甘草素對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞放療敏感性的影響

代軍強(qiáng)， 劉鑫， 李甸源

（1.鄭州人民醫(yī)院放療科，河南鄭州 450000；2.許昌市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南許昌 461000；3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院放療科，河南鄭州 450052）

肺癌是臨床常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率、死亡率居全球所有癌癥首位，且呈逐年上升的趨勢(shì)。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是除小細(xì)胞肺癌之外的所有肺上皮癌，主要包括腺癌、鱗狀細(xì)胞及大細(xì)胞癌，占肺癌總數(shù)的75%～80%[1-2]。目前，NSCLC的臨床治療以手術(shù)為主，并聯(lián)合術(shù)前后的輔助治療，包括放療、化療、免疫治療、靶向治療，控制腫瘤進(jìn)展或復(fù)發(fā)[3]。其中，放療作為重要的輔助治療手段對(duì)提高治療效果、改善患者預(yù)后具有重要的意義，但腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的耐受性降低了其療效[4]。因此，探討NSCLC放療耐受性機(jī)制以及尋找提高腫瘤細(xì)胞放療敏感性的藥物成為研究熱點(diǎn)。甘草素是從中藥甘草中提取的二氫黃酮化合物，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤等多種生物學(xué)效應(yīng)[5-6]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，甘草素可增加三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和BT549對(duì)多柔比星的敏感性，提高治療效果[7]。另外，有研究[8]證實(shí)，甘草素可增加肺癌細(xì)胞株H1299放療敏感性，抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡?；诟什菟鼐哂性黾踊熂胺暖熋舾行缘淖饔?，本研究以非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，探討甘草素對(duì)NSCLC細(xì)胞放療敏感性的影響及其可能的作用機(jī)制，為甘草素相關(guān)藥物的研發(fā)及NSCLC的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)人NSCLC細(xì)胞株A549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。復(fù)蘇人NSCLC細(xì)胞A549，加至體積分?jǐn)?shù)10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基（NaHCO32.5 g/L、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素），置于體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37℃恒溫恒濕密閉培養(yǎng)箱中，于鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院培養(yǎng)。

