lncRNA-PCAT6通過(guò)調(diào)控miR-185/SIX1軸對(duì)肺癌A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及化療敏感性的影響

王華麗 農(nóng)開旭 程守斌 秦 篙 許振勝

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院呼吸內(nèi)科，?？?70208）

肺癌是發(fā)病率及病死率均居世界首位的惡性腫瘤［1］。肺癌早期診斷困難，術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、化療藥物耐受性升高及放化療敏感性降低，是導(dǎo)致患者治療失敗及死亡的主要原因［2］。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epi?thelial mesenchymal transition，EMT）在癌細(xì)胞侵襲遷移發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用，且被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生侵襲、遷移、耐藥抵抗性的重要原因［3-5］。目前研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lnc-RNA）可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合及綁定目標(biāo)基因序列而參與調(diào)控人類癌癥復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及耐藥性發(fā)生發(fā)展過(guò)程，且lncRNA-PCAT6 已被發(fā)現(xiàn)在人類肺癌、胰腺癌等多種癌癥組織中異常表達(dá)，并與癌癥患者生存及預(yù)后關(guān)系密切［6-7］。但lncRNA-PCAT6在肺癌轉(zhuǎn)移及耐藥性發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的靶向調(diào)控機(jī)制還不甚明確。微小非編碼RNA-185（microRNA-185，miR-185）是一種與癌癥相關(guān)的miRNA，已有研究證實(shí)miR-185可靶向抑制SIX1 表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及耐藥性［8-9］。lncRNA-PCAT6 能否靶向調(diào)控miR-185/SIX1軸表達(dá)進(jìn)而影響肺癌細(xì)胞EMT 及耐藥性的發(fā)生發(fā)展，目前還未見報(bào)道。本研究通過(guò)體內(nèi)外試驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行探究驗(yàn)證，以期為肺癌的靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及動(dòng)物來(lái)源 人肺癌細(xì)胞系（A549）購(gòu)自中國(guó)上海細(xì)胞庫(kù)（貨號(hào)：BNCC290808）；人肺癌耐順鉑細(xì)胞株（A549/DDP）購(gòu)自上海奧陸生物科技有限公司（貨號(hào)：SA-2819）；雄性BALB/c 裸鼠42 只，6 周齡，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自北京富豪實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0015；所有動(dòng)物按《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》進(jìn)行，并經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑與儀器 RPMI1640 培養(yǎng)基（南京北魚生物科技有限公司，貨號(hào)：BYCI-RELM-3992-0）；順鉑（DDP，四川省維克奇生物科技有限公司，貨號(hào)：wkq-08833）；CCK-8試劑盒（上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，貨號(hào)：CK04-2）；RNA 提取試劑盒（北京天漠科技開發(fā)有限公司，貨號(hào)：TR205-50）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：DEM201-20T）；E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、SIX1、P-gp（美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab239883、ab92547、ab76011、ab243247、ab262880）；G2000 型PCR 儀購(gòu)自北京托摩根（Thmorgan）生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染分組 取人A549細(xì)胞系及A549/DDP 細(xì)胞株常規(guī)復(fù)蘇后，用RPMI1640 培養(yǎng)基在恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)傳代細(xì)胞。分別取對(duì)數(shù)期A549、A549/DDP 細(xì)胞，以5×104個(gè)/孔的密度接種于6 孔板，并進(jìn)行如下處理：①取A549 細(xì)胞，分為空白組、PCAT6-Si組（轉(zhuǎn)染lncRNA-PCAT6低表達(dá)腺病毒PCAT6-Si）、eGFP-Si-1 組（轉(zhuǎn) 染 不 含lncRNAPCAT6-Si 的空病毒載體eGFP-Si-1）、miR-185-Si 組（轉(zhuǎn)染miR-185 低表達(dá)腺病毒miR-185-Si）、eGFP-Si-2 組（轉(zhuǎn)染不含miR-185-Si 的空病毒載體eGFP-Si-2）、PCAT6-Si+miR-185-Si 組（PCAT6-Si 與miR-185-Si 共轉(zhuǎn)染）；②取A549/DDP 細(xì)胞，并分別轉(zhuǎn)染PCAT6-Si 及miR-185-Si，分為：A549 組、A549/DDP組、PCAT6-Si 組、miR-185-Si 組、PCAT6-Si+miR-185-Si、eGFP-Si-1 組、eGFP-Si-2 組。各組均設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M、A549組、A549/DDP 組不做任何處理正常培養(yǎng)，其余各組分別待A549、A549/DDP 細(xì)胞融合度達(dá)50%～60%時(shí)，轉(zhuǎn)染相應(yīng)的低表達(dá)腺病毒及其空載體eGFP-Si。各轉(zhuǎn)染組于轉(zhuǎn)染后24 h，取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 RT-qPCR 檢測(cè)各組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-PCAT6、miR-185 相對(duì)表達(dá)水平 以cDNA 為模板，按照RTqPCR 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行PCR 反應(yīng)（反應(yīng)體系：正反向引物各0.5 μl，2×SYBR mix 10 μl，10×cDNA 模板1 μl，H2O 8 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min、95 ℃變性30 s、65 ℃退火60 s、45 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸30 min。lncRNA-PCAT6以GAPDH 為內(nèi)參，miR-185以U6 為內(nèi)參。用2-ΔΔCt算法，計(jì)算lncRNA-PCAT6 及miR-185 表達(dá)水平。大連寶生物公司合成提供引物序列，見表1。

