抗相思子毒素抗體的嵌合改造與功能評(píng)價(jià)

彭靜怡 俞旖湉 杜尚男 柴立輝 喬春霞

（河南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院抗體藥物開發(fā)技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，開封475004）

相思子毒素（Abrin）是一種從豆科、相思子屬植物相思子豆種子中提取的毒素蛋白，與蓖麻毒素（Ricin）同屬于Ⅱ型核糖體失活蛋白（ribosome-acti?vating proteins，RIPs）家族［1］。Abrin 包括a、b、c、d 4 類，分子量為63～67 kD，是一種異二聚體蛋白，由具有N-糖苷酶活性的A 鏈和半乳糖特異性凝集素B鏈組成［2-3］。其B 鏈可與細(xì)胞表面β-D-半乳糖苷部分結(jié)合，介導(dǎo)毒素內(nèi)化/內(nèi)吞進(jìn)入宿主細(xì)胞。入胞后，毒素的A、B 鏈分離，A 鏈進(jìn)入核糖體水解28S 核糖體RNA的N-糖苷鍵，導(dǎo)致核糖體失活并抑制蛋白合成，從而引起細(xì)胞凋亡［4］。不同細(xì)胞中，Abrin 引起細(xì)胞死亡的原因不同。Jurkat 細(xì)胞中，Abrin 通過發(fā)揮蛋白合成抑制（protein synthesis inhibition，PSI）作用引起細(xì)胞線粒體應(yīng)激或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而激活胱天蛋白酶途徑誘導(dǎo)細(xì)胞程序性凋亡［5-6］；而在U266B1 細(xì)胞中，Abrin 作用于細(xì)胞后引起PSI，導(dǎo)致溶酶體膜通透性改變并釋放組織蛋白酶，引起細(xì)胞壞死［7］。已知Abrin A 鏈的活性中心由Y74、V75、Y113、E164和R167等殘基構(gòu)成，中和性抗體可通過封閉其活性位點(diǎn)或形成位阻效應(yīng)發(fā)揮中和作用［8］。

Abrin 可通過多種方式進(jìn)入體內(nèi)，如注射、吸入或吞食等，中毒后臨床表現(xiàn)為胃腸道癥狀和血管滲漏，引發(fā)全身毒性、多器官衰竭甚至死亡［9］。Abrin來源廣泛，缺乏有效解毒劑且毒性較Ricin 更強(qiáng)，因此被美國疾控中心定義為B 類生物戰(zhàn)劑［10］。目前，針對(duì)Abrin 中毒患者的主要治療方式為對(duì)癥治療，必要時(shí)可給予血液凈化，也有報(bào)道提出可通過被動(dòng)免疫預(yù)防Abrin 中毒［11］?；陔s交瘤技術(shù)篩選出的D6F10和A7C4是兩株已報(bào)道的鼠源特異性抗Abrin中毒的中和性單克隆抗體，在體內(nèi)/外均有中和保護(hù)效果［12-13］。突變分析發(fā)現(xiàn)，D6F10 識(shí)別的中和表位為Thr112、Gly114和Arg118殘基，位于Abrin A 鏈活性中心附近，因此可阻斷Abrin 活性，逆轉(zhuǎn)Abrin 對(duì)蛋白合成的抑制作用［14］。而A7C4識(shí)別的位點(diǎn)離Abrin A鏈活性中心較遠(yuǎn)，且共聚焦分析發(fā)現(xiàn)抗體會(huì)隨著毒素一同入胞，因此推測(cè)A7C4 是通過其他胞內(nèi)中和方式抑制毒性［13］。此外，MECHALY 等［15］通過免疫家兔構(gòu)建了免疫單鏈抗體噬菌體展示文庫，從中篩選并嵌合改造得到一組結(jié)合活性高的單克隆抗體，也可發(fā)揮保護(hù)作用，可見中和抗體可成為良好的相思子中毒特異性解毒劑。但目前針對(duì)這一毒素得到的中和抗體多為通過免疫等手段得到的異源單抗，由于存在較大副作用（如人抗鼠抗體反應(yīng)等）并不能直接用于人體，需要對(duì)其進(jìn)行人源化改造，降低其免疫原性［16］?？瓜嗨甲邮笤磫慰梗ㄖ袊l(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)枺?02110764514.4）屬于IgG1 型κ 鏈抗體，主要作用于Abrin A 鏈，具有良好的體內(nèi)/外中和活性。本研究取鼠源單克隆抗體可變區(qū)基因序列，在此基礎(chǔ)上通過抗體嵌合表達(dá)載體進(jìn)行抗體Fc 段改造，制備了4 株抗Abrin 人源化嵌合單抗，證實(shí)僅H1L1 為配對(duì)正確且具有良好中和活性的抗體，為Abrin 中毒的臨床防治、應(yīng)對(duì)突發(fā)中毒事件提供了選擇。

