circ_0044516靶向miR-1281促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡①

徐 靈 艾明華 張 慶 彭小春 （長江大學(xué)醫(yī)學(xué)部，荊州434000）

食管癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，也是癌癥相關(guān)死亡的第六大原因。中國是世界食管癌高發(fā)地區(qū)之一［1］。根治性療法，包括外科手術(shù)、化學(xué)療法、放射療法或組合療法，對于改善食管癌患者生存結(jié)果非常重要，但食管癌具有高度惡性，晚期食管癌的五年生存率低于25%［2］?，F(xiàn)階段，食管癌進(jìn)展的確切診斷、預(yù)后預(yù)測和潛在機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。許多研究表明，環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）在細(xì)胞生物事件的調(diào)節(jié)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，包括增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移［3-4］。在食管癌等多種人類癌癥中，circRNA 通過競爭性內(nèi)源RNA（com?petitive endogenous RNA，ceRNA）機(jī) 制 發(fā) 揮 微 小RNA（microRNA，miRNA/miR）海綿的作用，從而削弱miRNA對其靶基因的抑制作用［5-6］。circ_0044516是一種在前列腺癌和胃癌中顯著上調(diào)的circRNA，在前列腺癌和胃癌中作為致癌基因發(fā)揮作用［7-8］。除此之外，鮮見關(guān)于circ_0044516 的其他報道。miR-1281 被發(fā)現(xiàn)是急性髓系白血病細(xì)胞中circ_0000370 的潛在靶點之一，此外miR-1281 在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移［9-10］。但食管癌中miR-1281 與circ_0044516的關(guān)系仍不清楚。因此，本研究考察circ_0044516在食管癌組織中的表達(dá)情況，對circ_0044516 在食管癌Eca109 細(xì)胞增殖和凋亡中扮演的角色進(jìn)行評價，并結(jié)合其與miR-1281 的關(guān)系探索circ_0044516的作用機(jī)制，為開發(fā)食管癌新型治療靶標(biāo)和生物標(biāo)志物提供新視角。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 新鮮的食管癌組織和相應(yīng)的癌旁組織來自長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院的39 例接受根治性切除術(shù)的患者（其中男24 例，女15 例，年齡50～75 歲，Ⅰ～Ⅱ期20 例，Ⅲ～Ⅳ期19 例）。所有患者術(shù)前均未接受過放療或化療。術(shù)后將所有食管癌和癌旁組織標(biāo)本立即保存在液氮中。本研究經(jīng)長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者在研究前均簽署了知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞與試劑 食管癌細(xì)胞株Eca109（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；si-NC、si-circ_0044516模擬物、miR-NC、miR-1281 模擬物、anti-miR-NC、miR-1281抑制物anti-miR-1281（上海GenePharma）；細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（cell count kit-8，CCK-8，日本Dojindo）；熒光素酶基因pGL3（上海Invitrogen）；Dual-Luciferase Reporter Assay Kit（美國Promega）；SYBR Green（美國Applied Biosystems）；miRNA RT 試劑盒、miRNA qPCR 試劑盒（上海TIANGEN）；活化的半胱氨酸蛋白酶（cleaved-cysteinyl aspartate specific proteinase，cleaved-caspase）3 兔單克隆抗體、cleaved-caspase9兔單克隆抗體、GAPDH 兔單克隆抗體（美國Ab?cam）；circ_0044516引物（上海Sangon Biotech）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將含有100 U/ml 鏈霉素/青霉素和10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基置于37 ℃飽和濕度下的恒溫培養(yǎng)箱中，該恒溫箱含有5%CO2，在此條件下培養(yǎng)食管癌Eca109 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前1 d，將接種于6孔板的食管癌Eca109細(xì)胞與不含抗生素的培養(yǎng)基一起培養(yǎng)過夜。當(dāng)細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)板的60%～70%時，進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。si-NC組、si-circ_0044516組、miR-NC組、miR-1281組、si-circ_0044516+anti-miR-NC 組 和si-circ_0044516+anti-miR-1281 組按照轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000 說明操作，使用si-NC、sicirc_0044516、miR-NC、miR-1281模擬物、anti-miR-NC、anti-miR-1281 與Lipo2000 混合，轉(zhuǎn)染細(xì)胞。4～6 h后，將混合物移出并用完全培養(yǎng)基替代，48 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）測定circ_0044516和miR-1281表達(dá) 食管癌組織、癌旁組織和食管癌Eca109 細(xì)胞總RNA 使用Trizol 試劑提取，在對RNA樣品進(jìn)行濃縮和純度測定后，將其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以合成cDNA 樣品，以U6 和GAPDH 為內(nèi)參。SYBR Green預(yù)混液在實時PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將miRNA RT試劑盒用于miRNA的PCR反應(yīng)，將miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，按照miRNA qPCR試劑盒中的說明進(jìn)行PCR反應(yīng)。2-ΔΔCt法對circRNA和miRNA作定量分析。除circ_0044516以外的其他引物序列如下：miR-1281 F：5'-ACACTCCAGCTGGGTCGCCTCCTCC-3'，miR-1281 R：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGGAGAGG-3'［10］；U6 F：5'-CTCGCTTCGGCAGCAGCACATATA-3'，U6 R：5'-AAATATGGAACGCTTCACGA-3'；GAPDH F：5'-GAAGAGAGAGACCCTCACGCTG-3'，GAPDH R：5'-ACTGTGAGGAGGGGA?GATTCAGT-3'。

