刺五加浸膏對手機(jī)輻射剝奪睡眠果蠅的影響*

卞宏生，岳驪酈，沙吾列西·木拉提別克，毛登烜，郭紅麗，黃莉莉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)院藥學(xué)院，哈爾濱 150040)

隨著移動通信技術(shù)的進(jìn)步，手機(jī)與我們的日常生活密不可分。手機(jī)在使用時(shí)會產(chǎn)生電磁波，一部分會被我們的身體吸收，從而形成手機(jī)輻射[1]。我國現(xiàn)行《電磁環(huán)境控制限制》(GB8702-2014)中對公眾照射限值進(jìn)行規(guī)定，其中手機(jī)頻段限值是0.4 W·(m2)-1[1]。通過對大量文獻(xiàn)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)手機(jī)輻射對神經(jīng)系統(tǒng)[2-6]、內(nèi)分泌系統(tǒng)[7-10]、生殖系統(tǒng)[11-12]有不同程度的損害，尤其影響人類睡眠，且存在性別差異和年齡差異[13-15]。

睡眠是一種適應(yīng)個(gè)人需要并受到許多外部和內(nèi)部刺激影響的行為。除了具有適應(yīng)性行為外，睡眠還可以在神經(jīng)元之間的突觸連接水平上調(diào)節(jié)大腦的可塑性，而神經(jīng)元的可塑性會影響睡眠[16]。對于睡眠研究的模式生物由線蟲到斑馬魚逐漸發(fā)展到大鼠[17]，近年來因?yàn)楣壟c哺乳動物具有很多相同的重要特征而作為睡眠研究的新寵[18]。

近年來將果蠅用于輻射研究涉及基因、細(xì)胞。2020年AYA等[19]研究2.45 GHz微波對果蠅的生理和行為影響，檢測到與微波輻射有關(guān)的遺傳毒性和行為變化，歸因于波的非熱效應(yīng)，并且觀察到存在性別差異。PARK等[20]將果蠅照射后表皮為模型用于生物監(jiān)測，定量分析細(xì)胞形態(tài)。李志輝等[21]通過建立手機(jī)輻射剝奪果蠅睡眠模型，實(shí)時(shí)連續(xù)監(jiān)測果蠅在光照、RF[1 800 MHz，1 W·(m2)-1，12 h·d-1]及黑暗條件下的行為變化，對比分析各條件下果蠅運(yùn)動和睡眠的異同。

刺五加具有益氣健脾、補(bǔ)腎安神的功效，能夠治療失眠、多夢、健忘癥等。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)刺五加對睡眠節(jié)律有調(diào)節(jié)作用，在治療失眠、神經(jīng)衰弱等方面有顯著療效。研究發(fā)現(xiàn)刺五加中有多種成分均具有使患者提前入睡、增加睡眠時(shí)間和深度的功效[22]。刺五加對睡眠節(jié)律有調(diào)節(jié)作用，可減少24 h持續(xù)黑暗環(huán)境下果蠅的片段化睡眠[23]。芮施等[24]以小鼠為模式生物研究發(fā)現(xiàn)，刺五加鎮(zhèn)靜催眠作用機(jī)制為上調(diào)腦組織中5-羥色胺(5-HT)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)水平。刺五加可用于輻射研究，基于Nrf2-ARE通路對復(fù)方四物湯加味方中抗輻射的有效活性成分進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)金絲桃苷具有很好的活性作用[25]。以上研究為本實(shí)驗(yàn)探究刺五加浸膏對手機(jī)輻射剝奪果蠅睡眠的干預(yù)作用提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 野生型Canton S品系黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)，由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 蔗糖(分析純，天津市化學(xué)試劑一廠，批號：20090410)；瓊脂(細(xì)菌學(xué)級，產(chǎn)地日本，批號：20090328)；丙酸 (分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號：20091008)；酵母粉(食品級，安琪酵母股份有限公司，批號：20181221)；玉米粉(食品級)；刺五加浸膏(刺五加苷B含量為0.546%，刺五加苷E含量為0.328%，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理教研室提供)；二氧化碳(CO2)麻醉裝置(自制)；果蠅雌雄分離裝置(自制)；果蠅活動監(jiān)測系統(tǒng)(drosophila activity monitor system，DAMS)(版本v3.03，Trikinetics Inc.Waltham，MA，USA)。