1 材料與方法

1.1 材料 Abrin 毒素購自博雷德公司；鼠源抗Abrin單克隆抗體、pET28a載體質(zhì)粒、大腸桿菌BL21（DE3）、抗體嵌合表達(dá)載體pFRT-KIgG1（基于pcD?NA-FRTTM載體（Invitrogen 公司，貨號(hào)：V601020）由本課題組儲(chǔ)存改造；Jurkat 細(xì)胞、SP2/0 細(xì)胞購自ATCC；CCK-8 試劑盒（貨號(hào)：SC675）購自Dojindo 公司；DMEM、1640 培養(yǎng)基、ExpiCHO-S 細(xì)胞和Expi?CHOTM表達(dá)系統(tǒng)試劑盒（貨號(hào)：A29133）購自Gibco公司；基因合成及測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 和山羊抗人IgG、ELISA 顯色液均購自北京天根生物公司；TNT?Coupled Reticulocyte Lysate Systems（貨號(hào)：L4610）、Luciferase Assay System Kits均購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；Tru-StainFcXTM（抗小鼠CD16/32 和抗人IgG 受體）購自Biolegend 公司；Alexa-FlourTM488 標(biāo)記的Abrin 由嘉暄生物（北京）合成；雌性BALB/c 小鼠（6～8 周齡）購自北京維通利華公司。

1.2 方法

1.2.1 人源化嵌合抗體質(zhì)粒構(gòu)建與表達(dá) 經(jīng)常規(guī)RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、PCR及測(cè)序等步驟分別得到2條鼠源抗Abrin 單克隆抗體的輕鏈和兩條重鏈序列，交叉配對(duì)，分別克隆入人源化IgG1 表達(dá)載體pFRTKIgG1，得到表達(dá)4 種不同抗體段全抗表達(dá)的質(zhì)粒，利用ExpiCHOTM培養(yǎng)表達(dá)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染ExpiCHO-S 細(xì)胞，37 ℃、125 r/min搖瓶培養(yǎng)8～9 d，收集細(xì)胞上清。

1.2.2 人源化嵌合抗體純化與定量 將Protein A Sepharose 親和層析柱連接至蛋白純化儀（AKTA prime plus，GE Health），收集細(xì)胞上清，1.5 ml/min上樣純化，洗脫收集的目的蛋白即為人源化嵌合抗體H1L1 等。用30 kD 截留孔徑的50 ml 超濾管對(duì)洗脫液進(jìn)行緩沖液置換和超濾濃縮，獲得純化蛋白。采用PierceTMBCA Protein Assay Kit 進(jìn)行純化抗體的濃度定量；按照說明書在96孔板中將待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品BSA 進(jìn)行稀釋，試劑盒A 液和B 液按50：1 配制工作液，在反應(yīng)孔中加入200 μl工作液和25 μl稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，37 ℃恒溫培養(yǎng)30 min，取出后測(cè)量562 nm 處吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)蛋白濃度。

1.2.3 間接ELISA測(cè)定人源化嵌合抗體與Abrin的結(jié)合能力 0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH=9.6）稀釋Abrin 至2 μg/ml（100 μl/孔），包被于ELISA 板，4 ℃孵育過夜，含0.2%吐溫-20 的PBS 清洗3 次，37 ℃、200 μl 5%PBS 脫脂牛奶封閉2 h，洗滌，100 μl/孔加入稀釋抗體37 ℃孵育1 h，洗滌，加入100 μl HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG（1：4 000）或HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1：6 000），室溫避光孵育45 min，加入TMB 底物緩沖液發(fā)生酶促反應(yīng)，添加100 μl終止液（H2SO4）終止反應(yīng)，微量滴定板讀取器測(cè)定450 nm 處吸光度。所有實(shí)驗(yàn)孔均設(shè)置平行對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 ForteBio 測(cè)定人源化嵌合抗體與Abrin 的親和力 生物層干涉法（BLI）定量分析嵌合抗體與Abrin 的親和力。采用Anti-Human IgG Fc Capture（AHC）生物傳感器捕獲人源化嵌合抗體及鼠源抗體，含0.2%吐溫-20 的PBS（PBST）稀釋Abrin（從200 nmol/L 到3.13 nmol/L），初始基線和固定步驟時(shí)間設(shè)置為60 s，結(jié)合時(shí)間為180 s，解離時(shí)間為300 s；生物傳感探針用10 mmol/L 甘氨酸鹽酸溶液（pH=1.7）脈沖5 s，重復(fù)3 次，將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入分析軟件進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，生成動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)KD（平衡解離常數(shù)）。

