羥基紅花黃色素A抗氧化作用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

陸 萌，石學(xué)魁，王 妍

(牡丹江醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

氧化應(yīng)激是由于機(jī)體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生過多，導(dǎo)致氧化物質(zhì)與清除氧自由基的抗氧化物質(zhì)失衡，氧自由基和相關(guān)代謝產(chǎn)物過量聚集，進(jìn)而引起組織細(xì)胞氧化損傷甚至死亡，是導(dǎo)致心血管疾病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病等的主要原因之一[1-2]。增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力可有效提高機(jī)體抗病能力，具有多重保健作用[3]。

羥基紅花黃色素A (hydroxysafflor yellow A， HSYA)是從中藥紅花中分離獲得的含量較高的最主要活性成分，可清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化等，具有抗炎抗氧化作用。研究發(fā)現(xiàn)，HSYA可以提高神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量、增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、減少細(xì)胞色素C氧化酶(cytochrome C，CytC)的釋放、降低丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量，從而拮抗谷氨酸介導(dǎo)的氧化性神經(jīng)毒性[4]。然而，鑒于中藥成分復(fù)雜，雖然目前HSYA抗氧化較明確，但其作用機(jī)制研究并不透徹。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以通過構(gòu)建 “疾病-藥物 ”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，不局限于單一的成分、靶點(diǎn)和疾病，來闡明中藥 “多組分-多靶點(diǎn)-多通路 ”的特點(diǎn)[5-6]。因此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，深入探討HSYA抗氧化的成分-多靶點(diǎn)-多途徑整體調(diào)節(jié)的作用機(jī)制，為后續(xù)基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 HSYA相關(guān)作用靶點(diǎn)的獲取通過 PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[7]檢索HSYA 的 2D 結(jié)構(gòu)，保存為SDF格式文件；將SDF文件上傳至 SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/)[8]，獲得HSYA相應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 抗氧化作用相關(guān)靶點(diǎn)的獲取通過GeneCards人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/.Version 5.0)[9]、Online Mendelian Inheritance in Man 在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM，https://omim.org/，Updated September 13.2021)[10]，以“anti-oxidation”“anti oxidation”為關(guān)鍵詞，檢索與抗氧化作用相關(guān)的潛在靶點(diǎn)。

1.3 HSYA抗氧化作用靶點(diǎn)的篩選把檢索到的HSYA潛在作用靶點(diǎn)與抗氧化作用相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入在線平臺(tái)Version 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)[11]，兩個(gè)靶點(diǎn)集合取交集得到兩者間共同靶點(diǎn)，即為HSYA抗氧化作用的候選靶點(diǎn)，

1.4 HSYA抗氧化作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將HSYA與抗氧化靶點(diǎn)信息導(dǎo)入 Cytoscape 3.8.0 軟件，構(gòu)建HSYA-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析將HSYA 抗氧化作用靶點(diǎn)信息導(dǎo)入 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org/，Version 11.0)，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)[12]，選擇“Multiple protein”，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。下載靶點(diǎn)相互作用關(guān)系TSV文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件，利用該軟件中插件Network Analyzer 對(duì)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)進(jìn)行分析。

1.6 靶點(diǎn)GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析將篩選出的 HSYA 抗氧化作用靶點(diǎn)輸入 R軟件(version 3.6.1)，利用 R 軟件的clusterProfiler包[13]進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，設(shè)置pvaluecutoff=0.05，qvaluecutoff=0.05。

1.7 “HSYA化合物-靶點(diǎn)-通路 ”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建 HSYA 化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，節(jié)點(diǎn)代表HSYA、作用靶點(diǎn)或富集的信號(hào)通路，邊代表HSYA-作用靶點(diǎn)、作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路相連接。

1.8 分子對(duì)接驗(yàn)證從網(wǎng)站http://www.chemspider.com/獲取 HSYA 分子 3D 結(jié)構(gòu) mol 格式，由Open Babel GUI(version 2.4.1 )軟件轉(zhuǎn)換為 mol2 格式[14]。從 RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)[15](https://www.rcsb.org/)下載對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)基因的 3D 分子結(jié)構(gòu) PDB 格式文件。利用 LeDock 軟件(http://www.lephar.com)進(jìn)行分子對(duì)接(molecular docking)[16]，通過PyMol 1.7.2.1 軟件(http://www.pymol.org)進(jìn)行分子對(duì)接的可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 HSYA相關(guān)作用靶點(diǎn)篩選從 PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的 HSYA 的 2D 結(jié)構(gòu) SDF 文件上傳至SwissTargetPrediction網(wǎng)站,獲取的潛在靶點(diǎn)經(jīng) Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行校正,得到經(jīng)驗(yàn)證的靶點(diǎn) 100 個(gè)作為 HSYA 的相關(guān)作用靶點(diǎn)。

