定后測(cè)序。

1.2.3IbUVR8 3′和5′端的擴(kuò)增根據(jù)已知UVR8基因片段和3′-RACE原理，以‘福菜薯23號(hào)’cDNA為模板進(jìn)行IbUVR8的3′端的擴(kuò)增，設(shè)計(jì)2條巢式引物UVR8-F2和UVR8-F3。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。取1 μL第一輪PCR產(chǎn)物作為第二輪PCR反應(yīng)的模板，以3′-F2和接頭為引物擴(kuò)增，將擴(kuò)增的DNA片段連接到T載體、轉(zhuǎn)化鑒定后測(cè)序。

按照5′-RACE原理，設(shè)計(jì)引物5′-oligo dG代替隨機(jī)引物，采用Thermo Fisher RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成甘薯cDNA第一鏈，逆轉(zhuǎn)錄的程序?yàn)椋?2 ℃孵育60 min， 72 ℃變性5 min，-20 ℃保存。

設(shè)計(jì)特異性引物5′-adapter和UVR8-R2，采用Touch down PCR：94 ℃變性30 s，72 ℃延伸3 min，共5個(gè)循環(huán)，94 ℃變性30 s，70 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共20個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增到的DNA片段連接到T載體、轉(zhuǎn)化鑒定后測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析基因序列的編碼區(qū)預(yù)測(cè)分析利用DNASTAR和NCBI的ORFfinder工具，同源性比較使用NCBI在線分析軟件Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)，多重序列比對(duì)使用DNAMAN軟件，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析利用在線分析軟件Protparam對(duì)IbUVR8蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析；ProtScale對(duì)IbUVR8蛋白進(jìn)行親水/疏水性分析；TMHMM 2.0進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析；COILS進(jìn)行卷曲螺旋預(yù)測(cè)和分析；SOPMA分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；SWISS-MODEL進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(https://www.expasy.org/)，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)使用Cluster X2和MEGA5.1軟件構(gòu)建。

1.2.5IbUVR8在不同組織的表達(dá)分別取生長(zhǎng)1周后3種甘薯的根、莖和葉片，將所有樣品在液氮中冷凍并保存在-80 ℃的冰箱中以備后用。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.6 非生物脅迫下IbUVR8的表達(dá)特性甘薯生長(zhǎng)1周后開(kāi)始進(jìn)行脅迫處理：1)向土壤中添加0.5 mol/L NaCl 進(jìn)行鹽脅迫；2)向土壤中添加20%PEG6000 進(jìn)行滲透脅迫；3)將植物移至溫度為6 ℃的生長(zhǎng)室中進(jìn)行低溫脅迫；4)向土壤中添加100 mg/L CuSO4進(jìn)行重金屬脅迫；5)土壤中添加100 mg/L GA3處理。每種脅迫分別處理0、4、8 h，所有樣品在液氮中冷凍并保存在-80 ℃的冰箱中備用。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.7IbUVR8原核表達(dá)將IbUVR8通過(guò)同源重組構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1上，并轉(zhuǎn)化表達(dá)大腸桿菌BL21。然后進(jìn)行IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度優(yōu)化，最終獲得IbUVR8蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 IbUVR8的全長(zhǎng)cDNA克隆及生物信息學(xué)分析

2.1.1IbUVR8理化性質(zhì)分析試驗(yàn)結(jié)果顯示，從‘福菜薯23號(hào)’得到了全長(zhǎng)為1 539 bp的cDNA片段，經(jīng)NCBI-Blast分析表明，該序列為甘薯UVR8基因cDNA序列，并命名為IbUVR8，NCBI登錄號(hào)KT749986。該基因ORF長(zhǎng)度為1 329 bp，共編碼了441個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為47 745.20 Da，理論等電點(diǎn)為5.72。

2.1.2 IbUVR8蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)疏水作用是維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最重要的作用力，對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定性和功能具有重要意義。如圖1所示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)IbUVR8蛋白有198個(gè)親水區(qū)域，67個(gè)疏水區(qū)域，蛋白平均疏水性為-0.362，為親水性蛋白。

