外周血中淋巴細胞亞群表達水平對診斷骨關節(jié)炎的臨床應用價值

陳 凱，朱玲玲,肖韓艷,龐麗瑩,李夢雨,關會林，金 紅

(1.牡丹江醫(yī)學院；2.牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院,黑龍江 牡丹江 157011)

OA是骨退行性疾病之一?；颊叱０橛袎和础?僵硬、步行障礙等癥狀，嚴重影響人們的生活質量,國內外調査發(fā)現OA好發(fā)于60～79歲的女性人群 中[1-2]。OA主要累及關節(jié)軟骨，在多因素的作用下導致關節(jié)軟骨破壞。有研究表明，導致骨關節(jié)炎的 發(fā)生免疫因素起到了很大的作用[3]。在OA滑膜組 織中存在巨噬細胞、T淋巴細胞(CD3+)、B淋巴細 胞(CD3+、CD19+即 CD19+細胞)、NK 細胞(CD3+、 CD56+即CD56+細胞)等免疫細胞。T淋巴細胞包 括輔助/誘導T淋巴細胞(CD3+、CD4+,即CD4+細 胞)、抑制/細胞毒T淋巴細胞(CD3+、CD8+,即 CD8+細胞)，這些細胞在機體適應性免疫環(huán)節(jié)中發(fā) 揮重要作用。淋巴細胞亞群包括CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD56+。在疾病微環(huán)境狀態(tài)改變下， 被激活的淋巴細胞產生大量細胞因子和炎癥介 質[4]。目前，國內外對淋巴細胞亞群在OA患者外 周血中表達水平少見報道。本研究旨在探討淋巴細 胞亞群在OA患者外周血中的水平變化，從而探討 其是否可作為OA的診斷指標。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集于2020年12月至2021年10月 期間經牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院診斷為骨關節(jié)炎 并且符合入選標準的30例患者作為實驗組,同時選 取同期30例健康體檢者作為對照組。

實驗組的納入標準:診斷標準符合2018版中華 醫(yī)學會頒布的《骨關節(jié)炎診療指南》；(2)年齡40～ 80歲。實驗組排除標準：(1)排除患有類風濕關節(jié) 炎(RA)、具有其他骨關節(jié)系統疾病病史的患者和近 期曾接受臨床過治療的患者；(2)存在影響流式細 胞儀計數的炎癥性疾病;(3)長期服用激素類藥物 的患者、糖尿病和患有腫瘤疾病患者；(4)血沉、類 風濕因子以及抗O升高患者；(5)使用過免疫抑制 劑及生物抑制劑的患者。

本研究通過了牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院倫理 委員會批準審查，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 采用美國貝克曼庫爾特流式 細胞儀FC 500,試劑采用美國貝克曼庫爾特流式細 胞儀的配套試劑，檢測淋巴細胞亞群表達水平。采 用德國西門子BNII全自動蛋白分析儀，試劑采用全自動蛋白分析儀的配套試劑，檢測類風濕因子(rheumatoid fator,RF)、C反應蛋白(c-reactive protein,CRP)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(anti cyclic citrullinated peptide antibody,CCP)的表達水平。

1.2.2 收集血液樣本 在空腹狀態(tài)下采集患者靜脈血液5 mL至含有乙二胺四乙酸(EDTA-K2)抗凝劑的真空采血管中，用于檢測淋巴細胞亞群表達水平。同時收集患者靜脈血液3～5 mL至含有惰性分離膠、促凝劑的真空采血管中，充分混勻后,1 000×g離心10 min,收集上層血清置于-80 ℃冰箱凍存待檢，用于檢測RF、CRP、CCP的表達水平。

1.2.3 全血中淋巴細胞亞群測定 取流式管，編號為Tn(CD3+、CD4+、CD8+)、Bn(CD19+、CD56+)。在T管和B管中分別加入相應的熒光標記的抗體。每管加50 μL EDTA-K2抗凝全血，將試管在旋渦混合器上混勻10～20 s,室溫避光靜止25 min。每管加 裂紅素250 μL,混勻，室溫避光靜止20 min。每管加入2 mL PBS,混勻，1 500×g離心5 min。留下細胞沉淀,棄去上清，每管加入250 μL PBS混勻,上流式細胞儀檢測。

1.2.4 血清中RF、CRP、CCP測定 將在-80 ℃冰箱凍存待檢的血清放置于室溫完全融化，上BNII全自動蛋白分析儀檢測。

1.3 統計學方法采用SPSS 16.0分析并生成受試 者工作特征曲線(ROC曲線)，計量資料以“均數±標準差”表示;兩組間比較采用兩個獨立樣本t檢驗;采用ROC曲線分析診斷效能，以約登指數最大值確定最佳診斷界限值；以P<0.05,差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗組與對照組的基本資料本研究的實驗組與對照組性別、年齡均無明顯差異(均P>0.05)。實驗組血清中CCP表達水平高于對照組(均P<0.05)。RF、CRP在實驗組與對照組之間無統計學意義(均P>0.05),見表1。

2.2 全血中淋巴細胞亞群的表達水平在實驗組全血中CD4+表達水平遠低于對照組(P<0.05),而CD8+表達水平遠高于對照組(P<0.05)。CD3+、CD56+及CD19+在實驗組與對照組之間均無統計學意義(均P>0.05)，見表2。