1.2 藥品、試劑與儀器甘草素（純度≥98%，分子式：C15H12O4，分子量：256.25，批號(hào)：JOT-10442，成都普菲德生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）；miR-21擬似物（miR-21 mimics）和miR-21擬似物陰性對(duì)照（miR-21 mimics-NC）（廣州市銳博生物科技有限公司）；Lipofectamine 2000（美國invitrogen公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）（美國Sigma Aldrich公司）；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin VFITC）凋亡檢測(cè)試劑盒（美國BD公司）；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒（美國Promaga公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；兔抗人蛋白絡(luò)氨酸磷酸酶MEG2、β-actin等抗體和羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的免疫球蛋白（IgG）抗體（英國Abcam公司）。直線加速器（美國瓦里安醫(yī)療系統(tǒng)公司）；多功能酶標(biāo)儀、蛋白凝膠電泳儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 CCK-8細(xì)胞毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度甘草素對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)期A549細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，接種至96孔板，貼壁培養(yǎng)12 h后，加入不同濃度甘草素（0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L），另設(shè)空白組，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。24 h后，加入10μL的CCK-8試劑于培養(yǎng)箱中孵育4 h，應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀于波長450 nm處檢測(cè)光密度（OD）值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，增殖抑制率=（1-不同濃度藥物OD值/空白組OD值）×100%。后續(xù)實(shí)驗(yàn)需聯(lián)合射線共同作用，因此選取接近于20%抑制濃度（IC20）的甘草素濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞放療敏感性 取對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，接種于6孔板，培養(yǎng)基中加入0.2 mmol/L甘草素作用48 h。另設(shè)空白組，采用不同劑量（0、2、4、6、8 Gy）6 MV-X射線室溫照射，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。照射野：10 cm×10 cm；源皮距：100 cm；劑量率：1 Gy/min。照射完畢，PBS清洗，甲醇固定30 min，Giemsa染色20 min，流水沖洗，室溫干燥，倒置顯微鏡下觀察。計(jì)算：克隆形成率=克隆細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)；細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（survival fraction，SF）=照射后細(xì)胞克隆形成率/照射細(xì)胞克隆形成率。根據(jù)單擊多靶模型方程[9]：合細(xì)胞存活曲線，計(jì)算平均致死劑量（mean lethal dose，D0）和N，準(zhǔn)閾劑量（quasi-threshold，Dq）=D0lnN，其中D為放射劑量，N為外推數(shù)或靶數(shù)。放射增敏比（sensitization enhancement ratio，SER）定義：達(dá)到相同生物學(xué)效應(yīng)時(shí)，單純照射的劑量/藥物干預(yù)照射的劑量，SERD0=空白組D0/干預(yù)組D0，SERDq=空白組Dq/干預(yù)組Dq。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將A549細(xì)胞按1×105個(gè)/mL接種于6孔板，隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、甘草素組、miR-21 mimics-NC組、miR-21 mimics組、甘草素+miR-21 mimics組。待細(xì)胞密度為70%時(shí)，對(duì)照組、甘草素組加入等體積分?jǐn)?shù)Lipofectamine 2000的完全培養(yǎng)液，miR-21 mimics-NC組轉(zhuǎn)染miR-21 mimics-NC，miR-21 mimics組、甘草素+miR-21 mimics組轉(zhuǎn)染miR-21 mimics。按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染：分別使用250μL Opti-MEM稀釋5μL Lipofectamine 2000和5μL miR-21 mimics-NC或miR-21 mimics，孵育5 min后，將2種稀釋物混合，形成復(fù)合物，將復(fù)合物加入6孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果，確定轉(zhuǎn)染效果良好后，甘草素組、甘草素+miR-21 mimics組加入0.2 mmol/L甘草素，其余各組加入等量細(xì)胞培養(yǎng)液作用24 h，采用4 Gy 6 MV-X射線照射后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 收集各組細(xì)胞，PBS重懸，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，接種至96孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。貼壁培養(yǎng)12 h后，加入10μL CCK-8試劑。培養(yǎng)箱中孵育4 h后，應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀于波長450 nm處檢測(cè)OD值。計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力：細(xì)胞相對(duì)活力（%）＝（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 收集各組細(xì)胞，4℃預(yù)冷的PBS清洗2次，以1 200 r/min（離心半徑8 cm）離心10 min，加入500μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。先后加入5μL Annexin V-FITC和PI室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組A549細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）法檢測(cè)細(xì)胞miR-21、MEG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量 收集各組細(xì)胞，用TRIzol試劑提取組織中總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度[OD（260 nm）/OD（280 nm）]，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)條件：30℃10 min，42℃30 min，99℃5 min，4℃5 min。產(chǎn)物cDNA按照定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃5 min，94℃20 s，60℃20 s，40個(gè)循環(huán)。分別以U6和GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-21和MEG2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR Primer sequences

1.3.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-21與MEG2的靶向關(guān)系 通過Starbase V2.0、PicTar、TargetScan等數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)分析miR-21與MEG2之間的結(jié)合位點(diǎn)，將MEG2的3’UTR區(qū)域，插入雙熒光素酶報(bào)告基因pmirGLO中，構(gòu)建野生型pmirGLO-MEG2-3’-UTR wild type和 突 變 型pmirGLO-MEG2-3’-UTR mutant重組質(zhì)粒。將A549細(xì)胞按1×105個(gè)/mL接種至24孔板，使用Lipofectamine 2000將報(bào)告質(zhì)粒與miR-21 mimics或miR-21 mimics-NC共轉(zhuǎn)染。24 h后，每孔加入100μL Passive Lysis Buffer置于搖床上裂解15 min，于4℃、12 000 r/min（離心半徑8 cm）離心10 min。轉(zhuǎn)移上清至24孔板，每孔加入100μL Luciferase Assay ReagentⅡ、20μL細(xì)胞裂解液，應(yīng)用熒光測(cè)定儀檢測(cè)內(nèi)參發(fā)光值。再加入100μL stop&GLO Reagent，熒光測(cè)定儀檢測(cè)報(bào)告基因發(fā)光值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.8 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)細(xì)胞MEG2蛋白表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。95℃金屬浴使蛋白變性，進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入MEG2（1∶1 000稀釋）、β-actin（1∶1 000稀釋）一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，10 min/次。再加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶2 000稀釋）室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次。最后，將PVDF膜浸入電化學(xué)發(fā)光液（ECL），于暗室中曝光顯影，應(yīng)用ImageJ軟件對(duì)膠片蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值，作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度甘草素對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響隨著甘草素濃度增加，細(xì)胞增殖抑制率升高（P＜0.05），表明不同濃度甘草素均可抑制A549細(xì)胞增殖，其中0.2 mmol/L濃度的甘草素對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制率為（20.43±1.86）%，接近于IC20。為確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)有效性，故選取甘草素濃度為0.2mmol/L。見圖1。