圖1 IbUVR8親/疏水性分析Fig.1 IbUVR8 hydrophilicity and hydrophobicity analysis

利用TMHMM 2.0對(duì)IbUVR8蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)，如圖2所示，該蛋白在24～46aa位置有1個(gè)明顯的跨膜特征區(qū)域。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)指的是蛋白質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)中有規(guī)律重復(fù)的構(gòu)象，SOPMA分析IbUVR8二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、延伸帶和無(wú)規(guī)卷曲各占13.12%、28.96%和57.92%。

圖2 IbUVR8的跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Transmembrane domain analysis of IbUVR8

SWISS-MODEL預(yù)測(cè)IbUVR8的三級(jí)結(jié)構(gòu)為類(lèi)似擬南芥UVR8的結(jié)構(gòu)，均由7個(gè)片狀的β-螺旋縱向排列成環(huán)形結(jié)構(gòu)，中空形成流水通道(圖3)。WoLF PSORT預(yù)測(cè)IbUVR8亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核。

圖3 IbUVR8的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 The predicted tertiary structure of IbUVR8

2.2 IbUVR8的同源性及進(jìn)化分析

蛋白序列對(duì)比結(jié)果顯示，甘薯UVR8與番茄、馬鈴薯UVR8親緣關(guān)系較近，序列相似性在85%以上；與擬南芥、蕪菁等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可分為兩個(gè)大類(lèi)，序列相似性在70%以上，說(shuō)明UVR8的蛋白序列進(jìn)化相對(duì)保守(圖4、圖5)。

slUVR8. 番茄；stUVR8. 馬鈴薯；ibUVR8. 甘薯；bpUVR8. 白樺樹(shù)；atUVR8. 擬南芥；brUVR8. 蕪菁圖4 IbUVR8的聚類(lèi)分析slUVR8. Solanum lycopersicum； stUVR8. Solanum tuberosum； ibUVR8. Ipomoea batatas； bpUVR8. Betula platyphylla； atUVR8. Arabidopsis thaliana； brUVR8. Brassica rapaFig.4 Cluster analysis of IbUVR8

UVR8在植物體內(nèi)的進(jìn)化十分保守，不僅是被子植物，且苔蘚植物、石松植物和綠藻植物與擬南芥UVR8氨基酸序列相似性都較高，尤其是關(guān)鍵氨基酸的位置和數(shù)目，包括鹽橋網(wǎng)絡(luò)中的色氨酸和精氨酸[16]。擬南芥UVR8具有吸收UV-B的特性，這個(gè)功能主要由色氨酸殘基(W233和W285)完成，IbUVR8對(duì)應(yīng)的色氨酸殘基為W240和W292。擬南芥UVR8中的R286和R338的氫鍵作用對(duì)二聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定十分重要，IbUVR8對(duì)應(yīng)為R293和R350[17]。

2.3 IbUVR8組織器官表達(dá)特性

qRT-PCR 結(jié)果顯示，IbUVR8在3種葉色甘薯中的表達(dá)趨勢(shì)一致，葉片表達(dá)量最高，莖段次之，根部表達(dá)量最低，且不同組織間的表達(dá)量差異顯著，表明葉片是紫外光UV-B的主要響應(yīng)部位。不同品種在同一組織部位表達(dá)量也有差異，黃葉甘薯葉片IbUVR8表達(dá)量高于另外兩個(gè)品種，推測(cè)黃葉甘薯對(duì)紫外光UV-B比另外兩種甘薯更加敏感(圖6)。

小寫(xiě)字母表示同一品種不同組織間在0.05水平差異顯著，大寫(xiě)字母代表同一組織不同品種間在0.05水平差異顯著圖6 IbUVR8在3種甘薯不同組織中的表達(dá)Different normal letters indicate significant difference in different tissues for the same variety at 0.05 level; different capital letters indicate significant difference in the same tissue for different varieties at 0.05 levelFig.6 Expression of IbUVR8 in different tissues of three leaf-colored sweet potato varieties

