恩施地區(qū)常見乳菇類野生菌分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

韓 玉，吳 堯，揭春玉，王 林，吳雙清

（恩施土家族苗族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 恩施 445000）

乳菇屬（Lactarius）為擔(dān)子菌亞門層菌綱傘菌目紅菇科真菌，常與樹木如馬尾松、松樹、云杉等形成外生菌根，大多為食用菌，味道鮮美，具有較高的營養(yǎng)價值和醫(yī)用價值［1，2］。利用分子生物學(xué)技術(shù)將乳菇類真菌歸為Lactarius、Lactifluus、Multifurca3 個屬［2］。

湖北省恩施土家族苗族自治州（以下簡稱恩施）地處武陵山區(qū)，是天然野生菌生長繁殖的理想場所。每年6—10 月，有一種被老百姓稱為“樅樹菌”的乳菇菌大量生長，該乳菇菌味道鮮美，但因?yàn)橄嗨凭甓啵r(nóng)民鑒別能力不強(qiáng)，常造成誤采誤食。鑒于中毒現(xiàn)象增多及生態(tài)環(huán)境保護(hù)政策，政府大力宣傳保護(hù)自然生態(tài)系統(tǒng)，禁止兜售野生菌，因此，對當(dāng)?shù)靥厣Y源的調(diào)查和開發(fā)利用成為迫切需要解決的問題。

當(dāng)前，恩施地區(qū)野生菌種類的相關(guān)報道較少。為詳細(xì)了解當(dāng)?shù)爻Ｒ娙楣綄僖吧奶匦?，本研究從分子生物學(xué)水平分析恩施地區(qū)菌株種類及其遺傳多樣性。近年來ITS 廣泛應(yīng)用于乳菇菌、羊肚菌、木耳等其他食用菌的遺傳多樣性檢測和分析上［3-6］，本研究亦采用ITS 序列分析法對恩施地區(qū)常見乳菇屬野生菌進(jìn)行分析鑒定，以期為當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)資源保護(hù)和篩選優(yōu)良可食用野生菌提供理論依據(jù)，同時促進(jìn)野生菌馴化栽培進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 在生長季節(jié)，收集恩施不同地點(diǎn)、不同時期的樣品于自封袋內(nèi)，標(biāo)記時間、地點(diǎn)后置于裝有冰袋的冷藏箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理和分離培養(yǎng)（表1）。

表1 菌株編號及來源

1.1.2 主要試劑 2×TaqPCR StarMix with Loading Dye，北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；4S Green Plus 無毒核酸染料，生工（上海）股份有限公司；50×TAE Buffer，提取DNA 試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 HH-4 型恒溫水浴鍋，金壇科興儀器廠；VoRTEX-5 型振蕩儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Centrifuge 5424R 型微量冷凍離心機(jī)，德國艾本德公司；Biometra TRIO 48 型PCR 儀，德國耶拿公司；DYY-6D 型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；Gel DocXR+型凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 提取 采用CTAB 法。

1.2.2 ITS 區(qū)段的擴(kuò)增及測序 用生工（上海）股份有限公司合成的ITS1 和ITS4 通用引物對目的基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系（50 μL）：2×TaqMaster Mix（with Dye）25 μL，DNA 1 μL，10 μmol/L ITS1 2 μL，

10 μmol/L ITS4 2 μL，ddH2O 20 μL。反 應(yīng) 程 序：94 ℃預(yù)變性，94 ℃變性1 min；55 ℃退火40 s；72 ℃延伸1 min 30 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 測序分析 將PCR 產(chǎn)物送至生工（上海）股份有限公司進(jìn)行正向測序。測得序列在GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對，根據(jù)相似性由高到低進(jìn)行排列選取最近同源物。借助MEGA 5.0 軟件將所有需要比對的序列采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進(jìn)行遺傳距離分析。外類群有紅菇屬（Russula vinosa）（AF418638.1）和 乳 菇 屬（Lactarius vividus）（KT163432.1）2 種。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴(kuò)增及電泳檢測結(jié)果

PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，均能得到目的條帶，條帶清晰，片段長度約750 bp（圖1）。

圖1 菌株P(guān)CR 電泳結(jié)果

2.2 ITS 序列比對分析

根據(jù)比對結(jié)果，發(fā)現(xiàn)24 份菌株樣品中有17 份與Lactarius vividus相似；3 份與Lactarius salmonicolor相似；3 份與Lactarius hatsudake相似；1 份與Lactifluus pilosus相似，相似性均達(dá)99%～100%（表2）。