1.2.3 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖能力 將細(xì)胞以1×104個/孔 接 種 到96 孔 板 中，轉(zhuǎn) 染 后，食 管 癌Eca109 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，并向每個孔中添加10 μl CCK-8 溶液。在37 ℃下孵育90 min，使用全自動酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測吸光度OD 值。OD 值與細(xì)胞增殖能力呈正比。

1.2.4 克隆形成實驗測定克隆形成 轉(zhuǎn)染48 h后，收集食管癌Eca109 細(xì)胞，將200 個細(xì)胞接種于6 孔板中，并在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 周。將克隆細(xì)胞用PBS 洗滌2 次，在2 ml 甲醇中固定20 min。吸出甲醇后，食管癌Eca109 細(xì)胞用0.1%結(jié)晶紫染色溶液染色20 min，用PBS 洗滌3 次，在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)。

1.2.5 Western blot 測 定cleaved-caspase3 蛋 白 和cleaved-caspase9 蛋白表達(dá) 食管癌Eca109 細(xì)胞的蛋白在RIPA 裂解液中抽提。制備適當(dāng)濃度的SDSPAGE 凝膠，每個泳道含50～80 μg蛋白。電泳后，采用濕轉(zhuǎn)移法在冰上將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。轉(zhuǎn)移膜后用Tris-HCl-Tween20緩沖鹽溶液制備的5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜1 h；加入1：1 000 稀釋的一抗（分別為抗cleaved-caspase3、cleaved-caspase9和GAPDH的抗體），4 ℃過夜，洗滌后加入1：8 000 稀釋的二抗，室溫下孵育1 h。化學(xué)發(fā)光顯影涂布，使用曝光裝置獲得蛋白條帶，通過Image J 軟件評估cleavedcaspase3、cleaved-caspase9表達(dá)。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡 測定細(xì)胞凋亡時，將食管癌Eca109 細(xì)胞（1×105個）與5 μl Annexin V-FITC 和5 μl 碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色溶液在黑暗中孵育10～20 min，然后采用FACScan流式細(xì)胞儀檢測，在FlowJo 軟件中分析凋亡細(xì)胞占比。