表1 引物序列表Tab.1 Primer sequences

1.2.3 Transwell檢測(cè)A549細(xì)胞遷移侵襲能力 取1.2.1 項(xiàng)下①方法處理轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基重懸為1×108個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。取Transwell 小室，小室上室加入100 μl 不含胎牛血清的培養(yǎng)液及細(xì)胞懸液，小室下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，室溫孵育24 h，取出小室，4%多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色后，于光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機(jī)取5 個(gè)視野計(jì)數(shù)，細(xì)胞數(shù)目越多代表細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)。小室上室鋪Matrigel膠工作液（Matrigel膠：培養(yǎng)基=1：8）50 μl，室溫孵育過(guò)夜，Matrigel膠凝固后，其余步驟同遷移試驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 免疫熒光檢測(cè)A549 細(xì)胞EMT 標(biāo)志物N-cadherin 陽(yáng)性表達(dá) 取1.2.1 項(xiàng)下①方法處理轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定后，用特丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）處理、0.25%曲拉通透化后，加入N-cadherin 特異性一抗（1：200）4 ℃孵育過(guò)夜，加入Aexa Fluor488 熒光標(biāo)記的二抗室溫孵育0.5 h，DAPI 核染后，防猝滅液封片，于熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)A549細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性取1.2.1 項(xiàng)下②方法處理轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞，參照文獻(xiàn)［10］于培養(yǎng)液中分別加入終濃度為0、2、4、8、16、32、64 μmol/L 的DDP 培養(yǎng)24 h 后，加入CCK-8 溶液10 μl 繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后，酶標(biāo)儀于450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各組細(xì)胞OD 值，根據(jù)OD 值繪制生長(zhǎng)曲線，采用GraphPad Prism 軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50），并按照以下公式計(jì)算耐藥指數(shù)（resistance index，RI）：RI=實(shí)驗(yàn)組IC50/A549組IC50。

1.2.6 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞蛋白相對(duì)表達(dá)水平取1.2.1 項(xiàng)下①處理方法細(xì)胞檢測(cè)SIX1、EMT 標(biāo)志蛋白E-cadherin、Vimentin 及N-cadherin 的表達(dá)；取1.2.1 項(xiàng)下②處理方法細(xì)胞檢測(cè)SIX1、P-gp、Cas?pase-1、MMP-9 蛋白表達(dá)。具體方法為收集各組細(xì)胞，抽提蛋白及BCA 法測(cè)蛋白濃度后，取50 μg蛋白樣品上樣，行電泳及轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，加入一抗［SIX1、E