2.2 抗氧化相關(guān)靶點(diǎn)篩選檢索 GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)中位數(shù)篩選出 Relevance score>10.23的抗氧化靶點(diǎn) 502 個(gè)；檢索 OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)得到抗氧化靶 點(diǎn)19個(gè)。將2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)整合，去除重復(fù)靶點(diǎn)后最終獲得518個(gè)與抗氧化相關(guān)的靶點(diǎn)。

2.3 HSYA抗氧化靶點(diǎn)的篩選將篩選出的HSYA相關(guān)作用靶點(diǎn)與 GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的抗氧化的靶點(diǎn)取交集，得到共同靶點(diǎn)31個(gè)(圖1)，即為 HSYA 抗氧化作用的潛在靶點(diǎn).靶點(diǎn)信息詳見表1。

圖1 HSYA抗氧化作用靶點(diǎn)韋恩圖

表1 HSYA抗氧化作用潛在靶點(diǎn)

2.4 HSYA抗氧化作用靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)利用Cytoscape 3.8.0 軟件構(gòu)建 HSYA-靶點(diǎn)可視化相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(圖2)。該網(wǎng)絡(luò)中紅色六邊形節(jié)點(diǎn)代表HSYA，綠色橢圓形節(jié)點(diǎn)代表HSYA的潛在抗氧化作用靶點(diǎn)，邊代表相互關(guān)系。該網(wǎng)絡(luò)圖表明，HSYA可通過作用于多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮抗氧化作用。

圖2 HSYA化合物-靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 HSYA抗氧化的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將HSYA抗氧化作用靶點(diǎn)信息導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得這些靶點(diǎn)相互作用關(guān)系，然后通過Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)。圖中每一個(gè)節(jié)點(diǎn)(node)代表一個(gè)HSYA抗氧化作用靶點(diǎn)，邊(edge)代表各靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系。節(jié)點(diǎn)顏色和大小反映了靶點(diǎn)的連接度(degree)，顏色由綠逐漸變紅，越接近紅色、節(jié)點(diǎn)越大表示該靶點(diǎn)的度值越大，說明該靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要。該網(wǎng)絡(luò)中度值排名前10位的靶點(diǎn)依次為PTGS2(21)、EGFR(20)、JUN(20)、STAT3(19)、MTOR(18)、HSP90AA1(18)、KDR(18)、IL1B(18)、BCL2L1(16)、FN1(15)。

圖3 HSYA抗氧化作用靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果將HSYA抗氧化靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果顯示，全部 31 個(gè)抗氧化靶點(diǎn)共富集到 763 個(gè)相關(guān) GO 條目中，其中包括肽-絲氨酸磷酸化、肽-絲氨酸修正、正調(diào)控活性氧代謝過程、調(diào)控活性氧代謝過程、有機(jī)磷反應(yīng)、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、嘌呤化合物反應(yīng)、正調(diào)控一氧化氮生物合成過程、正調(diào)控一氧化氮代謝過程、急性時(shí)相反應(yīng)、調(diào)控活性氧生物合成過程、活性氧代謝過程等，富集排名前15的條目見圖4。

圖4 GO富集分析氣泡圖

對(duì)31個(gè)HSYA抗氧化靶點(diǎn)進(jìn)行 KEGG 通路富集分析，這些靶點(diǎn)可富集到104條信號(hào)通路中，其中排名前 15 的通路見圖 5。主要包括EGFR酪氨酸激酶抑制和耐藥信號(hào)通路、前列腺癌相關(guān)通路、糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的 AGE-RAGE 信號(hào)通路、NOD 樣受體信號(hào)通路、胰腺癌相關(guān)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、人巨細(xì)胞病毒感染相關(guān)通路、JAK-STAT 信號(hào)通路、C型凝集素受體信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化相關(guān)通路、HIF-1信號(hào)通路、卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、麻疹相關(guān)通路、EerB信號(hào)通路。結(jié)果表明，HSYA可以通過多條通路發(fā)揮抗氧化作用。

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.7 HSYA化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將HSYA、31個(gè)靶點(diǎn)基因和KEGGPathways分析的前20條通路，構(gòu)建HSYA化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。該網(wǎng)絡(luò)中V字形節(jié)點(diǎn)代表信號(hào)通路，菱形節(jié)點(diǎn)代表HSYA化合物，橢圓形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)顏色由綠到紅、由小到大表示節(jié)點(diǎn)的度值逐漸變大。PIK3CA、MTOR、IKBKB、STAT3、EGFR、JUN等靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)較大，說明其可能成為HSYA抗氧化作用的靶點(diǎn)。PI3K-Akt信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、EGFR酪氨酸激酶 抑制和耐藥通路、HIF-1信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化相關(guān)通路、IL-17信號(hào)通路、EerB信號(hào)通路等是HSYA抗氧化作用的潛在通路。參與PI3K-Akt信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、EGFR酪氨酸激酶抑制和耐藥通路、JAK-STAT信號(hào)通路的靶點(diǎn)有10、8、7、7個(gè)；其中PI3K-Akt信號(hào)通路在前20條信號(hào)通路中存在靶點(diǎn)數(shù)量最高，因此該通路可作為HSYA抗氧化作用有效的通路之一。而且，PIK3CA、MTOR、IKBKB、STAT3、EGFR、JUN等靶點(diǎn)在前20的信號(hào)通路中涉及6條以上的信號(hào)通路，由該網(wǎng)絡(luò)圖說明，HSYA通過多靶點(diǎn)、多信號(hào)通路協(xié)同調(diào)控而發(fā)揮抗氧化作用。