1.2.7 熒光素酶報告實驗分析circ_0044516 與miR-1281 的靶向結(jié)合 使用Circular RNA Interac?tome 靶標(biāo)預(yù)測軟件預(yù)測circ_0044516 與miR-1281的相互作用。為了進(jìn)行熒光素酶報告基因分析，擴(kuò)增含miR-1281 結(jié)合位點的circ_0044516 野生型（WT）、突變型（MUT）片段，并將其克隆到熒光素酶基因pGL3，構(gòu)建WT-circ_0044516、MUT-circ_0044516載體。使用Lipofectamine 2000 將150 ng 野生型載體或突變型載體與2 ng miR-1281 模擬物或miR-NC共轉(zhuǎn)染食管癌Eca109 細(xì)胞。48 h 后，使用標(biāo)準(zhǔn)化為海腎熒光素酶活性的Dual-Luciferase Reporter Assay Kit檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果表示為±s。兩組間差異通過t檢驗比較，不同組間差異通過單因素方差分析比較，組間兩兩差異通過SNK-q檢測比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circ_0044516 和miR-1281 在食管癌組織中異常表達(dá) 39例食管癌組織中circ_0044516表達(dá)量較相匹配的癌旁組織顯著增加，miR-1281 表達(dá)量較癌旁組織顯著降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 circ_0044516 和miR-1281 在食管癌組織及癌旁組織中的表達(dá)Fig.1 Expressions of circ_0044516 and miR-1281 in esophageal cancer tissues and adjacent tissues

2.2 干擾circ_0044516 表達(dá)抑制食管癌Eca109 細(xì)胞增殖 在食管癌Eca109 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-circ_0044516 干擾circ_0044516 表達(dá)，si-circ_0044516 組Eca109 細(xì)胞中circ_0044516 表達(dá)量較si-NC 組顯著降低，細(xì)胞增殖能力和平板克隆形成數(shù)也較si-NC組減少（P＜0.05），見圖2。

圖2 干擾circ_0044516表達(dá)抑制食管癌Eca109細(xì)胞增殖Fig.2 Interference with expression of circ_0044516 inhibits proliferation of esophageal cancer Eca109 cells

2.3 干擾circ_0044516 表達(dá)促進(jìn)食管癌Eca109 細(xì)胞凋亡 si-circ_0044516組食管癌Eca109細(xì)胞中凋亡率比si-NC 組升高了約3.09 倍（P＜0.05，圖3A），且cleaved-caspase3 蛋白和cleaved-caspase9 蛋白表達(dá)量均高于si-NC組（圖3B）。

圖3 干擾circ_0044516 表達(dá)對食管癌Eca109 細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of interference with expression of circ_0044516 on apoptosis of esophageal cancer Eca109 cells

2.4 circ_0044516 靶向調(diào)控miR-1281 的表達(dá) cir?cular RNA Interactome 軟件對circ_0044516 與miR-1281 的靶向結(jié)合位點進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖4A 所示。WT-circ_0044516 熒光素酶活性在miR-1281 組中較miR-NC組顯著降低（P＜0.05），而MUT-circ_0044516 熒光素酶活性在miR-1281 組、miR-NC 組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖4B。pcDNAcirc_0044516 組食管癌Eca109 細(xì)胞中miR-1281 表達(dá)量（0.26±0.02）低于pcDNA 空載體組（1.00±0.00），si-circ_0044516 組食管癌Eca109 細(xì)胞中miR-1281 表達(dá)量（3.27±0.29）高于si-NC 組（1.02±0.07，P＜0.05），見圖4C。

圖4 circ_0044516靶向調(diào)控miR-1281的表達(dá)Fig.4 circ_0044516 targets and regulates expression of miR-1281

2.5 miR-1281 過表達(dá)抑制食管癌Eca109 細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡 在食管癌Eca109 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-1281模擬物使miR-1281過表達(dá)，miR-1281 組miR-1281 表達(dá)量較miR-NC 組增加1.91 倍左右（圖5A），細(xì)胞增殖能力和克隆形成數(shù)較miR-NC 組減少（圖5B、C），而cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表達(dá)量和凋亡率較miR-NC 組升高（P＜0.05，圖5D、E）。

圖5 miR-1281 過表達(dá)抑制食管癌Eca109 細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡Fig.5 Overexpression of miR-1281 inhibits proliferation of esophageal cancer Eca109 cells and promotes cell apoptosis

