兩個(gè)產(chǎn)地洋蔥的UHPLC圖譜分析及前列腺素A1含量測(cè)定

王曉婷 譚 超 王燕華 秦太峰 張乃明, 李芳艷

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2. 云南省土壤培肥與污染修復(fù)工程實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；3. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201)

洋蔥(AlliumcepaL.)又稱(chēng)為球蔥、圓蔥、玉蔥、蔥頭，為石蒜科蔥屬植物。在中國(guó)南北均有種植，由于產(chǎn)地、品種、氣候環(huán)境、土壤等因素的影響，洋蔥品質(zhì)各異。洋蔥中含有丙基二硫等硫化物[1]、芹菜素等黃酮類(lèi)化合物[2-3]、蒜氨酶等酶類(lèi)[4]、螺甾烷醇型和呋甾烷醇型的甾體皂苷化合物[5]、含氮化合物[6]以及葡萄糖[7]等多種活性成分。除此以外，洋蔥還是極少數(shù)富含前列腺素(Prostaglandin, PG)的蔬菜之一[8]。洋蔥中的PG主要包括PGA1、PGA2、PGB1、PGE1和PGF1α等[9]，具有抗炎、抗氧化、殺菌、降血壓、降血糖及預(yù)防心腦血管疾病等作用[10-11]。目前對(duì)洋蔥活性成分的研究主要集中在黃酮、多糖、含硫化合物等[12-14]，PGA1更多被應(yīng)用于臨床治療[15]，而云南與黑龍江洋蔥化學(xué)成分含量的區(qū)別及PGA1含量尚不明確。

超高效液相色譜(Ultra-High Pressure Liquid Chromatography, UHPLC)相比HPLC具有更高效率、超快速、高靈敏、應(yīng)用范圍廣及有機(jī)溶劑用量少等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于中藥材質(zhì)量控制[16]。試驗(yàn)擬采用UHPLC測(cè)定兩個(gè)產(chǎn)地洋蔥的化學(xué)成分含量與PGA1含量，以期為洋蔥后續(xù)開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

1.1.1 樣品

共采集兩個(gè)產(chǎn)地(云南省紅河州和黑龍江省齊齊哈爾市)23批洋蔥樣品，均采集自2020年(表1)。

表1 洋蔥品種與產(chǎn)地?

1.1.2 主要試劑

PGA1標(biāo)準(zhǔn)品(CAS：14152-28-4)：純度98%，北京元寶山色譜科技有限公司；

甲醇(CAS：67-56-1)、七氟丁酸(CAS：375-22-4)：色譜純，美國(guó)Fisher公司；

超純水:南京歐鎧環(huán)境科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜系統(tǒng)：Thermo Scientific UltiMate 3000型，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；

色譜柱：Diamonsil C18(2) (150 mm×4.6 mm，3.0 μm)型，北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心；

高速粉碎機(jī)：JP-500C型，浙江久品工貿(mào)有限公司；

分析天平：ME204T/02型，梅特勒—托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-4型，上海力辰邦西儀器科技有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101-2B型，上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的處理 新鮮洋蔥切碎于50 ℃鼓風(fēng)干燥12 h，粉碎后過(guò)100目篩。取洋蔥粉0.5 g置于具塞錐形瓶中，加5 mL甲醇，超聲(功率120 W、頻率40 kHz)提取30 min，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，用0.45 μm濾器過(guò)濾，即為洋蔥PGA1供試品溶液。

1.3.2 PGA1對(duì)照溶液的制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取PGA1標(biāo)準(zhǔn)品1.00 mg，用甲醇稀釋并定容至10 mL，制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 PGA1含量測(cè)定 參照孫啟良等[17]的方法，修改如下：

色譜柱：Diamonsil C18(2) (150 mm×4.6 mm，3.0 μm)，流動(dòng)相：A為0.1%七氟丁酸水溶液，B為甲醇；流速0.6 mL/min，梯度洗脫(0～5 min，5% B；5～35 min，5%～95% B；35～40 min，95% B；40～42 min，95%～5% B；42～47 min，5% B)。柱溫35 ℃，平衡時(shí)間0.5 min，進(jìn)樣體積5.0 μL；UV檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

1.3.4 方法學(xué)考察

(1) 精密度試驗(yàn)：取制備的洋蔥(W)樣品溶液，供試品溶液適量，重復(fù)進(jìn)樣6次。以PGA1為參照峰，計(jì)算PGA1峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