1.2.5 CCK-8 測(cè)定細(xì)胞水平抗體中和毒素效果CCK-8 試劑盒測(cè)定嵌合抗體保護(hù)Abrin 染毒Jurkat、SP2/0 細(xì)胞的中和保護(hù)作用。1640 或DMEM 培養(yǎng)基重懸Jurkat 細(xì)胞或SP2/0 細(xì)胞，2×105個(gè)/孔接種于96 孔板（50 μl/孔）；將梯度稀釋的純化抗體與Abrin共同加入反應(yīng)孔（各25 μl）37 ℃孵育48 h，加入CCK-8 試劑孵育2～6 h，微量滴定板讀取器中測(cè)定450 nm 處吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（陽性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%，處理數(shù)據(jù)并制作曲線圖，所有實(shí)驗(yàn)孔均設(shè)置平行對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 無細(xì)胞體系檢測(cè)抗體拯救熒光素酶合成實(shí)驗(yàn) Abrin A 鏈序列由UniProt查詢得到（UniProtKB：P11140.2），轉(zhuǎn)至pET28a載體質(zhì)粒，測(cè)序鑒定正確后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3），擴(kuò)增培養(yǎng)、超聲裂解等步驟后，利用鎳親和層析柱純化蛋白，所得純度達(dá)95%。不同劑量Abrin A 鏈（從1 μg/ml到0.1 ng/ml）加至Rabbit Reticulocyte Lysates 反應(yīng)體系（總反應(yīng)體系為50 μl，包括T7 聚合酶、T7 DNA 模板等），30 ℃孵育90 min，取2.5 μl與50 μl熒光素酶測(cè)定試劑混合，立即在熒光讀數(shù)器測(cè)熒光值。設(shè)置不加T7 DNA模板的陰性對(duì)照和不加Abrin 的陽性對(duì)照。固定Abrin濃度為20 ng/ml，將Abrin A鏈與不同濃度抗體（從10 μg/ml 到1 ng/ml）共同加至Rabbit Reticulo?cyte Lysates 反應(yīng)體系（50 μl），30 ℃孵育90 min，取2.5 μl與50 μl熒光素酶測(cè)定試劑混合測(cè)定熒光值。設(shè)置不加抗體的陰性對(duì)照和不加Abrin的陽性對(duì)照。

1.2.7 抗體體內(nèi)保護(hù)效果 6～8 周齡雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.25 mg/kg Abrin，同時(shí)注射不同濃度純化抗體，觀察150 h 并記錄小鼠存活情況，繪制生存曲線。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)分析抗體是否阻斷Abrin 結(jié)合細(xì)胞 收集1×106個(gè)Jurkat 細(xì)胞于1.5 ml EP 管，F(xiàn)ACS洗液（含2%血清的PBS）清洗2次，細(xì)胞表面受體封閉劑TruStainFcXTM室溫孵育10 min，將標(biāo)記Alexa-488 的Abrin 與不同濃度抗體加至細(xì)胞（總反應(yīng)體系為100 μl），4 ℃孵育1 h，預(yù)冷PBS 清洗2 次，300 g 離心5 min，收集細(xì)胞，含1%多聚甲醛的PBS固定細(xì)胞20 min，F(xiàn)ACScan（Becton Dickinson）進(jìn)行流式分析，設(shè)置裸細(xì)胞對(duì)照、未標(biāo)記Abrin 與Alexa-488標(biāo)記Abrin競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合細(xì)胞對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad8.2.1 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xˉ±s 表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗體基因釣取及嵌合抗體構(gòu)建與表達(dá) 從雜交瘤細(xì)胞株10D8中測(cè)序得到2條輕鏈可變區(qū)和2條重鏈可變區(qū)序列，這一現(xiàn)象是可能的，但較為罕見。經(jīng)細(xì)胞株亞克隆和再次測(cè)序排除了亞克隆不徹底的因素，測(cè)序結(jié)果證明10D8 中確實(shí)存在以上4 條抗體可變區(qū)序列，推測(cè)這4 條基因可能均整合了細(xì)胞染色體，形成了“四倍體”細(xì)胞株；同時(shí)猜測(cè)自由組合得到的4 種抗體中，可能2 種抗體是天然配對(duì)正確的抗體分子，僅有1 種具有中和活性?；谝陨贤茰y(cè)，分別合成了4條序列，經(jīng)交叉配對(duì)分別克隆入人源抗體表達(dá)載體pFRT-KIgG1載體，成功構(gòu)建了4種抗體的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染CHO-S 細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)搖瓶表達(dá)，搖瓶培養(yǎng)8～9 d 后收集上清，Protein A Sepha?rose 親和層析柱純化，成功得到H1L1、H1L2、H2L1、H2L2 人源嵌合抗體，且表達(dá)穩(wěn)定，產(chǎn)量較高。BCA定量試劑盒定量純化抗體的濃度為1.5～3.5 mg/ml。