2.6 下調(diào)miR-1281 表達(dá)逆轉(zhuǎn)干擾circ_0044516 表達(dá)對食管癌Eca109 細(xì)胞增殖和凋亡的作用 在食管癌Eca109 細(xì)胞中同時轉(zhuǎn)染si-circ_0044516 和an?ti-miR-1281，si-circ_0044516+anti-miR-1281 組miR-1281表達(dá)量、凋亡率、cleaved-caspase3、cleavedcaspase9 蛋白表達(dá)量均低于si-circ_0044516+antimiR-NC 組（圖6A、D、E），細(xì)胞增殖能力和克隆形成數(shù) 高 于si-circ_0044516+anti-miR-NC 組（P＜0.05，圖6B、C）。

圖6 下調(diào)miR-1281 表達(dá)逆轉(zhuǎn)干擾circ_0044516 表達(dá)對食管癌Eca109細(xì)胞增殖和凋亡的作用Fig.6 Down-regulation of miR-1281 expression reversed effect of interference with circ_0044516 expression on proliferation and apoptosis of esophageal cancer Eca109 cells

3 討論

circRNA 在食管癌在內(nèi)的癌癥中發(fā)揮多種生理上和病理上的作用［10-11］。研究表明，circ_0044516在前列腺癌患者外泌體和前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)circ_0044516可通過調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞中miR-29a-3p 的表達(dá)來抑制前列腺癌細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)移［7］。circ_0044516在胃癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞質(zhì)中circ_0044516 可能作為miR-149-5p 海綿來調(diào)節(jié)HuR 的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)胃癌異種移植小鼠體內(nèi)腫瘤生長［8］。以上研究表明circ_0044516 在前列腺癌和胃癌中具有致癌作用，但其在食管癌中發(fā)揮的功能與機(jī)制目前尚未可知。本研究通過qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，39 例食管癌組織中的circ_0044516 表達(dá)上調(diào)，提示circ_0044516 可能在食管癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。本研究在食管癌Eca109 細(xì)胞中干擾circ_0044516表達(dá)，功能實驗證實干擾前列腺癌細(xì)胞中circ_0044516 的表達(dá)會降低前列腺癌細(xì)胞的增殖、提高細(xì)胞凋亡，表明circ_0044516 是食管癌進(jìn)程中一個潛在的癌基因。

研究報道m(xù)iR-1281 在膠質(zhì)瘤組織中低表達(dá)，miR-1281 模擬物能減弱膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［12］。miR-1281 在乳腺癌組織中低表達(dá)，干擾其表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和克隆形成［13］。但miR-1281 是否能調(diào)節(jié)食管癌尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)miR-1281在食管癌組織中低表達(dá)。本研究表明，miR-1281的過表達(dá)抑制食管癌Eca109細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。本研究首次揭示了miR-1281 對食管癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，miR-1281 在食管癌中發(fā)揮抗癌作用，與既往研究相似［13-14］。

據(jù)報道，circRNA 可作為miRNA 海綿參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控［14-15］。例如，hsa_circ_RNA0023397 與miR-160b 結(jié)合抑制食管癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡［16］。hsa_circRNA6448-14作為miR-455-3p的競爭結(jié)合海綿促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生［17］。本研究使用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-1281為circ_0044516的潛在靶標(biāo)，結(jié)合雙熒光素酶報告基因分析以及qRT-PCR 分析結(jié)果進(jìn)一步證實了這一發(fā)現(xiàn)。在食管癌Eca109 細(xì)胞中下調(diào)miR-1281 表達(dá)則逆轉(zhuǎn)干擾circ_0044516 介導(dǎo)的Eca109 細(xì)胞增殖和凋亡的作用。綜上，干擾circ_0044516 可促進(jìn)miR-1281 的表達(dá)，從而抑制食管癌發(fā)生發(fā)展，表明circ_0044516靶向miR-1281調(diào)節(jié)食管癌細(xì)胞的生物功能。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)circ_0044516 在食管癌組織中表達(dá)上調(diào)，干擾circ_0044516 通過靶向miR-1281促進(jìn)食管癌Eca109 細(xì)胞凋亡和抑制增殖。本研究結(jié)果表明，circ_0044516/miR-1281 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在食管癌中可能是有前途的治療靶點。