2.4 IbUVR8在非生物脅迫下的表達(dá)特性

在不同脅迫處理下，IbUVR8的表達(dá)結(jié)果如圖7所示，低溫、干旱和鹽脅迫處理下，3種不同葉色甘薯的IbUVR8表現(xiàn)趨勢(shì)一致，均上調(diào)表達(dá)，但品種間在同一脅迫時(shí)間有顯著性差異，如‘福菜薯23號(hào)’在干旱脅迫8 h的IbUVR8表達(dá)量顯著高于其他兩個(gè)品種，‘福菜薯18號(hào)’在鹽脅迫8 hIbUVR8表達(dá)量顯著低于另外兩個(gè)甘薯品種。激素GA3處理下，在‘福菜薯18號(hào)’和‘觀賞黃葉’中IbUVR8表現(xiàn)為先上調(diào)后下降，‘福菜薯23號(hào)’表現(xiàn)為上調(diào)趨勢(shì)，脅迫8 hIbUVR8的表達(dá)量最大，且與另外兩種甘薯有顯著差異。在重金屬銅脅迫下，3種葉色甘薯IbUVR8表達(dá)差異較大，‘福菜薯18號(hào)’的IbUVR8表達(dá)緩慢上調(diào)，‘福菜薯23號(hào)’表現(xiàn)為先上調(diào)后下降，脅迫4 h表達(dá)量最大；‘觀賞黃葉’表現(xiàn)為脅迫8 hIbUVR8表達(dá)量迅速上升到最大值，造成3種葉色甘薯表達(dá)差異的可能是對(duì)銅鹽的敏感性不同所致。

小寫(xiě)字母表示同一品種不同脅迫時(shí)間在0.05水平差異顯著，大寫(xiě)字母代表同一脅迫時(shí)間不同品種間在0.05水平差異顯著圖7 IbUVR8在非生物脅迫下的表達(dá)Different normal letters indicate significant difference at different stress time points for the same variety at 0.05 level; different capital letters indicate significant difference at the same time point for different varieties at 0.05 levelFig.7 Expression of IbUVR8 under abiotic stress

2.5 IbUVR8原核表達(dá)

將IbUVR8構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1上，并轉(zhuǎn)化表達(dá)大腸桿菌BL21。經(jīng)過(guò)IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度優(yōu)化后，在0.5 μmol/L IPTG、16 ℃誘導(dǎo)14 h后，獲得IbUVR8-GST融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示GST蛋白為29 kD，IbUVR8-GST大小約為80 kD(圖8)。

M. Marker；1. BL21(pGEX-4T-1)誘導(dǎo)的GST蛋白；2. BL21(IbUVR8-pGEX-4T-1)未誘導(dǎo)蛋白；3. BL21(IbUVR8-pGEX-4T-1)誘導(dǎo)的IbUVR8-GST融合蛋白圖8 IbUVR8 SDS-PAGE電泳圖M. Marker; 1. BL21 (pGEX-4T-1)-induced GST protein; 2. BL21 (IbUVR8-pGEX-4T-1) uninduced protein; 3. BL21 (IbUVR8-pGEX-4T-1)-induced fusion proteinFig.8 IbUVR8 SDS-PAGE electropherogram