1.3實(shí)驗(yàn)環(huán)境 空白對照組：采用自動定時(shí)光控系統(tǒng)對果蠅生活環(huán)境實(shí)行每天12 h ：12 h明暗光照周期處理，光照強(qiáng)度為400 lx，溫度(24±1) ℃，相對濕度50%～60%。模型對照組和給藥組：根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對果蠅生活環(huán)境實(shí)行手機(jī)輻射干預(yù)，輻射量：30～190 μW·(cm2)-1，干預(yù)點(diǎn)：20：00—22：00，每30 min撥打電話10 min。注意在睡眠剝奪造模時(shí)，手機(jī)靜音、息屏，且排除光刺激及聲音刺激等影響，單純?yōu)榇艌鲚椛涓深A(yù)。其余條件同空白對照組。

1.4實(shí)驗(yàn)分組 以7日齡野生型Canton S品系黑腹果蠅作為觀察對象。收集8 h內(nèi)羽化未交配的果蠅，CO2輕微麻醉后區(qū)分雌、雄，隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組，低、中、高濃度給藥組，每組32只。將新生果蠅置于相應(yīng)環(huán)境中飼養(yǎng)，待用。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1果蠅培養(yǎng)基的制備 ①基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備。將玉米粉42 g與三級水160 mL充分?jǐn)嚢杌靹?，配成A溶液備用。將蔗糖31 g、瓊脂3 g和三級水300 mL充分?jǐn)嚢琛⒒靹?，加熱煮沸至瓊脂完全融化，將上述A溶液緩慢加入，并不斷攪拌，煮沸至糊狀后停止加熱。待溫度降至約70 ℃，加入酵母粉3 g，充分?jǐn)嚢?，接著加入丙? mL，并快速攪拌均勻，趁熱立即分裝于潔凈的培養(yǎng)基管中(培養(yǎng)基若不慎附于管壁上，應(yīng)舍去重新分裝)，厚度約2 cm，待培養(yǎng)基完全凝固后，將培養(yǎng)管倒置于操作室內(nèi)，靜置24 h后方可使用。②含藥培養(yǎng)基配制。準(zhǔn)確稱取不同質(zhì)量的刺五加浸膏，見表1，同法進(jìn)行制備，浸膏與酵母粉同時(shí)加入，充分?jǐn)嚢枋蛊渚鶆蚍稚ⅰ?/p>

表1 不同濃度含藥培養(yǎng)基的配方Tab.1 Formulation of medicated medium with different concentrations

1.6果蠅飼養(yǎng)及監(jiān)測 ①空白對照組：果蠅給予基礎(chǔ)培養(yǎng)基飼養(yǎng)5 d，于第6天移入監(jiān)測管中，適應(yīng)12 h。

輕微麻醉，用毛筆逐個(gè)裝入細(xì)小玻璃管(內(nèi)徑5 mm，長65 mm，一端內(nèi)裝入基礎(chǔ)培養(yǎng)基后用黑色小帽密封，另一端用棉球封住)。采用DAMS，在12 h ：12 h光照-黑暗交替條件下監(jiān)測果蠅早7 ：00至次日早7 ：00的睡眠。DAMS數(shù)據(jù)采集軟件每隔5 min自動記錄一次活動次數(shù)。若持續(xù)5 min以上活動次數(shù)記錄為零，即果蠅靜止時(shí)間持續(xù)>5 min時(shí)，就認(rèn)為果蠅處于睡眠狀態(tài)，其他時(shí)間為果蠅處于覺醒時(shí)間[15]。②模型對照組：將手機(jī)置于監(jiān)測儀旁，以輻射量30～190 μW·(cm2)-1，20：00—22：00，每30 min撥打電話10 min(將手機(jī)置于距監(jiān)測儀1 cm處，使用電磁場輻射監(jiān)測儀對手機(jī)輻射進(jìn)行測量，確保輻射量在穩(wěn)定范圍內(nèi))對果蠅進(jìn)行干預(yù)，其余條件同空白對照組。③給藥組：果蠅給予含藥培養(yǎng)基。小管一端內(nèi)裝入的是含藥培養(yǎng)基。其余條件同模型對照組。