(2) 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取制備的洋蔥(W)樣品溶液，供試品溶液適量，在室溫條件下(20～25 ℃)放置0，2，4，8，12，24 h，進(jìn)樣。以PGA1為參照峰，計(jì)算PGA1峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

(3) 重復(fù)性試驗(yàn)：取制備的洋蔥(W)樣品溶液，制備6份供試溶液后進(jìn)樣。以PGA1為參照峰，計(jì)算PGA1峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用TBtools 1.05進(jìn)行匹配矩陣?yán)L制，SPSS 24.0進(jìn)行Pearson相關(guān)性及聚類(lèi)分析對(duì)比不同產(chǎn)地不同洋蔥樣品之間化學(xué)成分的共性和差異性，SIMCA14.0進(jìn)行PCA及OPLS-DA分析，Origin 2019b進(jìn)行PGA1含量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度試驗(yàn) PGA1峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為1.01%，相對(duì)峰面積RSD為2.13%，表明儀器精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) PGA1峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.34%，相對(duì)峰面積RSD為2.71%，表明供試品溶液在室溫條件下保持穩(wěn)定。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) PGA1峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為1.21%，相對(duì)峰面積RSD為3.25%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2 基于UHPLC洋蔥化學(xué)成分含量圖譜

取23批洋蔥樣品進(jìn)行UHPLC測(cè)定，得到洋蔥樣品疊加圖譜并對(duì)共有峰標(biāo)示(圖1)。23批洋蔥樣品共有73個(gè)共有色譜峰，出峰時(shí)間為1～48 min。對(duì)比不同批次洋蔥同一保留時(shí)間色譜峰，部分色譜峰具有差異，說(shuō)明不同產(chǎn)地洋蔥間化學(xué)成分含量具有差異。

13. 前列腺素A1

2.3 化學(xué)成分分析

對(duì)UHPLC圖譜每個(gè)峰進(jìn)行積分峰面積分析(圖2)，T、C、J、D等樣品檢出化學(xué)成分積分總峰面積較大。共有色譜峰中12，18，35，51，60號(hào)峰面積較大較明顯分辨，說(shuō)明這些峰所對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分相對(duì)含量較高。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)云南洋蔥的這些峰平均峰面積均比黑龍江洋蔥高，12，18，35，51，60號(hào)均分別高出23.84%，13.32%，21.12%，40.77%，51.51%。且云南洋蔥檢出的平均總峰面積為12 916 919，黑龍江洋蔥檢出的平均總峰面積為10 546 150，云南洋蔥比黑龍江洋蔥平均總峰面積高出22.48%，表明云南洋蔥所含化學(xué)成分含量比黑龍江洋蔥更高。

圖2 洋蔥UHPLC指紋圖譜檢出化學(xué)成分總峰面積圖

2.4 Pearson相關(guān)性及聚類(lèi)分析

對(duì)23批洋蔥樣品共有的73個(gè)化學(xué)成分變量進(jìn)行SPSS Pearson相關(guān)性及聚類(lèi)分析(圖3)。云南洋蔥樣品G、A、B、H之間化學(xué)成分含量具有相關(guān)性，相關(guān)性大于0.94；黑龍江洋蔥樣品N、Q、R、U、O、T化學(xué)成分含量具有獨(dú)立性，與其他洋蔥樣品之間相關(guān)性較低，相關(guān)性為0.39～1.00；云南洋蔥樣品I、K、E、F、C、J、D與黑龍江洋蔥樣品V、S、M、P、L、W之間化學(xué)成分含量具有相關(guān)性，相關(guān)性大于0.82，其中云南洋蔥樣品E、F、C、J、D相關(guān)性大于0.94。

從圖3可以看出，不同產(chǎn)地、不同批次的洋蔥樣品化學(xué)成分含量相關(guān)性差異不明顯，Pearson相關(guān)性及聚類(lèi)分析不能直觀區(qū)分兩個(gè)產(chǎn)地洋蔥化學(xué)成分含量直接差異性。

圖3 洋蔥樣品Pearson相關(guān)性及聚類(lèi)分析圖

2.5 主成分分析(PCA)