3 討 論

UV-B輻射調(diào)控植物形態(tài)發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)。UV-B信號(hào)通路分為特異性和非特異性兩類(lèi)，特異性信號(hào)通路與植物形態(tài)建成相關(guān)，而非特異性信號(hào)通路大多與脅迫信號(hào)相關(guān)[18]。UVR8是目前植物體內(nèi)唯一發(fā)現(xiàn)的一種特異性吸收UV-B的光受體，自然狀態(tài)下的UVR8為二聚體，在接收到UV-B信號(hào)后解聚成單體與COP1結(jié)合，并激活下游的bZIP轉(zhuǎn)錄因子HY5，誘導(dǎo)多個(gè)代謝通路基因的表達(dá)[5, 19-20]。擬南芥UVR8由440個(gè)氨基酸殘基組成，其中，W285和W233為UVR8蛋白的關(guān)鍵發(fā)色團(tuán)，R286和R338對(duì)維持UVR8的片層結(jié)構(gòu)穩(wěn)定十分重要[16]。甘薯UVR8則由441個(gè)氨基酸殘基組成，具有與擬南芥相同的色氨酸發(fā)色團(tuán)和片層結(jié)構(gòu)，表明UVR8功能氨基酸區(qū)域和蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)化保守。早期研究發(fā)現(xiàn)擬南芥突變體uvr8-1表現(xiàn)為對(duì)UV-B敏感，查爾酮合酶(CHS)表達(dá)量低于野生型，推測(cè)擬南芥UVR8調(diào)控花青素合成基因的表達(dá)[5]；通過(guò)基因芯片技術(shù)證實(shí)擬南芥成熟葉片多個(gè)類(lèi)黃酮合成途徑基因受到擬南芥UVR8的調(diào)控[21]；MYB13是近期發(fā)現(xiàn)的擬南芥UV-B信號(hào)通路另外一個(gè)正調(diào)控因子，UV-B信號(hào)誘導(dǎo)MYB13在子葉中特異地表達(dá)，并與UVR8形成復(fù)合體，促進(jìn)MYB13結(jié)合類(lèi)黃酮合成途徑基因如CHS、CHI和FLS的啟動(dòng)子[22]。擬南芥中的RUP1和RUP2是兩個(gè)負(fù)調(diào)控因子，通過(guò)與UVR8蛋白的C27片段結(jié)合來(lái)抑制UVR8復(fù)合體的形成，并促進(jìn)UVR8恢復(fù)成二聚體，影響其下游調(diào)控基因[23]。因此，推測(cè)IbUVR8可能通過(guò)多個(gè)路徑影響體內(nèi)類(lèi)黃酮合成基因的表達(dá)，但是否與擬南芥通過(guò)相同的調(diào)控路徑則需要進(jìn)一步研究。

研究證實(shí)UV-B脅迫與其他非生物脅迫因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在交互作用[24]。植物中非特異性UVR8信號(hào)途徑能夠與ABA途徑聯(lián)合作用來(lái)增強(qiáng)植物的抗旱性和抗高劑量UV-B輻射[25]。UV-B通過(guò)UVR8信號(hào)通路有效抑制高溫誘導(dǎo)的植物熱形態(tài)發(fā)生[26]。脫落酸(abscisic acid, ABA)和NaCl處理影響了白樺BpUVR8啟動(dòng)子的活性，導(dǎo)致BpUVR8表達(dá)量快速上升[8]。UV-B、鎘、低溫和鹽脅迫均誘導(dǎo)了蘿卜芽RsUVR8表達(dá)量升高，外源添加H2O2和硝普鈉(NO供體)也能誘導(dǎo)RsUVR8表達(dá)升高，這種反應(yīng)被H2O2清除劑和NO清除劑抑制[27]。本研究表明，IbUVR8表達(dá)具有組織特異性，在葉片中的表達(dá)量最高，葉片是UV-B信號(hào)直接接收部位。IbUVR8也受到低溫、干旱和鹽脅迫等的表達(dá)，呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；在GA3和Cu2+的脅迫下，但由于品種的耐性差異，導(dǎo)致不同品種IbUVR8表達(dá)趨勢(shì)有所差異，研究表明UV-B可以通過(guò)改變赤霉素信號(hào)來(lái)影響擬南芥的根生長(zhǎng)[28]，外源施加赤霉素是否影響植物體內(nèi)UVR8響應(yīng)UV-B信號(hào)通路則需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究從甘薯中克隆獲得了IbUVR8基因序列，并進(jìn)行了逆境脅迫應(yīng)答分析和原核蛋白表達(dá)，研究結(jié)果為深入研究IbUVR8基因的功能及利用IbUVR8進(jìn)行甘薯葉花青素合成調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。