血必凈對(duì)大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)/復(fù)位缺血再灌注損傷的修復(fù)作用

施源， 李宏軍， 王君君， 李堅(jiān)， 鄧新超， 魯密， 張輝

（武漢市第八醫(yī)院，湖北武漢 430010）

睪丸扭轉(zhuǎn)是泌尿外科常見的急癥，也是男性生殖器損傷的原因之一，其表現(xiàn)為睪丸連同周圍的附睪以及精索發(fā)生扭轉(zhuǎn)。睪丸扭轉(zhuǎn)，精索內(nèi)血流不暢和睪丸缺血，引起睪丸生殖細(xì)胞凋亡壞死，可致患者生殖能力受損或缺失[1-2]。一經(jīng)確診為睪丸扭轉(zhuǎn)，臨床上需盡早通過(guò)手術(shù)方式進(jìn)行睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位，恢復(fù)睪丸血液流動(dòng)，減輕睪丸損傷[3-4]。但睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位是缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷的病理生理過(guò)程，仍可促使睪丸生殖細(xì)胞凋亡增多，導(dǎo)致睪丸萎縮和精子生發(fā)功能障礙[1，4-5]，目前尚無(wú)理想的防治方法。血必凈注射液（以下簡(jiǎn)稱“血必凈”）是一種中藥復(fù)方制劑，具有抗氧化、抗炎、改善組織微環(huán)境、減輕組織細(xì)胞損傷等多種功效[6-7]。有研究報(bào)道，血必凈對(duì)I/R損傷具有一定的改善作用[7-9]；但血必凈對(duì)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位引起的I/R損傷的治療作用及機(jī)制尚不清楚。因此，本研究探討血必凈對(duì)大鼠睪丸I/R損傷的修復(fù)作用，以期為臨床治療睪丸扭轉(zhuǎn)/復(fù)位，減輕睪丸I/R損傷提供一定的理論參考，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40只SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自湖北省疾控中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：2000600023890。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司動(dòng)物研究中心進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2018-0014。SD大鼠于SPF級(jí)條件下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為22～26℃，相對(duì)濕度為50%～60%，人工光照明暗各12 h。

1.2 藥物、試劑與儀器血必凈注射液（天津紅日藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20040033）；地塞米松（美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，貨號(hào)：D4902）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的d UTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和Toll樣受體4（TLR4）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（美國(guó)Bioswamp公司）；丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）。DM1000正置顯微鏡、RM2235石蠟切片機(jī)（德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）；TB-718D石蠟包埋機(jī)（湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司）；AMR-100酶標(biāo)分析儀、iCEN-24R離心機(jī)（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.3 分組、動(dòng)物模型建立與給藥將40只大鼠隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組，模型組，血必凈低、高劑量組和地塞米松組，每組8只。所有SD大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。除假手術(shù)組外，其他4組大鼠均采用Turner法[10]構(gòu)建睪丸扭轉(zhuǎn)大鼠模型。造模方法：采用30 g/L戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，大鼠取仰臥位，固定四肢及頭部，采用常規(guī)備皮、酒精消毒，取左側(cè)陰囊切口約3 cm，逐層切開皮膚、皮下組織及肉膜，將左側(cè)睪丸從切口擠出，游離左側(cè)睪丸，分離筋膜至附睪，結(jié)扎并切斷睪丸引帶，順時(shí)針扭轉(zhuǎn)睪丸720°，維持2 h后復(fù)位并于陰囊壁固定，關(guān)閉切口。睪丸由暗紅色變?yōu)轷r紅色則表明造模成功[11]。給藥方法：睪丸扭轉(zhuǎn)手術(shù)后，血必凈低、高劑量組大鼠分別對(duì)應(yīng)給予腹腔注射血必凈注射液0.5、2 mL·kg-1·d-1；地塞米松組大鼠給予腹腔注射地塞米松0.5 mL·kg-1·d-1；假手術(shù)組采用相同的方式切開陰囊皮膚，不進(jìn)行睪丸扭轉(zhuǎn)，術(shù)后注射相同體積的生理鹽水。每日給藥1次，連續(xù)給藥3 d。給藥3 d后，采用過(guò)度麻醉處死，收集各組大鼠血液和左側(cè)睪丸組織。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 HE染色法觀察睪丸組織損傷 將睪丸組織置于10%中性甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋后連續(xù)切片，切片厚度為4μm。水浴展片、高溫烤片、常規(guī)脫蠟至水后進(jìn)行HE染色。最后采用封片處理，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠睪丸組織的病理組織學(xué)變化。