cadherin、Vimentin、N-cadherin、P-gp、Caspase-1、MMP-9 抗體（1：800），內(nèi)參GAPDH（1：3 000）］，4 ℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶二抗（1：3 000）室溫孵育4 h，電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑顯影曝光，化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)拍照并分析灰度值。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 裸鼠荷瘤試驗(yàn)驗(yàn)證PCAT6 對(duì)DDP 耐藥的A549 細(xì)胞化療敏感性的作用 將1.2.1 項(xiàng)下②處理方法轉(zhuǎn)染的A549/DDP 細(xì)胞（6×106個(gè)/L）于皮下注射到裸鼠中。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約60 mm3時(shí)，每3 d給裸鼠腹膜內(nèi)注射3 mg/kg 的DDP。接種后第35 天處死小鼠，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積，按照下式計(jì)算腫瘤體積：腫瘤體積=（長(zhǎng)×寬2）/2。稱取腫瘤樣品的重量并進(jìn)行分析。

1.2.8 熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)驗(yàn)證PCAT6 與miR-185之間的靶向關(guān)系 將包含miR185-5p 結(jié)合位點(diǎn)或每個(gè)位點(diǎn)突變體的野生型PCAT6 序列克隆到psi?CHECK-2質(zhì)粒中，命名為PCAT6-WT或PCAT6-MUT報(bào)告基因。待A549/DDP 細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度時(shí)，將miR185 高表達(dá)腺病毒Ad-miR-185 及空載體Ad-NC 分別與PCAT6-WT 及PCAT6-MUT 共轉(zhuǎn)染，得到PCAT6-WT+Ad-miR-185 組、PCAT6-WT+Ad-NC組、PCAT6-MUT+Ad-miR-185 組、PCAT6-MUT+Ad-NC 組，各組均于轉(zhuǎn)染后約48 h，使用雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)（Promega）測(cè)量熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 敲 低lncRNA-PCAT6 及miR-185 對(duì)A549 細(xì) 胞相關(guān)基因及SIX1蛋白表達(dá)的影響 與空白組相比，PCAT6-Si 組A549 細(xì) 胞lncRNA-PCAT6 及SIX1 表 達(dá)降低（P＜0.05），miR-185 表達(dá)升高（P＜0.05）；miR-185-Si 組細(xì)胞SIX1 表達(dá)升高（P＜0.05），miR-185 表達(dá)降低（P＜0.05），lncRNA-PCAT6 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與PCAT6-Si 組相比，PCAT6-Si+miR-185-Si 組細(xì)胞SIX1 表達(dá)升高（P＜0.05），miR-185表達(dá)降低（P＜0.05），lncRNA-PCAT6表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、表2。

表2 各組細(xì)胞lncRNA-PCAT6、miR-185 及SIX1 蛋白表達(dá)比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of protein expressions of lncRNAPCAT6，miR-185 and SIX1 in each group（s，n=6）

表2 各組細(xì)胞lncRNA-PCAT6、miR-185 及SIX1 蛋白表達(dá)比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of protein expressions of lncRNAPCAT6，miR-185 and SIX1 in each group（s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs Blank group；2）P＜0.05 vs PCAT6-Si group.

Groups Blank PCAT6-Si miR-185-Si PCAT6-Si+miR-185-Si eGFP-Si-1 eGFP-Si-2 lncRNAPCAT6 1.08±0.08 0.56±0.061）1.10±0.09 0.55±0.051）1.05±0.082）1.06±0.072）miR-185 1.04±0.07 1.62±0.151）0.59±0.061）0.12±0.012）1.02±0.102）1.01±0.092）SIX1/GAPDH 1.15±0.10 0.76±0.071）1.89±0.161）1.19±0.092）1.12±0.092）1.11±0.082）

圖1 A549細(xì)胞SIX1蛋白表達(dá)免疫印跡圖Fig.1 Western blot of expression of SIX1 protein in A549 cells

2.2 敲 低lncRNA-PCAT6 及miR-185 對(duì)A549 細(xì) 胞侵襲、遷移的影響 與空白組相比，PCAT6-Si 組A549 細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)目減少，侵襲、遷移能力降低（P＜0.05）；miR-185-Si 組侵襲、遷移能力升高（P＜0.05）。與PCAT6-Si 組相比，PCAT6-Si+miR-185-Si 組A549 細(xì)胞侵襲、遷移能力升高（P＜0.05），見圖2、表3。

表3 A549細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)目比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of number of invasion and migration of A549 cells（s，n=6）

表3 A549細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)目比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of number of invasion and migration of A549 cells（s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs Blank group；2）P＜0.05 vs PCAT6-Si group.

