miR-377靶向ZEB2調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化①

肉斯旦·圖爾迪 伊不拉音·西力甫 雷 程 劉 林 帕爾哈提·沙依木③

（烏魯木齊市友誼醫(yī)院普外科，烏魯木齊830000）

結(jié)腸癌為臨床常見消化道惡性腫瘤，發(fā)病率呈上升趨勢。近50%結(jié)腸癌患者有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，預(yù)后較差，復(fù)發(fā)后患者中位生存期僅為13.3個(gè)月［1］。轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程，研究已證實(shí)其與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)［2］。因此，探究結(jié)腸癌的潛在轉(zhuǎn)移機(jī)制對抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移意義重大。miRNA 為內(nèi)源性非編碼小分子RNA，負(fù)調(diào)控靶基因，可作為抑癌基因或促癌基因發(fā)揮作用［3］。大量miRNA 在不同病理狀態(tài)下異常表達(dá)，且miRNA 與多種惡性腫瘤發(fā)生進(jìn)展有關(guān)［4-5］。miR-377 在多種腫瘤中異常表達(dá)，可抑制腫瘤增殖、遷移和侵襲［6-7］。近年已有關(guān)于miR-377-3p 在大腸癌中表達(dá)的研究報(bào)道，發(fā)現(xiàn)其可作為癌基因發(fā)揮促癌作用［8］。miR-377 的生物學(xué)功能及其在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬探討miR-377 對結(jié)腸癌遷移、侵襲的影響及潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI1640 培養(yǎng)基購自瑞士Lonza 公司（Lot.No.20190802，Cat#G1063）；胎牛血清購自美國Gibco 公司；miR-377 mimic、inhibitor 及陰性對照物由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成；Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol 試劑、pcDNA4.1-ZEB2質(zhì)粒購自Invitrogen 公司；pmirGLO-wt-ZEB2、pmir?GLO-mut-ZEB2熒光素酶報(bào)告載體購自美國Promega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和FastStart Universal SYBR Green Master 試劑盒購自Roche 公司；miRNA 提取分離試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；雙熒光素酶報(bào)告檢測系統(tǒng)購自美國Promega公司；ZEB2、ALDH1、CD133、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、GAPDH 抗體及HRP 標(biāo)記的二抗均購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29、SW480、SW620、HCT116和人小腸上皮細(xì)胞HIEC 均購自中國科學(xué)院，采用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培 養(yǎng) 基 于37 ℃、5%CO2培 養(yǎng)。采 用Lipo?fectamine2000 將miR-377 mimic 及陰性對照轉(zhuǎn)染至HCT116 細(xì)胞。采用Lipofectamine2000 將miR-377 mimic 和pcDNA4.1-ZEB2 共轉(zhuǎn)染至HCT116 細(xì)胞過表達(dá)ZEB2。

1.2.2 雙熒光素酶報(bào)告分析 將miR-377 mimic及陰性對照與pmirGLO-wt-ZEB2、pmirGLO-mut-ZEB2共轉(zhuǎn)染HCT116 細(xì)胞，培養(yǎng)48 h 后，Lucifer 報(bào)告分析系統(tǒng)檢測細(xì)胞熒光素酶活性。

1.2.3 RT-qPCR 采用Trizol 試劑或miRNA 提取分離試劑盒提取細(xì)胞系RNA 或miRNA，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用FastStart Universal SYBR Green Maste 試 劑 盒 進(jìn) 行RT-qPCR 反 應(yīng)，以GAPDH 為 內(nèi)參。引物序列為miR-377 F：5'-TGCTGATCACA?CAAAGG-3'，miR-377 R：5'-TGTAGTGTGTTTCCGTTGAA-3'，ZEB2 F：5'-GAGGCGCGCGAGAAAGG-3'，ZEB2 R：5'-GCCCAGCTTCCCGTAGCC-3'，GAPDH F：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，GAPDH R：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。

1.2.4 傷口愈合試驗(yàn) 將HCT116細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6 孔板，培養(yǎng)24 h 后，塑料吸管尖作劃痕，去除碎片或脫落細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，計(jì)算傷口寬度。

1.2.5 Transwell 50 μl 基 質(zhì) 凝 膠 包 被Transwell小室，37 ℃凝固4 h，將HCT116 細(xì)胞以2×104個(gè)/ml重懸于無血清培養(yǎng)基上室，下室加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，1%結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 Western blot 提取細(xì)胞中蛋白，SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%牛血清白蛋白封閉，加入抗ZEB2（1：1 500）、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin（1：2 000）和抗GAPDH（1：3 000）一抗4 ℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的二抗（1：5 000）室溫孵育2 h，檢測免疫反應(yīng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.00處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s 表示，采用t 檢驗(yàn)或單因素方法分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-377在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá) RT-qPCR結(jié)果顯示，與HIEC 細(xì)胞相比，結(jié)腸癌細(xì)胞系中miR-377 表達(dá)降低（P＜0.05，圖1A）。成功將miR-377 mimic 轉(zhuǎn)染至miR-377 表達(dá)最低的HCT116 細(xì)胞中進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)檢測，并以轉(zhuǎn)染陰性對照的HCT116細(xì)胞作為對照組（圖1B）。

圖1 結(jié)腸癌細(xì)胞系、轉(zhuǎn)染miR-377 mimic 的HCT116 細(xì)胞miR-377表達(dá)Fig.1 miR-377 expression in colon cancer cell lines and HCT116 cells transfected with miR-377 mimic