PCA分析通過(guò)線(xiàn)性變換降維處理，以較少的指標(biāo)反映盡可能多的信息，并對(duì)具有代表性的主成分進(jìn)行可視化[18]。所建模型累積解釋能力參數(shù)R2X=0.673>0.5，預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2=0.356<0.4，說(shuō)明模型的擬合準(zhǔn)確性差，不能夠較好充分反映數(shù)據(jù)信息，理論上R2和Q2數(shù)值大于0.4可接受，大于0.5較好，越接近1說(shuō)明模型越好[19-20]。對(duì)23批樣品進(jìn)行PCA分析，從PCA得分圖(圖4)可以直觀看出，每個(gè)點(diǎn)分布距離越遠(yuǎn)表明差異性越大，黑龍江洋蔥中Q、P、O、T與其他樣品化學(xué)成分含量差異較大，與匹配矩陣分析結(jié)果相似。其他樣品中，兩個(gè)產(chǎn)地洋蔥樣品出現(xiàn)混雜情況，無(wú)法區(qū)分不同產(chǎn)地洋蔥化學(xué)成分含量差異性。表明用PCA構(gòu)建模型未能將兩個(gè)產(chǎn)地的洋蔥化學(xué)成分含量進(jìn)行有效區(qū)分。

圖4 洋蔥樣品PCA分析圖

2.6 正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)

為更好區(qū)分兩個(gè)產(chǎn)地間洋蔥，對(duì)獲取的UHPLC數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA多元統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)SIMCA14.1軟件建模OPLS-DA分析23批洋蔥中共有的73個(gè)化學(xué)成分變量，得到OPLS-DA散點(diǎn)圖(圖5)、VIP值圖(圖6)和S-plot圖(圖7)。OPLS-DA分析相比聚類(lèi)分析、匹配矩陣和PCA分析能更有效區(qū)分兩個(gè)產(chǎn)地洋蔥中化學(xué)成分含量存在差異。圖5表明兩個(gè)產(chǎn)地洋蔥能夠較好區(qū)分，A、B、G樣品聚集，說(shuō)明化學(xué)成分含量差異較小，K、M、L樣品聚集，說(shuō)明化學(xué)成分含量差異較小，Q樣品較為特殊雖產(chǎn)自黑龍江但化學(xué)成分含量接近云南產(chǎn)洋蔥。VIP值可衡量各共有特征峰的表達(dá)模式對(duì)樣本分類(lèi)判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，從而輔助篩選質(zhì)量差異標(biāo)志物[21]。VIP>1表明該變量對(duì)所建模型的貢獻(xiàn)度高于平均水平[22]。VIP值越大對(duì)地域判別的差異性越顯著[23]。以VIP>1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選云南與黑龍江兩個(gè)產(chǎn)地洋蔥間化學(xué)成分含量差異的主要標(biāo)志性物質(zhì)。創(chuàng)建模型后自動(dòng)擬合獲得累積解釋能力參數(shù)R2X=0.537>0.5，累積解釋能力參數(shù)R2Y=0.775>0.5，說(shuō)明53.7%的變量可解釋77.5% 的組間差異。預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2=0.625>0.5，表示該模型穩(wěn)定可靠，且能夠較好充分反映數(shù)據(jù)信息，具有較好的預(yù)測(cè)能力，能夠?qū)蓚€(gè)產(chǎn)地之間的化學(xué)成分含量進(jìn)行正確分類(lèi)，后續(xù)可用于化學(xué)成分含量之間的區(qū)分。

圖5 洋蔥樣品OPLS-DA分析圖

OPLS-DA模型置換檢驗(yàn)permutation test，以確定模型是否過(guò)擬合。云南(圖6)與黑龍江(圖7)洋蔥的permutation test結(jié)果表明，兩組樣本結(jié)果在y軸上的截距小于0，模型沒(méi)有過(guò)擬合，具有較好的預(yù)測(cè)能力。