Groups Blank PCAT6-Si miR-185-Si PCAT6-Si+miR-185-Si eGFP-Si-1 eGFP-Si-2 Number of invasions/（cell·field-1）256.65±10.06 141.55±10.631）362.53±10.991）2）264.07±8.082）261.06±7.582）266.65±10.062）Migration number/（piece·field-1）184.66±6.51 123.65±6.611）262.44±9.481）2）187.32±4.242）185.36±4.312）189.66±6.512）

圖2 A549細(xì)胞侵襲、遷移圖（×200）Fig.2 Invasion and migration of A549 cells（×200）

2.3 lncRNA-PCAT6 及miR-185 對(duì)A549 細(xì) 胞EMT的調(diào)控 在肺癌A549 細(xì)胞胞漿中N-cadherin 陽(yáng)性表達(dá)升高。與空白組相比，PCAT6-Si 組A549 細(xì)胞N-cadherin 陽(yáng)性染色變淺，N-cadherin 及Vimen?tin 蛋白表達(dá)降低，E-cadherin 蛋白表達(dá)升高，EMT變化減輕（P＜0.05）；miR-185-Si 組EMT 變化加重（P＜0.05）。與PCAT6-Si 組相比，PCAT6-Si+miR-185-Si 組A549 細(xì)胞N-cadherin 陽(yáng)性染色加重，Ncadherin 及Vimentin 蛋白表達(dá)升高，E-cadherin 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見圖3、圖4、表4。

表4 A549細(xì)胞N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)比較（，n=6）Tab.4 Comparison of protein expressions of N-cadherin，Vimentin and E-cadherin in A549 cells（s，n=6）

表4 A549細(xì)胞N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)比較（，n=6）Tab.4 Comparison of protein expressions of N-cadherin，Vimentin and E-cadherin in A549 cells（s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs Blank group；2）P＜0.05 vs PCAT6-Si group.

圖3 肺癌A549細(xì)胞N-cadherin免疫熒光染色圖（×400）Fig.3 Immunofluorescence staining of N-cadherin in lung cancer A549 cells（×400）

圖4 A549細(xì)胞N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)免疫印跡圖Fig.4 Western blot of N-cadherin，Vimentin and E-cadherin protein expressions in A549 cells

2.4 敲 低lncRNA-PCAT6 及miR-185 對(duì)A549/DDP細(xì)胞IC50及RI 的影響 與A549 組相比，A549/DDP組細(xì)胞IC50及RI、lncRNA-PCAT6、SIX1 及P-gp 表達(dá)升高（P＜0.05），miR-185 表達(dá)降低（P＜0.05）。與A549/DDP 組 相 比，PCAT6-Si 組 細(xì) 胞IC50及RI、lncRNA-PCAT6、SIX1 及P-gp 表達(dá)降低（P＜0.05），miR-185 表達(dá)升高（P＜0.05）；miR-185-Si 組細(xì)胞IC50及RI、SIX1 及P-gp 表達(dá)升高（P＜0.05），miR-185 表達(dá)降低（P＜0.05），lncRNA-PCAT6 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與PCAT6-Si 組相比，PCAT6-Si+miR-185-Si 組細(xì)胞IC50及RI、SIX1 及P-gp 表達(dá)升高（P＜0.05），miR-185表達(dá)降低（P＜0.05），見圖5、圖6、表5。

表5 各組細(xì)胞IC50及RI表達(dá)比較（±s，n=6）Tab.5 Comparison of IC50 and RI expression in each group（±s，n=6）

表5 各組細(xì)胞IC50及RI表達(dá)比較（±s，n=6）Tab.5 Comparison of IC50 and RI expression in each group（±s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs A549 group；2）P＜0.05 vs A549/DDP group；3）P＜0.05 vs PCAT6-Si group.