表2 菌株ITS 序列BLAST 比對結(jié)果

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

由圖2 可知，S1、S2、S3、S4、S5、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15、S16、S22 和S23 與Lactarius vividus聚為一支（支持率為100%），S15 和S23 又分別形成一個小分支，說明這些菌株在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分類上為鮮艷乳菇；由圖3 可知，菌株S6、S17 和S21 與Lactarius salmonicolor聚為一支，支持率為65%，說明它們可能存在地理隔離，導(dǎo)致菌株間可信度不高；由圖4 可知，菌株S18、S19 和S20 與Lactarius hatsudak、Lactarius akahatsu（MN258654.1）和Lactarius deterrimus（MZ158281.1）聚為一支（支持率為59%），但S18、Lactarius akahatsu和Lactarius deterrimus都存在較長的分支，說明菌株S18、S19 和S20 可能都為紅汁乳菇，但是其親緣關(guān)系較比對的樣品更遠(yuǎn)，是否與地理隔離有關(guān)，仍需大量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明；由圖5 可知，菌株S24 與Lactifluus pilosus聚為一支，支持率為97%，證明S24 為長絨多汁乳菇。

圖2 S1、S2、S3 等系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 S6、S17 和S21 系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 S18、S19 和S20 系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖5 S24 系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 部分樣品遺傳距離分析

為了進(jìn)一步鑒定所測菌株的特性，對采集的樣akahatsu、Lactarius deterrimus遺傳距離相對較遠(yuǎn)；S24 與聚為一支的Lactifluus pilosus（MZ157882.1）遺傳距離為0。品與其聚為一支的菌株進(jìn)行遺傳距離分析（表3），發(fā) 現(xiàn)S1、S2、S3、S4、S5、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S16 和S22 與3 個最近的Lactarius vividus遺傳距離為0，而S15 和S23 與同源物存在一定的遺傳距 離；S6、S17 和S21 均 與Lactarius salmonicolor（JX852629.1）遺傳距離為0；S19 和S20 與Lactarius hatsudake遺傳距離為0，而S18 與Lactarius hatsudake存在一定的遺傳距離，S18、S19 和S20 均與Lactarius

表3 遺傳距離

綜合以上結(jié)果可知，S1、S2、S3、S4、S5、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15、S16、S22 和S23 為鮮艷乳菇；S6、S17 和S21 為鮭色乳菇；S18、S19 和S20為紅汁乳菇；S24 為長絨多汁乳菇。部分樣品在系統(tǒng)發(fā)育分析中與最近同源物之間存在一定的差異，可能是因?yàn)榈乩砀綦x造成的。

3 小結(jié)與討論

24 份恩施地區(qū)常見的乳菇類菌株資源樣品均采用ITS 序列分析法和GenBank 數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，有17 份樣品為鮮艷乳菇、3 份為鮭色乳菇、3 份為為紅汁乳菇，1 份為長絨多汁乳菇，與相關(guān)形態(tài)學(xué)描述相同［7，8］。說明恩施地區(qū)常見的野生食用菌主要以鮮艷乳菇為主，還有少量的鮭色乳菇和紅汁乳菇，但各菌株之間存在一定的差異，可能與地理隔離有關(guān)。在野生食用菌的生長采摘期，存在一些有毒菌，最易混淆的就是本試驗(yàn)采集鑒定的長絨多汁乳菇，其屬于水乳菇屬（Lactifluus），食用后可導(dǎo)致胃腸中毒［9，10］。有關(guān)長絨多汁乳菇的報道較少，恩施更是首次報道。恩施地區(qū)野生菌種類繁多，在當(dāng)?shù)乇环Q為“樅樹菌”的野生菌實(shí)則包含多個品種，同時部分有毒野生菌形態(tài)特征與其非常相近，人們不易辨別，每年都有多起中毒事故發(fā)生。本研究收集的樣品有限，是否有未收集到的資源有待進(jìn)一步取樣鑒定。下一步將增加取樣點(diǎn)，獲得更深入的研究數(shù)據(jù)，以期利用當(dāng)?shù)靥厣Y源，對適合當(dāng)?shù)厣L的野生食用菌進(jìn)行馴化和改良，發(fā)展食用菌產(chǎn)業(yè)，滿足人們對特殊食用菌的需求，為鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)振興貢獻(xiàn)力量。