圖6 黑龍江洋蔥的OPLS-DA 置換檢驗(yàn)圖

圖7 云南洋蔥的OPLS-DA置換檢驗(yàn)圖

提取OPLS-DA模型中變量重要性投影(VIP)圖，見(jiàn)圖8，以VIP值>1.0為標(biāo)準(zhǔn)篩選化學(xué)成分差異標(biāo)志物，在云南與黑龍江兩個(gè)產(chǎn)地洋蔥間共得到11個(gè)VIP值>1的共有峰，分別為60號(hào)峰(VIP值為4.75)、51號(hào)峰(VIP值為3.50)、35號(hào)峰(VIP值為1.90)、2號(hào)峰(VIP值為1.80)、71號(hào)峰(VIP值為1.60)、15號(hào)峰(VIP值為1.50)、53號(hào)峰(VIP值為1.40)、32號(hào)峰(VIP值為1.30)、66號(hào)峰(VIP值為1.20)、18號(hào)峰(VIP值為1.25)、12號(hào)峰(VIP值為1.10)。說(shuō)明這些峰所代表的化學(xué)成分是造成云南與黑龍江產(chǎn)地洋蔥間化學(xué)成分含量差異的主要標(biāo)志性物質(zhì)[24]，但這些成分還有待于進(jìn)一步鑒別。S-plot圖(圖9)，差異性化合物分布在S型曲線(xiàn)的上下端，右上端VIP值大于1的差異化合物色譜峰60，51，35，15，53，32，66，18，12，表示云南洋蔥中峰面積較大的化合物，云南洋蔥中這些化合物含量顯著高于黑龍江洋蔥。左下端VIP值大于1的差異化合物色譜峰2，71，表示云南洋蔥中峰面積較小的化合物，表示云南洋蔥中這些化合物含量顯著低于黑龍江洋蔥。

圖8 洋蔥樣品OPLS-DA VIP值圖

圖9 洋蔥樣品OPLS-DA S-plot圖

2.7 不同產(chǎn)地洋蔥中PGA1的含量分析

PGA1是洋蔥中特征活性成分，云南的10批洋蔥樣品PGA1平均含量為(197.21±63.22) mg/kg，黑龍江的13批洋蔥樣品PGA1平均含量為(121.37±43.12) mg/kg(圖10)。洋蔥中營(yíng)養(yǎng)活性成分的累積受品種、種植環(huán)境、光照、生長(zhǎng)溫度、土壤、施肥等因素的影響。從日照角度來(lái)看，洋蔥屬于長(zhǎng)日照作物，在中國(guó)北方多種植長(zhǎng)日照晚熟種，日照剛好擁有適宜于鱗莖膨大和抽薹開(kāi)花所需的14 h以上長(zhǎng)日照條件。而中國(guó)南方多種植短日照早熟品種，在高溫短日照條件利于長(zhǎng)葉不利于形成蔥頭。從PGA1含量來(lái)看云南洋蔥中PGA1含量比黑龍江的洋蔥更高，可能短日照更能促進(jìn)PGA1累積。從溫度對(duì)營(yíng)養(yǎng)活性成分的累積來(lái)看，洋蔥適宜的生長(zhǎng)溫度為13～26 ℃，種子和鱗莖可在3～5 ℃下發(fā)芽[25]。云南省紅河州建水縣年平均氣溫19 ℃[26]。黑龍江齊齊哈爾年平均氣溫3.9 ℃[27]。南方更適宜于洋蔥生長(zhǎng)和PGA1累積，當(dāng)然PGA1的累積可能受多種因素影響，還可能與土壤、施肥[28]等因素相關(guān)，張鄭等[29]研究表明環(huán)境條件及土壤理化性質(zhì)不同，洋蔥品質(zhì)差異較大。因此影響洋蔥中營(yíng)養(yǎng)活性成分含量的具體因素有待于進(jìn)一步研究。

圖10 不同產(chǎn)地洋蔥中PGA1含量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

洋蔥超高效液相色譜化學(xué)成分含量圖譜共標(biāo)定73個(gè)共有色譜峰，通過(guò)OPLS-DA分析有效區(qū)分出云南和黑龍江兩個(gè)產(chǎn)地洋蔥的化學(xué)成分含量，結(jié)合VIP值>1、P<0.05 和S-plot分析共篩選出11種主要差異標(biāo)志物。云南洋蔥前列腺素A1平均含量[(197.21±63.22) mg/kg]顯著高于黑龍江洋蔥[(121.37±43.12) mg/kg]，可能與種植環(huán)境等諸多因素有關(guān)。但試驗(yàn)僅對(duì)不同產(chǎn)地中洋蔥化學(xué)成分含量與前列腺素A1含量的差異進(jìn)行探索，今后可以通過(guò)擴(kuò)大采樣范圍及采集品種的方法，調(diào)查生長(zhǎng)環(huán)境和栽培技術(shù)，獲取更多的樣本信息進(jìn)行分析，可為洋蔥后續(xù)的深入開(kāi)發(fā)利用提供更多依據(jù)。