圖5 各組細(xì)胞在不同濃度DDP條件下生長(zhǎng)曲線圖Fig.5 Growth curve of cells in each group under different concentrations of DDP

圖6 各組細(xì)胞SIX1、P-gp蛋白表達(dá)免疫印跡圖Fig.6 Western blot of SIX1 and P-gp protein expressions in cells of each group

2.5 敲低lncRNA-PCAT6 及miR-185 對(duì)體內(nèi)A549/DDP 細(xì)胞耐藥性的影響 為了進(jìn)一步探討lncRNAPCAT6 對(duì)A549 體內(nèi)化學(xué)敏感性的影響，將PCAT6-Si 或miR-185-Si 轉(zhuǎn) 染 的A549/DDP 細(xì) 胞 接 種 至BALB/c 裸鼠，給予1 mg/ml 的DDP 治療后發(fā)現(xiàn)，與A549組相比，A549/DDP組腫瘤體積增大（P＜0.05）。與A549/DDP 組相比，PCAT6-Si 組腫瘤體積減?。≒＜0.05）；miR-185-Si 組腫瘤體積進(jìn)一步增大（P＜0.05）。與PCAT6-Si 組相比，PCAT6-Si+miR-185-Si組腫瘤體積增大（P＜0.05），見圖7、圖8。

圖7 各組小鼠腫瘤圖Fig.7 Tumors of each group of mice

圖8 各組細(xì)胞接種后腫瘤體積比較Fig.8 Comparison of tumor volume after cell inoculation in each group

2.6 lncRNA-PCAT6對(duì)miR-185的靶向作用結(jié)果生物信息學(xué)軟件（starbase，http：//starbase.sysu.edu.cn/index. php）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，lncRNA-PCAT6 與miR-185之間有相似的結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)染lncRNA-PCAT6-WT 與Ad-miR-185 后，雙熒光素酶活性降低（P＜0.05）。lncRNA-PCAT6-MUT與Ad-miR-185共轉(zhuǎn)染組活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖9、圖10。

圖9 miRtarbase預(yù)測(cè)圖Fig.9 miRtarbase prediction chart

圖10 熒光素酶活性比較Fig.10 Comparison of luciferase activity

3 討論

肺癌一直是社會(huì)關(guān)注的話題，其研究涉及基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)水平及信號(hào)通路調(diào)控等各個(gè)領(lǐng)域［11］。肺癌早期診斷困難，術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移、化療敏感性降低，一直是阻礙肺癌治療及預(yù)后轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵問(wèn)題［12］。EMT 改變與侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥及放療抵抗關(guān)系密切。越來(lái)越多的研究證實(shí)發(fā)生EMT 的肺癌細(xì)胞更易侵入基質(zhì)，穿透血管壁，侵襲轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處器官組織，并獲得干細(xì)胞樣特性來(lái)抵御程序性細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致患者死亡［13］。RAOOF 等［14］發(fā)現(xiàn)EMT 改變可引起非小細(xì)胞肺癌多種耐藥基因發(fā)生突變，并認(rèn)為阻斷EMT 可降低EMT 介導(dǎo)的耐藥細(xì)胞的存活率。故研究肺癌EMT 機(jī)制，對(duì)促進(jìn)肺癌治療及預(yù)后轉(zhuǎn)歸有一定的臨床意義。

lncRNA-PCAT6 是一種大于200 個(gè)核苷酸的真核生物轉(zhuǎn)錄物，可通過(guò)染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄而參與相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)節(jié)［15］。DONG 等［16］發(fā)現(xiàn)lncRNAPCAT6 可直接結(jié)合綁定泛素酶USP14 誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR2）去泛素化轉(zhuǎn)錄表達(dá)，來(lái)參與三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲遷移及EMT 過(guò)程，預(yù)示lncRNA-PCAT6 異常表達(dá)可能參與調(diào)控癌細(xì) 胞EMT 生 物 學(xué) 過(guò) 程。WAN 等［17］發(fā) 現(xiàn)lncRNAPCAT6 在肺癌組織中表達(dá)高于癌旁組織，且下調(diào)lncRNA-PCAT6 表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞增殖及侵襲，并推測(cè)lncRNA-PCAT6 高表達(dá)可能是肺癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因子。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)lncRNAPCAT6 表達(dá)后，A549 細(xì)胞EMT 降低，表現(xiàn)為上皮表型標(biāo)志蛋白E-cadherin 表達(dá)升高、間質(zhì)表型標(biāo)志蛋白N-cadherin 及細(xì)胞骨架改變標(biāo)志蛋白Vimentin 表達(dá)均降低，細(xì)胞侵襲遷移能力也隨之降低，提示下調(diào)lncRNA-PCAT6 表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞EMT 進(jìn)程，降低其侵襲遷移能力，這可能為解決肺癌術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移提供新的治療策略。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，下調(diào)lncRNA-PCAT6 后，A549/DDP 的IC50及RI也顯著降低，提示lncRNA-PCAT6 低表達(dá)也可提高A549細(xì)胞的耐藥敏感性，這也可能為肺癌放化療治療后癌細(xì)胞耐藥抵抗性問(wèn)題提供新的解決思路。