圖1 不同濃度甘草素對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用Figure 1 Inhibitory effect of different concentrations of liquiritigenin on the proliferation of A549 cells

2.2 甘草素對(duì)A549細(xì)胞放療敏感性的影響隨著放射劑量增加，空白組與甘草素組A549細(xì)胞SF均逐漸降低，甘草素組細(xì)胞SF較空白組顯著降低（P＜0.05）。甘草素組A549細(xì)胞的SERD0和SERDq分別為1.27、1.54，放射增敏比＞1。結(jié)果表明，甘草素可以增強(qiáng)A549細(xì)胞的放療敏感性。照射劑量為4 Gy時(shí)，A549細(xì)胞SF接近0.5，因此后續(xù)研究選用放射線劑量4 Gy作為照射劑量。具體結(jié)果見圖2、表2。

圖2 不同劑量放射線照射后細(xì)胞存活曲線Figure 2 Cell survival curve after different doses of radiation

表2 單擊多靶模型參數(shù)比較Table 2 Comparison of single-click multi-target model parameters

2.3 各組A549細(xì)胞相對(duì)活力比較各組細(xì)胞相對(duì)活力組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，甘草素組細(xì)胞相對(duì)活力降低，miR-21 mimics組細(xì)胞相對(duì)活力升高（P＜0.05）；與甘草素組比較，miR-21 mimics組、甘草素+miR-21 mimics組細(xì)胞相對(duì)活力升高（P＜0.05）；與miR-21 mimics-NC組比較，miR-21 mimics組細(xì)胞相對(duì)活力升高（P＜0.05）；與miR-21 mimics組比較，甘草素+miR-21 mimics組細(xì)胞相對(duì)活力降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，甘草素可減弱miR-21 mimics促進(jìn)A549細(xì)胞增殖的作用。具體結(jié)果見表3。

表3 各組A549細(xì)胞相對(duì)活力比較Table 3 Comparison of the relative viability of A549 cells in various groups （±s；n=5）

表3 各組A549細(xì)胞相對(duì)活力比較Table 3 Comparison of the relative viability of A549 cells in various groups （±s；n=5）

①P＜0.05，與對(duì)照組比較；②P＜0.05，與甘草素組比較；③P＜0.05，與miR-21 mimics-NC組比較；④P＜0.05，與miR-21 mimics組比較

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2.4 各組A549細(xì)胞凋亡率比較細(xì)胞凋亡率組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，甘草素組細(xì)胞凋亡率升高，miR-21 mimics組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與甘草素組比較，miR-21 mimics組、甘草素+miR-21 mimics組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與miR-21 mimics-NC組比較，miR-21 mimics組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與miR-21 mimics組比較，甘草素+miR-21 mimics

組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）。結(jié)果表明，甘草素可增加miR-21 mimics抑制A549細(xì)胞凋亡的作用。具體結(jié)果見表4、圖3。

圖3 各組A549細(xì)胞凋亡情況比較Figure 3 Comparison of A549 cell apoptosis in various groups