2.2 miR-377 靶向作用于ZEB2 基因抑制其蛋白表達(dá) 生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)，ZEB2 是miR-377 保守的結(jié)合位點(diǎn)（圖2A）；熒光素酶報(bào)告檢測顯示，與對照組相比，miR-377 mimic 和pmirGLO-WT-ZEB2共轉(zhuǎn)染的HCT116 細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），但ZEB2結(jié)合位點(diǎn)突變逆轉(zhuǎn)了miR-377 mimic對熒光素酶活性的抑制作用（P＞0.05，圖2B）；miR-377 mimic 顯著降低了HCT116 細(xì)胞ZEB2 蛋白表達(dá)（P＜0.05，圖2C）。

圖2 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測miR-377與ZEB2的靶向作用Fig.2 Luciferase reporter experiment detects targeting effect of miR-377 and ZEB2

2.3 miR-377 靶向作用于ZEB2 抑制HCT116 細(xì)胞遷移 miR-377+Vector 組劃痕愈合率顯著低于NC+Vector組（P＜0.05），miR-377+ZEB2組劃痕愈合率顯著高于miR-377+Vector組（P＜0.05），但與NC+Vector組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3）。

圖3 傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測miR-377 mimic 和ZEB2 過表達(dá)對HCT116細(xì)胞遷移的影響Fig.3 Wound healing experiment detects effects of miR-377 mimic and ZEB2 over-expression on migration of HCT116 cells

2.4 miR-377 靶向作用于ZEB2 抑制HCT116 細(xì)胞侵襲 miR-377+Vector 組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著少于NC+Vector組（P＜0.05），miR-377+ZEB2組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著多于miR-377+Vector組（P＜0.05），但與NC+Vector組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4）。

圖4 Transwell 檢 測miR-377 mimic 和ZEB2 過 表 達(dá)對HCT116細(xì)胞侵襲的影響Fig.4 Transwell detects effect of miR-377 mimic and ZEB2 over-expression on invasion of HCT116 cells

2.5 miR-377 靶向作用于ZEB2 調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá) 與NC+Vector 組相比，miR-377+Vector 組E-cadherin 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），N-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），與miR-377+Vector 組相比，miR-377+ZEB2 組E-cad?herin 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），N-cadherin、Vi?mentin 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），NC+Vector 組與miR-377+ZEB2組上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖5）。

圖5 Western blot 檢 測miR-377 和ZEB2 對HCT116 細(xì) 胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of miR-377 and ZEB2 on expressions of epithelial-mesenchymal transition-related proteins in HCT116 cells by Western blot

3 討論

結(jié)腸癌是發(fā)生在結(jié)腸上皮的惡性腫瘤，是一種較常見的消化系統(tǒng)惡性疾病，發(fā)病原因尚不清楚［9］。結(jié)腸癌會向多個(gè)內(nèi)臟器官、組織侵犯，對患者身體造成較為嚴(yán)重的損傷，晚期結(jié)腸癌致死率也較高［10-11］。轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌引起患者死亡及術(shù)后復(fù)發(fā)的主要原因，可能與腫瘤生存能力失調(diào)有關(guān)，現(xiàn)證實(shí)轉(zhuǎn)移與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)［12-13］。因此，探究結(jié)腸癌潛在的轉(zhuǎn)移機(jī)制對抑制其轉(zhuǎn)移意義重大。

近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 與多種惡性腫瘤腫發(fā)生進(jìn)展有關(guān)［14-15］。miR-377在多種腫瘤中異常表達(dá)，可抑制腫瘤增殖、遷移和侵襲［16-17］。HUANG 等［18］研究表明，miR-377在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，且miR-377低表達(dá)與結(jié)腸癌患者整體生存率和TNM分期密切相關(guān)，可預(yù)測不良預(yù)后。本研究體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與HIEC 細(xì)胞相比，miR-377 在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平較低（P＜0.05），提示miR-377 在結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)降低。

本實(shí)驗(yàn)通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-377 可能與ZEB2 存在靶向作用關(guān)系，進(jìn)一步通過熒光素酶報(bào)告分析證實(shí)了ZEB 家族的ZEB2 為miR-377 的靶點(diǎn)，miR-377 在結(jié)腸癌細(xì)胞中可靶向作用于ZEB2基因，抑制ZEB2基因表達(dá)，與既往研究報(bào)道一致，miR-377/ZEB2 軸可抑制膀胱癌進(jìn)展，且ZEB2 可促進(jìn)多種腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［19-20］。為探究miR-377靶向作用ZEB2基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響，本研究分別將miR-377 mimic、陰性對照物、pmirGLO-wt-ZEB2、pmirGLO-mut-ZEB2 共 轉(zhuǎn) 染 至HCT116 細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-377+Vector 組劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于NC+Vector 組，miR-377+ZEB2 組劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)顯著高于miR-377+Vector 組，但與NC+Vector 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明miR-377可能通過靶向作用于ZEB2促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化指上皮到間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的生物學(xué)過程［21］。通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性，失去與基底膜連接的上皮表型，獲得較高遷移與侵襲性、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)能力的間質(zhì)表型［22-23］。本研究顯示，與NC+Vector 組相比，miR-377+Vector 組E-cadherin 蛋白表達(dá)顯 著升高（P＜0.05），N-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），與miR-377+Vector組相比，miR-377+ZEB2組E-cadherin 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），N-cad?herin、Vimentin 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），NC+Vector 組和miR-377+ZEB2 組上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)無明顯差異（P＞0.05），表明miR-377 可增加上皮細(xì)胞標(biāo)志物，同時(shí)減少間質(zhì)標(biāo)志物，從而抑制結(jié)腸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，而ZEB2 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-377對結(jié)腸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用。

綜上，miR-377 通過靶向作用于ZEB2 調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn)而影響結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、侵襲，為結(jié)腸癌臨床治療提供了新的策略。