1.4.2 ELISA法檢測(cè)血清中炎性因子和TLR4水平 將收集的各組大鼠血液經(jīng)離心后取血清，采用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清中炎性因子（TNF-α、IL-1β）和TLR4水平，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各樣本在450 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD）值，然后按照以標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各指標(biāo)水平。

1.4.3 生化檢測(cè)睪丸組織MDA、SOD水平 將收集的睪丸組織進(jìn)行勻漿后，以900×g離心10 min，收集上清，采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA含量，采用羥胺法測(cè)定SOD水平，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。MDA檢測(cè)時(shí)應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)532 nm波長(zhǎng)處的OD值，SOD檢測(cè)時(shí)應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)550 nm波長(zhǎng)處的OD值，計(jì)算MDA和SOD的水平。

1.4.4 TUNEL染色法檢測(cè)睪丸組織中生殖細(xì)胞的凋亡水平 取各組大鼠睪丸組織的石蠟包埋塊，連續(xù)切片，切片厚度為4μm。經(jīng)60℃烤片、二甲苯透明、梯度酒精水化后采用20μg/mL蛋白酶K工作液37℃孵育30 min。清洗后，加入50μL TUNEL反應(yīng)混合液，將玻片置于濕盒中，37℃避光孵育60 min。清洗后，加入50μL轉(zhuǎn)化劑過(guò)氧化物酶（POD），繼續(xù)置于濕盒中37℃避光孵育30 min。清洗后，加入50μL二氨基聯(lián)苯胺（DAB）底物孵育10 min。繼而，蘇木素復(fù)染、脫水、透明，封片后光鏡下觀察。計(jì)算凋亡指數(shù)（500個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的數(shù)量）。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血必凈改善I/R損傷睪丸組織的病理學(xué)變化圖1結(jié)果顯示：假手術(shù)組睪丸曲細(xì)精管排列緊密，生殖細(xì)胞厚度正常，排列緊密有序，結(jié)構(gòu)層次清晰；模型組睪丸曲細(xì)精管排列疏松，較為紊亂，細(xì)胞層次被破壞，生殖細(xì)胞明顯減少、脫落；血必凈低、高劑量組以及地塞米松組均可見生精細(xì)胞排列逐漸恢復(fù)正常，細(xì)胞層次逐漸清晰明了，少數(shù)腔內(nèi)可見脫落細(xì)胞。

圖1 各組大鼠睪丸組織病理學(xué)變化比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of histopathological changes of rat testis tissue in various groups（by HE staining，×200）

2.2 血必凈改善I/R損傷睪丸組織中MDA和SOD水平圖2結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組睪丸組織中SOD水平顯著降低，MDA水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，血必凈低、高劑量組睪丸組織中SOD水平明顯升高，MDA水平降低（P＜0.05）；地塞米松組與血必凈各劑量組趨勢(shì)一致（P＜0.05）。表明血必凈可抑制I/R損傷睪丸組織中的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

2.3 血必凈抑制I/R損傷睪丸生殖細(xì)胞的凋亡圖3～圖4結(jié)果顯示：假手術(shù)組僅見少量的凋亡睪丸生殖細(xì)胞；而模型組睪丸中凋亡生殖細(xì)胞則明顯增多（P＜0.05），凋亡的生殖細(xì)胞深染，且凋亡細(xì)胞主要為初級(jí)精母細(xì)胞和精原細(xì)胞；與模型組比較，血必凈高劑量組和地塞米松組睪丸凋亡細(xì)胞明顯減少（P＜0.05）。表明血必凈能夠降低I/R損傷睪丸生殖細(xì)胞的凋亡水平。

圖3 各組大鼠睪丸組織凋亡生殖細(xì)胞分布比較（TUNEL染色，×200）Figure 3 Comparison of the distribution of apoptotic germ cells in rat testis tissue of various group（by TUNEL staining，×200）

圖4 各組大鼠睪丸組織生殖細(xì)胞凋亡指數(shù)比較Figure 4 Comparison of apoptosis index of germ cells in rat testis tissue of various groups

A.SOD水平；B.MDA水平①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較

2.4 血必凈降低睪丸扭轉(zhuǎn)大鼠血清中炎性因子水平圖5結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組TNF-α、IL-1β和TLR4水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，血必凈高劑量組以及地塞米松組TNF-α、IL-1β和TLR4水平均顯著降低（P＜0.05）。

