利用生物信息學(xué)分析剪切因子QKI在胃腺癌中的表達(dá)及意義

宋哲瑤,王星云,何子康,王 歡,沈 平,崔榮軍

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；2.牡丹江心血管病醫(yī)院檢驗(yàn)科,黑龍江 牡丹江 157011)

胃癌(Gastric cancer,GC)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤 之一。目前,全球癌癥發(fā)病率中胃癌占5.6%；在惡 性腫瘤中排名第五位；胃癌死亡率占惡性腫瘤死亡 率的7.7%,排名第四位[1]。胃腺癌(Stomach adeno-carcinomam,STAD)是胃癌中最常見(jiàn)的一種類型,其 生長(zhǎng)迅速,侵襲性強(qiáng)[2],早期癥狀不明顯。深入探 討其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,尋找更為有效的治療靶 點(diǎn)具有重要的臨床意義。

可變剪切(Alternative splicingm,AS)又稱選擇 性剪切,指RNA前體通過(guò)選擇不同的位點(diǎn)剪切、組 合產(chǎn)生不同的RNA變異體的過(guò)程,是真核生物增加 蛋白質(zhì)組多樣性和細(xì)胞復(fù)雜性的機(jī)制之一。有研究 表明,可變剪切與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),錯(cuò)誤的 剪切方式是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的原因之一[3]。根據(jù)拼 接模式,可變剪切分為7種類型,包括可變受體位點(diǎn)(Alternate Acceptor sitem,AA)、可變供體位點(diǎn)(Alternate Donor sitem,AD)、可變啟動(dòng)子(Alternate Promoterm,AP)、可變終止子(Alternate Terminatorm,AT)、外顯子跳躍(Exon Skip,ES)、外顯子互斥(Mutually Exclusive Exons,ME)和保留內(nèi)含子(Retained Intron,RI)。剪切因子即參與mRNA前體剪切過(guò)程 的蛋白質(zhì)因子,在可變剪切過(guò)程中,RNA剪接因子 可以充當(dāng)原癌基因和腫瘤抑制基因,它的失調(diào)在腫 瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用,異常表達(dá) 可能會(huì)引起特定促癌剪切異構(gòu)體的形成,從而導(dǎo)致 癌癥的發(fā)生[4]。

在本研究中,我們結(jié)合胃腺癌大數(shù)據(jù),利用生物 信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行表達(dá)譜差異分析、生存預(yù)后分析、可 變剪切網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析等,篩選了胃 腺癌中與預(yù)后相關(guān)的SF,探討其表達(dá)與臨床信息間 的相關(guān)性和可能的作用機(jī)制,為胃腺癌預(yù)后和治療 靶點(diǎn)的選擇提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料從癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//portal.gdc.cancer.gov)下載RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù),共407例,其中胃腺癌375例,癌旁組織32例；從TCGA SpliceSeq數(shù)據(jù)庫(kù)(https://bioinformatics.mdanderson.org/TCGASpliceSeq/)下載胃腺癌可變剪切數(shù)據(jù);從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲取GSE118916數(shù)據(jù)集,共30例,包括腫瘤組織15例,癌旁組織15例。

1.2 方法

1.2.1 胃腺癌中可變剪切調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 為了評(píng)估可變剪切事件在胃腺癌中的整體情況,利用R語(yǔ)言對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中胃腺癌樣本可變剪切數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,利用imputeR包對(duì)胃腺癌AS事件的NA值補(bǔ)缺并過(guò)濾掉胃腺癌樣本中沒(méi)有波動(dòng)的AS事件。排除胃腺癌其他致死因素(如意外死亡等因素),僅納入總生存期>90天的患者。采用單因素Cox回歸分析篩選與胃腺癌患者生存相關(guān)的可變剪切事件P<0.05。根據(jù)胃腺癌RNA-seq數(shù)據(jù)提取SF的表達(dá)量,分析AS與SF在胃腺癌樣本中的關(guān)系,選取符合|cor|>0.6,P<0.01條件者構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò),Cyto-scape 3.9.0軟件進(jìn)行可視化。