2.2 人源化嵌合抗體的體外結(jié)合功能 梯度稀釋純化的4種嵌合抗體與包被的Abrin反應(yīng)，OD450結(jié)果顯示，隨著抗體濃度升高，其中3 株抗體與Abrin 結(jié)合相應(yīng)加強(qiáng)，顯示抗體活性良好，具有明顯劑量依賴性。這3 株抗體結(jié)合的EC50分別為（0.121 2±0.004 0）μg/ml（H1L1）、（0.441 7±0.000 4）μg/ml（H1L2）、（0.127 7±0.002 0）μg/ml（H2L2），其 中H1L1、H2L2抗體與母本10D8抗體［EC50=（0.158 25±0.002 35）μg/ml］的結(jié)合能力接近（圖1）。

圖1 嵌合抗體與Abrin結(jié)合的能力Fig.1 Ability of chimeric antibody to bind Abrin

2.3 人源化嵌合抗體的親和常數(shù) 被生物傳感器芯片捕獲的純化抗體與梯度稀釋的Abrin 結(jié)合或解離過程中，記錄分子結(jié)合面信號(hào)變化，動(dòng)力學(xué)軟件繪制曲線（圖2），所得親和常數(shù)分別為3.97×10-10M（H1L1）、3.94×10-8M（H1L2）、3.55×10-8M（H2L1）、5.25×10-8M（H2L2）?？梢姡?種嵌合抗體中，僅H1L1的結(jié)合和解離曲線具有明顯抗原-抗體作用特征，親和常數(shù)與10D8（5.59×10-10M）最為接近；其他3 種抗體結(jié)合的動(dòng)力學(xué)曲線不穩(wěn)定，推測(cè)這些抗體輕、重鏈可變區(qū)可能不匹配，從而影響了Fv 構(gòu)象穩(wěn)定性，或抗體與抗原結(jié)合不強(qiáng)，不易形成穩(wěn)定復(fù)合物。

圖2 嵌合抗體結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Kinetic curve of chimeric antibody

2.4 嵌合抗體在體外細(xì)胞保護(hù)試驗(yàn)中的作用 梯度稀釋的純化抗體與Abrin混合，與Jurkat細(xì)胞孵育48 h后CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果如圖3所示，僅嵌合抗體H1L1可有效保護(hù)Abrin殺傷的Jurkat細(xì)胞，且這一保護(hù)具有劑量依賴性［EC50=（3.745 5±0.057 5）ng/ml］，約為母本抗體10D8［EC50=（1.582 5±0.533 5）ng/ml］的42%，其他3株抗體均無中和活性。

圖3 嵌合抗體在Jurkat細(xì)胞內(nèi)中和毒素的效果Fig.3 Effect of chimeric antibody on neutralization of toxin in Jurkat cells

2.5 嵌合抗體在無細(xì)胞體系中阻礙Abrin A 鏈PSI A 鏈為Abrin 的毒素鏈，20 ng/ml Abrin A 鏈可抑制至少60%熒光素酶蛋白合成（圖4），而加入具有中和作用的嵌合抗體H1L1和10D8后均能促進(jìn)熒光素酶合成，逆轉(zhuǎn)Abrin 的PSI，且隨抗體濃度升高，熒光素酶合成量增多（圖5）；其中H1L1 的EC50=（0.672 9±0.075 5）μg/ml，母 本 抗 體10D8 EC50=（1.036 5±0.004 5）μg/ml。