圖6 HSYA化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.8 分子對(duì)接驗(yàn)證根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)和化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，選取6個(gè)靶點(diǎn)(PIK3CA、MTOR、IKBKB、STAT3、EGFR、JUN)與HSYA進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果如表2所示，結(jié)合自由能均小于-6 kcal/mol，表明HSYA與上述靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的結(jié)合力。利用PyMol軟件對(duì)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化，結(jié)果見圖7。通過分子對(duì)接進(jìn)一步驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)HSYA抗氧化作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)的可靠性。

圖7 分子對(duì)接模式圖

表2 HSYA與對(duì)應(yīng)作用靶點(diǎn)間的分子對(duì)接

3 討論

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法.從成分、蛋白、通路多層次分析了HSYA抗氧化作用機(jī)制，篩選出HSYA抗氧化作用靶點(diǎn)，探索了HSYA化合物、靶點(diǎn)蛋白、信號(hào)通路之間的網(wǎng)絡(luò)特征。結(jié)果顯示，篩選出31個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與抗氧化作用相關(guān)，連接度較高的前10個(gè)靶點(diǎn)有PTGS2、EGFR、JUN、STAT3、MTOR、HSP90AA1、KDR、IL1B、BCL2L1、FN1等；其中，PIK3CA、MTOR、IKBKB、STAT3、EGFR、JUN等靶點(diǎn)參與多條信號(hào)通路。并且通過分子對(duì)接驗(yàn)證了HSYA與相關(guān)靶點(diǎn)的相互作用，證明了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的可靠性。

GO富集顯示，31 個(gè)抗氧化作用靶點(diǎn)共富集到763個(gè)相關(guān)GO條目中，提示肽-絲氨酸磷酸化、正調(diào)控活性氧代謝過程、調(diào)控活性氧代謝過程、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、正調(diào)控一氧化氮生物合成過程、正調(diào)控一氧化氮代謝過程、急性時(shí)相反應(yīng)、調(diào)控活性氧生物合成過程、活性氧代謝過程等與抗氧化作用相關(guān)。

在涉及的抗氧化通路方面，PI3K-Akt信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、EGFR酪氨酸激酶抑制和耐藥通路、HIF-1信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化相關(guān)通路、IL-17信號(hào)通路、EerB信號(hào)通路等的節(jié)點(diǎn)度值較高，有多個(gè)靶點(diǎn)參與。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，H2S可能通過PI3K/Akt依賴性激活Nrf 2 信號(hào)通路對(duì)吸煙大鼠左心室重構(gòu)產(chǎn)生抗氧化作用[17]；二苯乙烯類化合物能通過PI3K/Akt信號(hào)通路降低細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)，對(duì)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元起到抗氧化作用[18]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí).HSYA亦可以通過調(diào)控PI3K/Akt/GSK3β信號(hào)通路保護(hù)大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷[19]。這些研究說明PI3K/Akt信號(hào)通路與抗氧化作用密切相關(guān)。EGFR酪氨酸激酶抑制和耐藥通路上存在的EGFR被EGF識(shí)別結(jié)合，能夠激活酪氨酸激酶區(qū)，導(dǎo)致EGF磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞的分裂增殖及正常細(xì)胞的惡性突變，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖、分化、遷移和細(xì)胞周期發(fā)揮十分重要的作用[20]。與先前研究結(jié)果一致，HSYA可能通過這些通路發(fā)揮抗氧化作用。通過成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)每個(gè)信號(hào)通路富集有多個(gè)靶點(diǎn)，每個(gè)靶點(diǎn)參與多條信號(hào)通路。由此說明，HSYA通過多靶點(diǎn)、多信號(hào)通路協(xié)同調(diào)控而發(fā)揮抗氧化作用。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從作用機(jī)制方面入手，探討HSYA抗氧化作用的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)、生物學(xué)功能以及相關(guān)的信號(hào)通路，闡明了HSYA通過多靶點(diǎn)、多途徑的協(xié)同效應(yīng)發(fā)揮抗氧化作用。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)資源信息的局限性，預(yù)測(cè)結(jié)果尚不能完全證明其正確性，在此基礎(chǔ)上，后續(xù)將進(jìn)行動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)作用機(jī)制予以驗(yàn)證，以期為拓展其臨床應(yīng)用提供參考。