2 結(jié)果

2.1刺五加干預(yù)對果蠅睡眠-覺醒節(jié)律的影響 結(jié)果見圖1和圖2。通過圖1分析可知，空白對照組雄果蠅白天(7：00—19：00)和夜晚(19：00—7：00)較多處于睡眠狀態(tài)。與空白對照組比較，模型對照組果蠅白天(7：00—19：00)集中處于睡眠狀態(tài)，夜晚(20：00—22：00，圖中紅色框區(qū)域，藍(lán)框?yàn)榭瞻讓φ战M對照區(qū)域)期間因進(jìn)行手機(jī)輻射干預(yù)，果蠅睡眠、覺醒出現(xiàn)交替性變化現(xiàn)象(片段化睡眠)，在干預(yù)結(jié)束后(22：10—7：00)，果蠅又恢復(fù)睡眠狀態(tài)，這一現(xiàn)象表明手機(jī)輻射對果蠅睡眠具有負(fù)性影響作用。與模型對照組比較，3個(gè)給藥組果蠅在輻射干預(yù)期間片段化睡眠減少，睡眠時(shí)長呈增長狀態(tài)，其中低濃度給藥組的睡眠-覺醒節(jié)律變化最為明顯，同時(shí)與空白對照組的節(jié)律分布也最為接近。圖2結(jié)果顯示，空白對照組雌果蠅白天(7：00—19：00)集中處于覺醒狀態(tài)，夜晚(19：00—7：00)集中處于睡眠狀態(tài)。與空白對照組比較，模型對照組果蠅，白天(7：00—19：00)集中處于覺醒狀態(tài)，夜晚(20：00—22：00，圖中紅色框區(qū)域，藍(lán)框?yàn)榭瞻讓φ战M對照區(qū)域)期間因進(jìn)行手機(jī)輻射干預(yù)，果蠅睡眠、覺醒出現(xiàn)交替性變化現(xiàn)象(片段化睡眠)，在干預(yù)結(jié)束后(22：10—7：00)，果蠅又恢復(fù)睡眠狀態(tài)，這一現(xiàn)象表明手機(jī)輻射對果蠅睡眠具有負(fù)性影響作用。與模型對照組比較，給藥組果蠅在輻射干預(yù)期間片段化睡眠減少，睡眠時(shí)長呈增長狀態(tài)，其中高濃度給藥組睡眠-覺醒節(jié)律變化最為明顯，同時(shí)與空白對照組的節(jié)律分布也最為接近。

白色部分表示活動，黑色部分表示睡眠。圖1 刺五加干預(yù)后雄果蠅的睡眠-覺醒節(jié)律圖The white is activity, the black is sleep.Fig.1 Sleep wake rhythm of male Drosophila melanogaster after Acanthopanax senticosus intervention after Acanthopanax senticosus intervention

白色部分表示活動，黑色部分表示睡眠。圖2 刺五加干預(yù)后雌果蠅的睡眠-覺醒節(jié)律圖The white is activity, the black is sleep.Fig.2 Sleep wake rhythm of female Drosophila melanogaster after Acanthopanax senticosus intervention

2.2刺五加對手機(jī)輻射后的果蠅睡眠時(shí)間變化的影響研究 結(jié)果見表2。通過表2分析可知，與空白對照組比較，模型對照組雄、雌果蠅夜晚12 h內(nèi)睡眠時(shí)間減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明造模成功。與模型對照組比較，雄性低濃度給藥組白天、夜晚、全天睡眠時(shí)間明顯延長，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，高濃度給藥組白天、全天睡眠時(shí)間明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。與模型對照組比較，雌性中濃度給藥組白天睡眠時(shí)間明顯縮短，高濃度給藥組夜晚睡眠時(shí)間明顯延長，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 刺五加干預(yù)對雄雌果蠅平均睡眠時(shí)間的影響Tab.2 Effect of Acanthopanax senticosus intervention on average sleep time of male and female Drosophila melanogaster