1.2.2 剪切因子的預(yù)后分析 探討AS-SF調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中特異性剪切因子與胃腺癌預(yù)后的相關(guān)性,基于TCGA胃腺癌組織和癌旁組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),并綜合GTEx正常胃組織測(cè)序數(shù)據(jù),利用GEPIA 2.0在線工具分析AS-SF網(wǎng)絡(luò)中特異性剪切因子在胃腺癌中的表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響,并可視化繪制生存曲線。

1.2.3 基于TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析特異基因在胃腺癌中的表達(dá) 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)RNA-seq數(shù)據(jù),提取375例胃腺癌樣本和32例癌旁樣本表達(dá)譜數(shù)據(jù),利用GEPIA 2.0在線工具分析基因表達(dá)差異；基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)GSE118916數(shù)據(jù)集測(cè)序數(shù)據(jù)(胃腺癌樣本15例,癌旁樣本15例),使用Sangerbox(http：//sangerbox.com/)分析工具進(jìn)行特定基因差異分析。

1.2.4 功能注釋及臨床相關(guān)性分析 為了進(jìn)一步明確QKI在胃腺癌中的功能和參與的相關(guān)代謝通路,利用GEPIA 2.0(http://gepia2.cancer-pku.cn/)的"similar genes detection”功能獲取胃腺癌組織中與QKI表達(dá)相關(guān)的前100個(gè)基因,進(jìn)行基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析;基于TCGA-STAD的RNA-seq數(shù)據(jù),進(jìn)一步分析QKI表達(dá)與胃腺癌樣本臨床特征間的關(guān)系,按照特異基因表達(dá)值的中位數(shù)分為高、低表達(dá)兩組,進(jìn)行臨床相關(guān)性分析。

1.2.5 特異性基因表達(dá)與免疫浸潤(rùn)相關(guān)性的分析 評(píng)估QKI的表達(dá)和拷貝數(shù)變異對(duì)胃腺癌免疫微環(huán)境的影響,使用TIMER(http://timer.cistrome.org/)在線工具分析QKI表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相關(guān)性,相關(guān)免疫細(xì)胞包括B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用R 3.6.3軟件 以及Strawberry Perl軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。 應(yīng)用非參秩檢驗(yàn)(Wilcox Test)分析QKI在胃腺癌組 織與正常組織之間的表達(dá)差異,采用logFC和P值 作為篩選條件;應(yīng)用Kaplan-Meier分析QKI高低表 達(dá)組之間生存率的差異;用Kruskal(KS)檢驗(yàn)分析 QKI表達(dá)與腫瘤分期,組織學(xué)分級(jí)和腫瘤大小及年 齡之間的關(guān)系。P<0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃凜癌中可變芽切事件分析分析結(jié)果顯示胃腺癌中共有可變剪切事件9 926例。單因素Cox回歸分析后,得到與胃腺癌患者生存相關(guān)的可變剪切事件412例(P<0.05),其中包括AA 31例、AD 41 例、AP 101 例、AT 53 例、ES 164 例、ME 3 例、RI 19 例。構(gòu)建的AS-SF調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯示,剪切因子QKI、 CELF2、SNRPN、BAG2在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中與多種可變剪 切事件相關(guān)(圖1)。例如QKI對(duì)KIF1B-602-AT起 負(fù)調(diào)控作用,對(duì) KIFlB-601-AT、CLSTNl-575-ES、 ARHGEF11 - 8338 -ES、PLEKHM2 - 767 -ES 起正向 調(diào)控作用。結(jié)果表明,在胃腺癌中存在與患者預(yù)后 相關(guān)的可變剪切事件,調(diào)控這些剪切事件的相關(guān)剪 切因子可能對(duì)胃腺癌的發(fā)生和發(fā)展有一定的作用。