3 討論

睪丸扭轉(zhuǎn)可導(dǎo)致睪丸組織缺血，需及時(shí)采取手術(shù)恢復(fù)睪丸供血，避免睪丸壞死致使患者喪失生殖能力[11]。然而，睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位，也是一種I/R過(guò)程，缺血組織恢復(fù)供氧能夠引起氧自由基的過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而將細(xì)胞膜脂質(zhì)物氧化形成有毒物質(zhì)，如MDA，加劇缺血性睪丸的睪丸組織損傷[11-12]。睪丸I/R能夠激活炎癥信號(hào)通路，促進(jìn)中性粒細(xì)胞從內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移至睪丸間質(zhì)，增加活性氧的產(chǎn)生和炎性因子的釋放，導(dǎo)致生殖細(xì)胞功能障礙，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]，睪丸生精作用受損，那么，如何有效治療睪丸扭轉(zhuǎn)/復(fù)位I/R是目前亟需解決的問(wèn)題。

血必凈是由多種中草藥研制而成，包含紅花、當(dāng)歸、川芎、丹參以及赤芍等，具有抗炎、增強(qiáng)免疫力、清熱解毒等作用[8-9]，對(duì)膿毒癥、重度肺炎、全身炎癥反應(yīng)綜合征以及I/R損傷等均具有一定的保護(hù)作用[3，14-16]。有研究[14-15]顯示，在重癥肺炎患者或左心室I/R誘發(fā)急性肺損傷的動(dòng)物模型中，血必凈能夠通過(guò)降低炎性介質(zhì)細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）和TNF-α的表達(dá)水平發(fā)揮抗炎的作用，且血必凈能夠上調(diào)抗氧化指標(biāo)SOD活性，下調(diào)氧化產(chǎn)物MDA含量，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用[16]。SOD是一種清除氧自由基酶的活性劑，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物的最終產(chǎn)物，是反映氧自由基損傷的重要指標(biāo)[17]。本研究結(jié)果顯示，模型組睪丸組織SOD水平顯著降低，MDA水平顯著升高，表明I/R狀態(tài)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，介導(dǎo)了細(xì)胞膜中脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，消耗了SOD。與模型組比較，血必凈組睪丸組織SOD水平顯著增加，MDA含量顯著減少，表明血必凈可抵抗氧自由基的損害，抑制睪丸I/R脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。

A.TNF-α水平；B.IL-1β水平；C.TLR4水平①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較

有研究[18]顯示，TLR4是模式識(shí)別受體家族成員之一，能夠誘導(dǎo)激活核因子kappaB（NF-κB）信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-1和IL-6等的表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。這些炎癥因子又會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基、蛋白水解酶等，對(duì)組織細(xì)胞造成一定的毒性損傷。細(xì)胞凋亡是一種由多種因素誘發(fā)的程序性凋亡過(guò)程，I/R與細(xì)胞凋亡有著十分緊密的關(guān)系[19-20]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組睪丸組織病理?yè)p傷加重，血清中TNF-α、IL-1β和TLR4炎癥因子水平上調(diào)，凋亡細(xì)胞數(shù)增多，表明睪丸I/R對(duì)生殖細(xì)胞造成了損害。而血必凈能夠明顯改善睪丸組織的病理?yè)p傷，減少凋亡的生殖細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)下調(diào)炎性因子TNF-α、IL-1β和TLR4的水平，表明血必凈對(duì)I/R睪丸組織具有保護(hù)作用。

地塞米松（Dexamethasone）是一種合成的糖皮質(zhì)激素，作為有效的抗炎藥，被臨床廣泛應(yīng)用于治療炎癥和自身免疫性疾病，包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性休克和哮喘等[21]。有研究[22]顯示，在腎I/R動(dòng)物模型中，地塞米松能夠通過(guò)高遷移率族蛋白1（HMGB1）/TLR4、NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號(hào)通路抑制炎性因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)。本結(jié)果研究顯示，血必凈與地塞米松治療效果相當(dāng)。

綜上所述，血必凈可通過(guò)改善睪丸I/R后睪丸病理?yè)p傷，減少受損組織中生殖細(xì)胞的凋亡，降低組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制炎癥因子的表達(dá)，從而發(fā)揮大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)/復(fù)位I/R損傷的修復(fù)作用。這為臨床應(yīng)用血必凈治療睪丸扭轉(zhuǎn)，減輕患者的睪丸損傷提供一定的理論依據(jù)。