表2 實驗組與對照組淋巴細胞亞群表達情況

2.3 CD4+與CD8+對OA的診斷價值根據CD4+與CD8+在實驗組與對照組的表達水平分別做ROC曲線,并通過Logistic建立CD4+、CD8+聯合診斷模型并繪制ROC曲線。發(fā)現CD4+、CD8+聯合診斷OA的AUC以及特異度要高于兩種指標單獨檢測。但CD8+單獨檢測的靈敏度要高于其聯合檢測。見表3,圖1。

表3 CD4+、CD8+單獨檢測及聯合檢測的診斷效能

圖1 CD4+、CD8+單獨檢測及聯合檢測的ROC曲線

3 討論

OA主要以進行性疼痛、行走困難為特征，最終導致關節(jié)變形[5-6]。盡管人們對OA的認識越來越深入，但發(fā)病機制仍不清楚。CRP是一種非糖基化蛋白，可評估機體炎癥反應強度的指標[7]。Y-VONNE C.LEE等人[8]，在對OA患者的基線指標進行分析時發(fā)現,OA患者的CRP要高于對照組的表達水平(P<0.05)并有研究發(fā)現，其表達水平與Kellgren & Lawrence分級有關,KL3級和KL4級的患者CRP的表達水平要明顯高于KL2級的患者[9]。但在本研究中，得出CRP在實驗組與對照組之間無差異(P>0.05)的結論,這可能是患者自身未出現滑膜炎癥或者標本量不足所導致。值得思考是,CCP是診斷類風濕關節(jié)炎較特異的一項指標,Dres Damgaard等人[10]，在一項研究中證明CCP在類風濕關節(jié)炎組表達水平要高于骨關節(jié)炎組且差異有統計學意義(P<0.05)。但在國內外未見文獻報道CCP在OA與健康成人組是否有差異。本研究 中發(fā)現,CCP在OA與健康成人組表達水平有統計學意義(P<0.05)，但OA組的CCP的數值都在參考值范圍之內。CCP能否做為OA的一個潛在的風險因素，還需要今后更加深入的研究。

研究表明，OA的發(fā)生發(fā)展與慢性炎癥的持續(xù) 性刺激有關[11]。在OA的發(fā)病機制中激活免疫反 應的誘發(fā)因素包括炎癥與創(chuàng)傷之間的相互作用[12]。 淋巴細胞屬于免疫細胞,參與機體的免疫反應，它包 括T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞。T淋巴細胞 占淋巴細胞的大多數，主要分為兩個亞群:輔助/誘 導T淋巴細胞(CD3+CD4+,即CD4+細胞)、抑制/細 胞毒T淋巴細胞(CD3+CD8+,即CD8+細胞)。CD4+細胞在免疫反應中起核心作用,又分為五個主要細 胞亞群:Th1、Th2、Th17、Treg 和 Tfh。Th1 可以表達 CXCR3,它在Th1細胞向炎癥部位遷移過程中起重 要作用。CD4+細胞還能在接受病原體刺激后分化 出效應細胞，效應細胞會分泌出干擾素、白介素等細 胞因子和其他免疫調節(jié)因子，從而參與機體的炎癥 反應，因此CD4+細胞對人體的免疫功能有非常重要 的作用。CD8+細胞是一種監(jiān)控并在需要時殺死靶 細胞的細胞,一旦發(fā)現帶有特異性抗原的靶細胞,會 刺激效應細胞產生細胞毒作用去消滅被感染的細胞 或癌細胞。Jeng-Long Hsieh等[13]，發(fā)現 CD8+細胞在小鼠滑膜液中持續(xù)增殖。并通過實驗證實， CD8+細胞在自身免疫性疾病發(fā)揮其重要作用,該細 胞的活化、分化和發(fā)育可受到多種炎性細胞因子、轉 錄因子和趨化因子的影響[14]。在一項研究中，終末 期OA患者的滑液和外周血中CD4+細胞對激活Th1 細胞的極化增加并促進了細胞因子的分泌導致疾病加重，最終使疾病進程永久化[15]。不同的是，在本 研究有30例OA的患者入組,在實驗組與對照組相 比CD4+細胞明顯降低,CD8+細胞明顯升高，差異均 有統計學意義。這可能是機體的免疫調節(jié)機制發(fā)揮 作用，對機體產生了積極的作用，有利于機體的修 復。在本研究中,CD19+、CD56+這兩個指標實驗組 與對照組之間并未有統計學意義，這也有可能受到 標本量的局限所導致。也有可能該患者未處于疾病 的一個急性期所導致相應指標并未升高,這需要今 后擴大樣本量以及將處于不同時期的患者進行分組 比較加以證實。CD4+、CD8+實驗組與對照組之間是 有統計學意義的(P<0.05),并且通過Logistic建立 CD4+、CD8+聯合檢測OA的模型發(fā)現，聯合檢測比 單獨檢測OA的曲線下面積要大。同時也發(fā)現 CD8+單獨檢測的靈敏度要高于其聯合檢測的靈敏 度，但在檢測結果中一項指標的靈敏度過高的話，其 發(fā)生假陽性的幾率也會增加。

綜上所述,OA的發(fā)病機制與免疫反應有著廣 泛的聯系，淋巴細胞亞群可以反應機體免疫功能。 CD4+、CD8+聯合檢測是診斷OA的較好的方法。同 時CD4+、CD8+的表達水平可作為觀察OA的治療、 療效監(jiān)測的一個重要指標,為明確OA的發(fā)病機制 提供新思路。