表4 各組A549細(xì)胞凋亡率比較Table 4 Comparison of apoptosis rate of A549 cells in various groups （±s；n=3）

表4 各組A549細(xì)胞凋亡率比較Table 4 Comparison of apoptosis rate of A549 cells in various groups （±s；n=3）

①P＜0.05，與對(duì)照組比較；②P＜0.05，與甘草素組比較；③P＜0.05，與miR-21 mimics-NC組比較；④P＜0.05，與miR-21 mimics組比較

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2.5 各組A549細(xì)胞miR-21和MEG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較各組細(xì)胞miR-21和MEG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，甘草素組miR-21相對(duì)表達(dá)量降低，MEG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高，miR-21 mimics組miR-21相對(duì)表達(dá)量升高，MEG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與甘草素組比較，miR-21 mimics組、甘草素+miR-21 mimics組miR-21相對(duì)表達(dá)量升高，MEG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與miR-21 mimics-NC組比較，miR-21 mimics組miR-21相對(duì)表達(dá)量升高，MEG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與miR-21mimics組比較，甘草素+miR-21 mimics組miR-21相對(duì)表達(dá)量降低，MEG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）。結(jié)果表明，miR-21可能與MEG2 mRNA表達(dá)相關(guān)。具體結(jié)果見表5。

表5 各組A549細(xì)胞miR-21和MEG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較Table 5 Comparison of the relative expression levels of miR-21 and MEG2 mRNA in A549 cells of various groups （±s；n=3）

表5 各組A549細(xì)胞miR-21和MEG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較Table 5 Comparison of the relative expression levels of miR-21 and MEG2 mRNA in A549 cells of various groups （±s；n=3）

①P＜0.05，與對(duì)照組比較；②P＜0.05，與甘草素組比較；③P＜0.05，與miR-21 mimics-NC組比較；④P＜0.05，與miR-21 mimics組比較

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2.6miR-21與MEG2的靶向關(guān)系通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-21與MEG2的靶向關(guān)系，結(jié)果顯示，miR-21可以結(jié)合MEG2的3’-UTR區(qū)域，見圖4-A。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與共轉(zhuǎn)染miR-21 mimics-NC、MEG2 3’-UTR野生型載體的A549細(xì)胞比較，共轉(zhuǎn)染miR-21 mimics、MEG2 3’-UTR野生型載體的細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），與共轉(zhuǎn)染miR-21 mimics-NC、MEG2 3’-UTR突變型載體的A549細(xì)胞比較，共轉(zhuǎn)染miR-21 mimics、MEG2 3’-UTR突變型載體的細(xì)胞熒光素酶活性無明顯變化。結(jié)果表明，miR-21直接靶向調(diào)控MEG2表達(dá)。具體結(jié)果見圖4-B。

圖4 miR-21與MEG2的靶向關(guān)系Figure 4 Targeting relationship between miR-21 and MEG2

2.7 各組A549細(xì)胞MEG2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較各組A549細(xì)胞MEG2蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，甘草素組MEG2蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，miR-21 mimics組MEG2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與甘草素組比較，miR-21 mimics組、甘草素+miR-21 mimics組MEG2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與miR-21 mimics-NC組比較，miR-21 mimics組MEG2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與miR-21 mimics組比較，甘草素+miR-21 mimics組MEG2蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）。表明甘草素可減弱miR-21對(duì)MEG2的抑制作用。具體結(jié)果見圖5、表6。

表6 各組A549細(xì)胞MEG2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 6 Comparison of protein relative expression level of MEG2 in A549 cells of various groups（±s；n=3）

表6 各組A549細(xì)胞MEG2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 6 Comparison of protein relative expression level of MEG2 in A549 cells of various groups（±s；n=3）

①P＜0.05，與對(duì)照組比較；②P＜0.05，與甘草素組比較；③P＜0.05，與miR-21 mimics-NC組比較；④P＜0.05，與miR-21 mimics組比較

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圖5 各組A549細(xì)胞MEG2蛋白表達(dá)比較Figure 5 Comparison of MEG2 protein expression in A549 cells of various groups