3 討論

本課題組自2014年起，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)，一直進(jìn)行黑龍江道地藥材刺五加與睡眠-覺醒節(jié)律的研究。先后利用果蠅模式生物，發(fā)現(xiàn)刺五加具有增加果蠅連續(xù)活動時(shí)間，減少片段化睡眠，影響睡眠節(jié)律的作用[23]；其主要成分刺五加總苷和刺五加苷B對果蠅睡眠時(shí)間、睡眠-覺醒節(jié)律和睡眠時(shí)間百分比的影響特征[27]。通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，課題組初步得出“刺五加可能通過調(diào)節(jié)生物節(jié)律來改善果蠅的睡眠”。

生物鐘是調(diào)節(jié)大多數(shù)生物的許多行為和生理參數(shù)的先天計(jì)時(shí)機(jī)制。在現(xiàn)代生活中，高頻率使用手機(jī)對生物產(chǎn)生了巨大的壓力，因?yàn)殡姶泡椛渫ǔΠㄉ锕?jié)律在內(nèi)的生物系統(tǒng)造成不同程度的損害。研究表明持續(xù)暴露于低強(qiáng)度微波輻射可能會通過改變晝夜節(jié)律系統(tǒng)和DNA損傷速率對大腦功能產(chǎn)生不利影響[28]。不僅果蠅長時(shí)間暴露于手機(jī)信號電磁輻射可能會引起運(yùn)動障礙[29]，而且生物體許多其他行為變量也會在暴露于射頻電磁場后發(fā)生變化[30-31]。手機(jī)輻射在一定程度上影響生物體的睡眠，而睡眠會影響整個(gè)動物界的神經(jīng)行為表現(xiàn)。因此，為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一假說，課題組通過查閱文獻(xiàn)并結(jié)合當(dāng)前人們普遍實(shí)際，在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，探討刺五加對手機(jī)輻射下的果蠅睡眠時(shí)長及節(jié)律特征。

果蠅睡眠-覺醒圖的應(yīng)用是研究果蠅睡眠節(jié)律的主要分析方法[32]，也是本研究的特色和難點(diǎn)。動物的節(jié)律研究往往存在數(shù)據(jù)量龐大、不易統(tǒng)計(jì)分析、難以發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)規(guī)律等問題。為了解決這些問題，課題組結(jié)合國外研究方法，并通過前期研究從硬件參數(shù)的精確設(shè)置和軟件自主編程兩個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)成本實(shí)驗(yàn)的特色技術(shù)。從而解決果蠅睡眠監(jiān)測的大數(shù)據(jù)的分析問題，保障本項(xiàng)目的順利實(shí)施。①在硬件方面。DAMS是支持項(xiàng)目順利實(shí)施的關(guān)鍵儀器之一。該儀器是在不損傷果蠅的前提下，通過果蠅撞擊紅外光束IR，判斷果蠅活動次數(shù)。DAMS系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集軟件每隔5 min自動記錄一次活動次數(shù)。每天累計(jì)采集288個(gè)數(shù)據(jù)。若持續(xù)>5 min活動次數(shù)記錄為零，即果蠅靜止時(shí)間持續(xù)>5 min時(shí)，就認(rèn)為果蠅處于睡眠狀態(tài)。②在軟件方法。應(yīng)用Visual Basic語言編程繪制睡眠-覺醒節(jié)律圖，是支持項(xiàng)目順利實(shí)施的第二個(gè)關(guān)鍵技術(shù)。該節(jié)律圖是通過將果蠅活動數(shù)值數(shù)字化得到的，在區(qū)分活動數(shù)值0或非0的基礎(chǔ)上繪制每一個(gè)點(diǎn)，提供一個(gè)確定睡眠-覺醒相位的簡易方法。其統(tǒng)計(jì)方法具有效率高、誤差小、不易出錯(cuò)等優(yōu)點(diǎn)，對睡眠-覺醒節(jié)律的深入研究具有一定的參考價(jià)值，方便進(jìn)行大數(shù)據(jù)的整體定性分析。

基于此，本研究初步從果蠅睡眠-覺醒節(jié)律和睡眠時(shí)間，定性和定量兩個(gè)方面分析刺五加干預(yù)后果蠅在手機(jī)輻射下的睡眠情況。定性的節(jié)律圖分析，可以從整體上了解果蠅睡眠-覺醒的大致分布情況，便于發(fā)現(xiàn)差異性規(guī)律，而定量的睡眠時(shí)間分析，可以找到這種差異性規(guī)律的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