圖1 胃腺癌中預(yù)后相關(guān)可變剪切事件的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.2 貫切因子的表達(dá)在胃徐癌中的預(yù)后分析GE- PIA線上工具繪制剪切因子QKI,CELF2,SNRPN,BAG2的生存分析曲線,結(jié)果顯示剪切因子QKI的生 存曲線具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),QKI高表達(dá)組的總生存率明顯低于低表達(dá)組(P<0.05)(圖2A),而其他三個(gè)剪切因子CELF2、SNRPN、BAG2對(duì)胃腺癌患者的生存預(yù)后沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B～2D)。結(jié)果表明,QKI是胃腺癌可變剪切事件中起關(guān)鍵性作用的剪切因子,其表達(dá)改變能夠影響胃腺癌患者的預(yù)后。

圖2 胃腺癌中特異性基因的表達(dá)水平與生存之間的關(guān)系

2.3 QKI在胃腺癌中的表達(dá)GEPAI和Sangerbox在線工具基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(GSE118916數(shù)據(jù)集)比較了QKI在胃腺癌與癌旁組織中的表達(dá),結(jié)果顯示無(wú)論在非配對(duì)的TCGA樣本中,還是配對(duì)的GSE118916數(shù)據(jù)集中,QKI在胃腺癌組織均呈高表達(dá)(圖3A～3B)。結(jié)果表明,QKI在胃腺癌中可能伴隨腫瘤的發(fā)生其表達(dá)增加或者發(fā)揮促癌基因的作用。

圖3 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)GSE118916分析QKI在胃腺癌中的表達(dá)

2.4 QKI的功能富集分析和Pathway分析利用GEPIA在線工具獲得QKI相關(guān)100個(gè)基因,進(jìn)行功能分析和KEGG分析。GO分析結(jié)果顯示,其主要與跨膜受體蛋白激酶活性和生長(zhǎng)因子等分子功能(MF)相關(guān);與細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)黏著連接、微絨毛、粘著斑等細(xì)胞組分(CC)有關(guān);參與神經(jīng)嶠細(xì)胞發(fā)育、間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)育等生物過(guò)程(BP)(圖4A)。KEGG分析結(jié)果顯示,QKI及相關(guān)基因主要富集在細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老等信號(hào)通路(圖4B)。表明QKI可能與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān),參與胃腺癌中的可變剪切過(guò)程。

圖4 QKI的GO分析和KEGG分析

2.5 差異表達(dá)QKI在胃廠癌中的臨床意義基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中STAD的RNA-Seq數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù),根據(jù)QKI的表達(dá)量中位數(shù),將375例胃腺癌樣 本分為QKI高表達(dá)組和QKI低表達(dá)組,比較2組間 胃腺癌樣本不同臨床特征的差異。結(jié)果顯示胃腺癌 的T分期在兩組間有顯著差異(P<0.05),其他臨床 特征兩組間無(wú)顯著差異(P>0.05)(表1)。結(jié)果表 明,QKI的表達(dá)會(huì)影響胃腺癌的T分期,在胃腺癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中有一定的作用。

表1 差異表達(dá)QKI與胃腺癌臨床特征的關(guān)系

2.6 QKI的表達(dá)對(duì)胃腺癌免疫很環(huán)境的影響TIMER在線工具分析結(jié)果顯示,QKI的表達(dá)與胃腺 癌的腫瘤純度呈負(fù)相關(guān),而與CD8+T細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞的浸潤(rùn)呈正 相關(guān)(圖5A)。QKI的拷貝數(shù)變異影響了免疫細(xì)胞 的浸潤(rùn),例如,臂級(jí)增益(Arm-level Gain)和高度擴(kuò) 增(High Amplication)兩種拷貝數(shù)變異方式顯著降 低了 CD8+T細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞的浸潤(rùn)(圖5B)。而巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞的高浸潤(rùn)預(yù)示胃腺 癌的不良預(yù)后(圖5C)。結(jié)果表明QKI的表達(dá)和拷 貝數(shù)變異能夠影響胃腺癌患者的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的改 變,進(jìn)而影響胃腺癌患者的生存。