圖4 Abrin A鏈的PSI作用Fig.4 PSI effect synthesis of Abrin A chain

圖5 嵌合抗體劑量依賴性恢復(fù)蛋白合成Fig.5 Chimeric antibody recovers protein synthesis in a dose-dependent manner

2.6 嵌合抗體的體內(nèi)保護(hù)效果 小鼠腹腔注射Abrin，同時(shí)在腹腔另一側(cè)注射不同劑量純化抗體，連續(xù)觀察150 h 并記錄小鼠生存情況（圖6），單純毒素中毒組（對(duì)照組）小鼠給藥40 h 后死亡，而用低劑量嵌合抗體H1L1和10D8治療的小鼠死亡時(shí)間相對(duì)延長，且提高抗體劑量后小鼠存活率也明顯提高，50 μg/kg H1L1 或10D8 給藥均能完全保護(hù)小鼠，存活率為100%，顯示H1L1 具有良好的體內(nèi)中和活性。

圖6 嵌合抗體體內(nèi)保護(hù)作用Fig.6 Protective effect of chimeric antibody in vivo

2.7 嵌合抗體不抑制Abrin 黏附或進(jìn)入細(xì)胞Abrin通過其B 鏈與細(xì)胞表面糖苷鍵結(jié)合，黏附并進(jìn)入細(xì)胞，當(dāng)標(biāo)記Alexa-488 的Abrin 與嵌合抗體或未標(biāo)記的Abrin（對(duì)照）共同孵育后，流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，高濃度嵌合抗體H1L1 或10D8 并不能有效抑制或促進(jìn)Abrin 與細(xì)胞黏附或進(jìn)入細(xì)胞的功能（圖7），而未標(biāo)記的Abrin 則可抑制標(biāo)記毒素與細(xì)胞結(jié)合，推測(cè)H1L1 和10D8 并不阻礙毒素入胞，而是可能在胞內(nèi)通過阻礙Abrin 毒性位點(diǎn)或干擾下游信號(hào)分子發(fā)揮中和作用。

圖7 嵌合抗體的體內(nèi)保護(hù)作用Fig.7 Protective effect of chimeric antibody in vivo

3 討論

Abrin 與Ricin 均為植物源性蛋白毒素，能夠通過水解N-糖苷鍵抑制蛋白合成，有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性。Abrin 來源廣泛且易制備，與Ricin 共同被認(rèn)為可能被用作恐怖襲擊的生物戰(zhàn)劑。為維護(hù)我國國防安全、應(yīng)對(duì)公眾突發(fā)中毒事件，需要針對(duì)Abrin 開展防治研究。目前，針對(duì)Abrin 中毒的救治多為支持性護(hù)理，而已報(bào)道的幾株中和性抗體多為動(dòng)物源性，臨床使用會(huì)引起較強(qiáng)免疫排斥反應(yīng)，副作用較大，而能夠直接用于人體的人源化抗體或嵌合抗體則可減弱排異反應(yīng)等帶來的不良癥狀。

隨著抗體技術(shù)革新，人源化抗體構(gòu)建、表達(dá)與應(yīng)用已十分成熟。本研究從一株具有良好活性的雜交瘤中釣取了2 條重鏈和2 條輕鏈可變區(qū)。為確定有效序列，排除“共生”的無效序列段干擾，對(duì)這4 條序列進(jìn)行交叉配對(duì)，利用表達(dá)人源化全長IgG1的pFRT-KIgG1 載體完成了4 種備選抗體的嵌合改造，逐一考察了每種抗體的體內(nèi)、外生物學(xué)活性。最終確定H1L1 抗體結(jié)合活性與鼠源母本抗體相似，且擁有較好的細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)中和保護(hù)效應(yīng)；而其余3株抗體活性較弱，原因可能為輕、重鏈可變區(qū)本身結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，或配對(duì)的輕、重鏈可變區(qū)間不匹配，導(dǎo)致全分子抗體三維構(gòu)象極不穩(wěn)定，從而影響了與抗原Abrin的結(jié)合和解離。

綜上，本研究得到的4 株嵌合抗體中，僅H1L1為配對(duì)正確且活性良好的候選抗體，具有良好體內(nèi)中和保護(hù)作用，因此可進(jìn)一步優(yōu)化和開發(fā)，希望得到可用于Abrin 中毒急救或應(yīng)急防控的候選抗體藥物。