通過果蠅睡眠-覺醒圖和平均睡眠時(shí)間的定性定量分析發(fā)現(xiàn)：刺五加浸膏對手機(jī)輻射條件下果蠅的睡眠時(shí)間和睡眠-覺醒節(jié)律的負(fù)性影響具有正向干預(yù)作用，但雌雄果蠅的特征不同，其最佳劑量也不同。這可能是果蠅的性別差異決定的[24，33]。 刺五加通過減少輻射干預(yù)期間果蠅的片段化睡眠，增加睡眠時(shí)長，改善果蠅的睡眠-覺醒節(jié)律狀態(tài)。雄果蠅2%給藥劑量白天、夜晚、全天睡眠時(shí)間明顯延長，其睡眠-覺醒節(jié)律變化最為明顯，與空白對照組節(jié)律分布也最為接近；雌果蠅8%給藥劑量夜晚睡眠時(shí)間明顯延長，其睡眠-覺醒節(jié)律變化最為明顯，與空白對照組的節(jié)律分布也最為接近。此外，手機(jī)輻射對雌雄果蠅的干預(yù)表現(xiàn)基本相同。表現(xiàn)為：雌雄果蠅夜晚手機(jī)輻射干預(yù)期間(20：00—22：00)，果蠅睡眠、覺醒出現(xiàn)交替性變化現(xiàn)象(片段化睡眠)，在干預(yù)結(jié)束后(22：10—7：00)，果蠅又恢復(fù)睡眠狀態(tài)，這一現(xiàn)象表明手機(jī)輻射對果蠅睡眠具有負(fù)性影響作用。這一現(xiàn)象與文獻(xiàn)[34]報(bào)道基本一致。

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，雌雄果蠅的睡眠-覺醒特征和對刺五加干預(yù)的反映均不同。因此，在研究中應(yīng)該考慮果蠅性別的差異性。作為一種模式生物，雌果蠅白天較多處于覺醒狀態(tài)，夜晚較多處于睡眠狀態(tài)的節(jié)律分布規(guī)律，與人類的行為更加吻合。因此，在手機(jī)輻射對果蠅干預(yù)作用基本相同的基礎(chǔ)上，筆者認(rèn)為選擇雌果蠅作為此類研究的模式生物，人們對果蠅睡眠行為和藥物干預(yù)研究更便捷。另外，盡管4%給藥劑量雌果蠅的白天睡眠時(shí)間呈縮短趨勢，但從節(jié)律圖分析，其睡眠-覺醒節(jié)律的分布與其他組白天較多處于覺醒狀態(tài)，夜晚較多處于睡眠狀態(tài)的基本規(guī)律吻合，其進(jìn)行手機(jī)輻射剝奪研究，更重要的是觀察夜晚手機(jī)輻射干預(yù)期間(20：00—22：00)的睡眠時(shí)間和節(jié)律變化，因此，其白天睡眠時(shí)間縮短的趨勢，不影響整體節(jié)律的分析。

此外，本研究有一定的局限性，首先，果蠅的節(jié)律也會受到自然、人為的環(huán)境影響。本研究在黑龍江省冬季進(jìn)行，這個(gè)地區(qū)較其他地區(qū)更為寒冷，未來可以在一些氣候溫暖的地區(qū)實(shí)驗(yàn)，來觀察結(jié)果是否有所不同。其次，在實(shí)驗(yàn)中使用手機(jī)輻射，未來的研究應(yīng)該采用其他種類的輻射，如電腦屏幕、WIFI、電磁爐、微波爐、信號基站、高壓變壓器等。第三，使用果蠅的數(shù)量較少，在以后的實(shí)驗(yàn)中，可以采用大數(shù)據(jù)來觀察結(jié)果的重復(fù)性及有效性。第四，刺五加的不同功效與刺五加中不同成分密切相關(guān)，而此實(shí)驗(yàn)中并沒有分開其成分進(jìn)行探究，接下來會對其成分探索看其相關(guān)性。第五，本實(shí)驗(yàn)的對象種類單一，后期實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)行多物種實(shí)驗(yàn)，從而增加其普遍性。