本研究用生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)到lncRNA-PCAT6 與miR-185 之間有結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶驗(yàn)證進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)lncRNA-PCAT6 與miR-185 之間存在靶向負(fù)調(diào)控作用。另外裸鼠荷瘤試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲低lncRNAPCAT6 后，可降低裸鼠體內(nèi)A549 對(duì)DDP 抵抗力，并抑制腫瘤生長(zhǎng)體積，而miR-185 低表達(dá)可逆轉(zhuǎn)敲低lncRNA-PCAT6 的上述作用。曹燕飛等［8］發(fā)現(xiàn)miR-185 高表達(dá)可靶向下調(diào)SIX1 表達(dá)，抑制肺癌EMT 進(jìn)程，從而抑制肺癌侵襲、遷移作用。GE 等［9］研究發(fā)現(xiàn)miR-185 表達(dá)下調(diào)，SIX1 表達(dá)上調(diào)與非小細(xì)胞肺癌侵襲遷移及耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)升高有關(guān)，并推測(cè)miR-185/SIX1 與肺癌化療敏感性產(chǎn)生有關(guān)，有望成為肺癌DDP 耐藥的治療靶點(diǎn)，預(yù)示SIX1 與miR-185之間存在靶向調(diào)控關(guān)系，且參與肺癌EMT 及耐藥產(chǎn)生等生理活動(dòng)過(guò)程。SIX1位于14號(hào)染色體上，其在調(diào)節(jié)宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌及肺癌等癌癥進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［18］。CICERI等［19］及ZHANG 等［20］發(fā)現(xiàn)SIX1 會(huì)觸發(fā)血管生成、抑制細(xì)胞周期停滯、募集腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等刺激腫瘤淋巴管生成、促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、激發(fā)癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究下調(diào)A549細(xì)胞及其A549/DDP 耐藥細(xì)胞中miR-185表達(dá)后，檢測(cè)到SIX1表達(dá)上調(diào)的同時(shí)，細(xì)胞EMT及耐藥性均升高，證實(shí)了miR-185/SIX1 軸參與肺癌EMT 及化療敏感性發(fā)生發(fā)展過(guò)程。另外GE 等［9］還發(fā)現(xiàn)miR-185的下調(diào)可能與lncRNA 的抑制及調(diào)控關(guān)系密切。本研究也在lncRNA-PCAT6 低表達(dá)組檢測(cè)到miR-185表達(dá)上調(diào)、SIX1 表達(dá)下調(diào)，且下調(diào)miR-185 表達(dá)后，lncRNA-PCAT6 低表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞EMT 的抑制作用及對(duì)DDP耐藥性的促進(jìn)作用均得以逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，lncRNA-PCAT6 低表達(dá)可靶向上調(diào)miR-185，下調(diào)SIX1，抑制肺癌A549 細(xì)胞EMT 進(jìn)程，增強(qiáng)A549 細(xì)胞對(duì)DDP 化療的敏感性。這為肺癌復(fù)發(fā)及預(yù)后治療提供一定的思路，但肺癌侵襲、遷移及耐藥性發(fā)生的機(jī)制復(fù)雜，涉及多個(gè)miRNAs 及多種途徑的調(diào)控，肺癌治療的其他調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探究。