圖5 使用TIMER在線工具分析胃腺癌中QKI的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性

3 討論

研究發(fā)現(xiàn),異常的AS事件和相關(guān)SF被證明在 探索癌癥生物學(xué)機(jī)制方面有著巨大的潛在價(jià)值,它 們的功能被證明與產(chǎn)生不同的細(xì)胞增殖、抗凋亡和 轉(zhuǎn)移相關(guān)的腫瘤亞型有關(guān)[5-6],因此,研究胃腺癌中 的AS事件具有十分重要的臨床意義。Montes等人 證明選擇性剪接產(chǎn)生的蛋白多樣性及其高度動(dòng)態(tài)的 調(diào)控,在腫瘤細(xì)胞的表型可塑性中發(fā)揮著重要作 用[7]。Kim等人總結(jié)了胃腸道惡性腫瘤中的異常剪 接事件和變異表達(dá),并分析了可變剪切事件在正常 組織和惡性組織中的意義[8]。

RNA結(jié)合蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活RNA(Signal transduction and activation of RNA,STAR)家族的成 員之一 QKI,作為RNA結(jié)合蛋白,通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié) 目的mRNA的剪切、定位、穩(wěn)定性和翻譯效率來(lái)調(diào) 節(jié)細(xì)胞的生理和病理過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn),QKI在腫瘤 組織中的表達(dá)異常[9]。

在本研究中,我們首先構(gòu)建了胃腺癌中AS-SF 調(diào)控網(wǎng)絡(luò),從網(wǎng)絡(luò)中得到與胃腺癌中可變剪切事件 相關(guān)的剪切因子,進(jìn)一步篩選出有預(yù)后價(jià)值的剪切 因子QKI。接著使用不同的數(shù)據(jù)庫(kù)論證了 QKI在胃腺癌組織中的表達(dá)及其預(yù)后價(jià)值,發(fā)現(xiàn)QKI在胃腺癌的組織中表達(dá)上調(diào)且與胃腺癌患者不良預(yù)后相關(guān)。GO富集分析結(jié)果顯示,主要涉及生長(zhǎng)因子、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)黏著連接、間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)育等基因功能;KEGG富集分析結(jié)果顯示其主要富集在細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老等通路。QKI的表達(dá)與腫瘤純度和多種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)顯著相關(guān),QKI的拷貝數(shù)變異能夠引起免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的改變。而巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞的高浸潤(rùn)預(yù)示胃腺癌的不良預(yù)后。

QKI是發(fā)育和病理過(guò)程中細(xì)胞分化的有效調(diào)節(jié)器。QKI蛋白可通過(guò)選擇性剪接、細(xì)胞周期調(diào)控、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等機(jī)制參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)QKI可以調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞,血管,肌肉,單核細(xì)胞的細(xì)胞分化,包括調(diào)節(jié)可變剪切、RNA穩(wěn)定性和基因轉(zhuǎn)錄等[10]。此外,QKI在癌癥進(jìn)展過(guò)程中也發(fā)揮著多種作用,影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)和相關(guān)的選擇性剪接模式[11]。一些研究表明QKI在單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化和成熟中起作用,在巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞中,QKI可以抑制巨噬細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子集落刺激因子1受體酪氨酸激酶mRNA。此外,QKI的功能也與成熟巨噬細(xì)胞有關(guān)[12]。

綜上所述,本研究通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)分析驗(yàn)證了剪切因子QKI在胃腺癌中高表達(dá),并且QKI的表達(dá)與胃腺癌患者的生存預(yù)后顯著相關(guān)。QKI表達(dá)與免疫微環(huán)境具有相關(guān)性,能夠通過(guò)表達(dá)改變和拷貝數(shù)變異影響胃腺癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn),進(jìn)而影響患者的生存。本研究為證明QKI作為胃腺癌患者預(yù)后評(píng)估及免疫治療標(biāo)志物的可能性提供了理論依據(jù),有待進(jìn)一步在臨床試驗(yàn)中深入研究。