3 討論

目前，我國每年非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）新發(fā)病例約73.3萬，死亡病例約59.1萬[10]。NSCLC發(fā)生發(fā)展過程中原癌基因表達(dá)下調(diào)和抑癌基因表達(dá)上調(diào)，基因異常表達(dá)及長期積累引起細(xì)胞增殖凋亡調(diào)控失常，細(xì)胞異質(zhì)惡性增殖導(dǎo)致NSCLC發(fā)生[11-12]。NSCLC病情進(jìn)展隱蔽，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，多失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。非手術(shù)患者應(yīng)首先考慮進(jìn)行常規(guī)或立體定向放射治療[13]。放射治療是通過電離輻射在腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生自由基，損傷癌細(xì)胞基因組DNA，細(xì)胞周期停滯，損傷修復(fù)失敗直接或間接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。腫瘤細(xì)胞對(duì)致死性損傷修復(fù)的能力高低是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生放療耐受性的機(jī)制之一，NSCLC患者的放療抵抗性極大降低了放療效果[15]。因此，尋找安全、低毒、高效及副作用小的放療增敏藥物對(duì)提高放療效果意義重大。

目前，甘草素在多種腫瘤細(xì)胞中的抗腫瘤作用及放療增敏作用已被證實(shí)[16-17]，但應(yīng)用于NSCLC放療增敏方面鮮有報(bào)道。為探討甘草素對(duì)NSCLC細(xì)胞放療敏感性的影響及其可能的作用機(jī)制，本研究以NSCLC細(xì)胞A549為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，使用不同濃度甘草素處理A549細(xì)胞，結(jié)果顯示不同濃度甘草素均對(duì)A549細(xì)胞具有增殖抑制作用。本研究采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞放療增敏作用，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞增殖活力及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，使用甘草素后的SERD0和SERDq分別為1.27、1.54，且甘草素組A549細(xì)胞相對(duì)活力較對(duì)照組下降，凋亡率升高。結(jié)果表明甘草素可抑制A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)其放療敏感性。

微小RNA（microRNA，miRNA）是18～25個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與多種生理和病理過程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化、發(fā)育及癌細(xì)胞浸潤等[18]。既往研究顯示，通過與輻射相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵成分如上游受體、中游換能器和下游效應(yīng)因子等相互作用，miRNA可有效激活細(xì)胞核中DNA損傷反應(yīng)基因和細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的輻射反應(yīng)和放射敏感性[19]。Liu等[20]研究表明，miR-21是通過第10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白（PTEN）/蛋白激酶B（Akt）途徑調(diào)節(jié)電離輻射誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子。Liu等[21]研究表明，過表達(dá)miR-21可降低晚期宮頸癌通過SMAD7對(duì)放化療的敏感性，提示miR-21具有放療增敏作用。miRNA可通過調(diào)控下游靶基因，發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)作用。Bao等[22]研究表明，miR-21通過直接靶向MEG2促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲并抑制凋亡。饒鐘鳴等[23]研究顯示，miR-21可通過靶向抑制MEG2表達(dá)，參與調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡過程。本研究將A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21 mimics誘導(dǎo)miR-21過量表達(dá)，MEG2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，細(xì)胞相對(duì)活力升高，凋亡率降低，再經(jīng)甘草素干預(yù)后miR-21相對(duì)表達(dá)量降低，MEG2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，細(xì)胞相對(duì)活力降低，凋亡率升高，逆轉(zhuǎn)了miR-21表達(dá)上調(diào)的作用效果，雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果表明miR-21直接靶向MEG2，提示甘草素可能通過miR-21/MEG2軸抑制NSCLC細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)其放療敏感性。

綜上所述，甘草素可以抑制NSCLC細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，增強(qiáng)其放療敏感性，可能是通過調(diào)控miR-21對(duì)MEG2轉(zhuǎn)錄和翻譯的抑制發(fā)揮作用。本研究結(jié)果可為甘草素相關(guān)藥物的研發(fā)及應(yīng)用于NSCLC的臨床治療提供理論依據(jù)。