河南煙區(qū)煙草根莖類病害調查及病原鑒定

李小杰，李 琦，劉 暢，邱 睿，白靜科，徐 敏，李成軍，陳玉國，姚晨虓,3，李淑君*

1. 河南省農業(yè)科學院煙草研究所煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點實驗室，河南省許昌市魏都區(qū)永昌大道 461000

2. 中國煙草總公司河南省公司，鄭州市鄭東新區(qū)商務外環(huán)15 號 450018

3. 河南科技大學林學院，河南省洛陽市開元大道263 號 471023

煙草病蟲害是影響煙葉安全生產的重要因素之一，每年造成巨大的經濟損失［1-3］。據不完全統(tǒng)計，我國煙葉每年因病害造成的直接經濟損失約7億元［4］。目前已知的全球煙草侵染性病害至少有109 種［4-5］，我國煙草上已明確的侵染性病害共有62 種［3］，其中根莖部病害有青枯病、黑脛病、猝倒病、根黑腐病、立枯病、枯萎病、低頭黑病、根腐病、白絹病、莖部炭疽病、菌核病和莖點病等［6-8］。近年來，隨著煙草種植區(qū)域、栽培管理措施、全球氣候等因素的改變，煙草病害的種類、分布及其發(fā)生危害等均發(fā)生了較大變化。苗圃［6］鑒定出河南省煙草根莖部真菌病害11種，其中煙草殼二孢莖枯?。ˋscochyta chrysanthemi）和擬莖點霉莖枯病（Phomopsis sp.）為煙草上的新病害，鐘器腐霉菌（Pythium vexans）為煙草猝倒病的新病原，煙草莖點病（Phoma sp.）在河南省為首次報道。譚海文［7］首次提出了煙草灰霉?。˙otrytis cinerea）為廣西煙草生產上新發(fā)生的病害。吳元華等［9］報道了煙草靶斑?。═hanatephorus cucumeris）為我國煙草的新病害。尤其是多年連作導致煙草土傳病害日益嚴重，煙草青枯病、黑脛病、立枯病和根腐病等根莖部病害逐年加重［7,10-11］。

河南是典型的濃香型煙葉產區(qū)，種煙歷史悠久。隨著煙草連作年限的增加，土傳病害日趨嚴重，新病害相繼出現［6,12］。河南煙區(qū)地勢西高東低，熱量資源年際間變化波動較大，導致不同生態(tài)種植區(qū)煙草根莖病害種類及發(fā)病程度不同［6,13-16］，但近年來關于河南省煙草根莖病害發(fā)生種類的系統(tǒng)調查研究還鮮見報道。為了明確河南省各產煙區(qū)煙草根莖類病害的發(fā)生種類及變化規(guī)律，自2017—2019 年連續(xù)3年在煙草生產季節(jié)進行了病害調查，采集了大量病害樣本，并對病原進行鑒定，旨在為河南產煙區(qū)煙草生產布局、品種選擇及病害的預測預報和綜合防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 病害調查及樣本采集

2017—2019 年，分別對豫南（信陽、南陽、駐馬店），豫東（周口、商丘），豫中（漯河、許昌、平頂山）以及豫西（洛陽、三門峽、濟源）等11個煙葉產區(qū)大田期煙草根莖類病害進行普查。采集具有典型癥狀的病害樣本644份，其中豫南煙區(qū)206份，豫東煙區(qū)73份，豫中煙區(qū)190份，豫西煙區(qū)175份。輕癥煙株主要表現在葉片發(fā)黃或萎蔫，莖基部有黑/褐色病斑，發(fā)病較重的則植株矮小，莖部壞死、根系變褐腐爛。

1.2 病原菌的分離培養(yǎng)

采用組織分離法，將采集的樣品用清水沖洗干凈，從其病健交界處切取較大塊組織，用體積分數為75%的酒精漂洗30 s，放入無菌水中漂洗，然后放入體積分數為15%的次氯酸鈉溶液中浸泡3～5 min，再用無菌水漂洗4次，用滅菌濾紙將組織表面的水分吸干，最后將組織材料切成3～5 mm 小塊置于PDA培養(yǎng)基中，于25 ℃恒溫培養(yǎng)3d。平板出現菌落后挑取菌絲尖端于新的PDA 平板上純化，直至獲得純菌株。

1.3 病原菌的培養(yǎng)性狀及顯微觀察

將分離純化菌株置于PDA 培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)，待分離菌絲長成菌落，用解剖針挑取少量菌絲置于載玻片上，加入幾滴無菌水，蓋上蓋玻片制成臨時裝片，于顯微鏡下觀察菌絲及分生孢子形態(tài)。

1.4 病原菌的ITS鑒定

參照真菌基因組DNA柱式提取試劑盒說明書，提取分離真菌基因組DNA作為模板，應用真菌鑒定通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進 行PCR擴增。PCR反應體系（25 μL）：DNA模板1μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×PCR Taq Master Mix 12.5 μL，雙蒸水補足至25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸 1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸 8 min。PCR 產物經質量體積分數為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，膠回收后委托上海英濰捷基貿易有限公司完成測序。應用NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行在線比對分析，選擇同源性較高的序列用鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 病原菌的致病力測定

選擇健康的長至6片真葉的煙苗，用滅菌的大頭針刺傷莖部表皮，然后切取1 cm×1 cm 的菌絲塊貼于刺傷的莖部，用脫脂棉蘸取無菌水保濕。5 d后開始觀察煙苗發(fā)病情況。

2 結果與分析

2.1 河南煙區(qū)煙草根莖類病害的發(fā)生及病原鑒定

從2017—2019 年河南煙區(qū)煙草根莖類病害普查結果中發(fā)現，煙草根莖類病害在河南省11 個產煙區(qū)均有不同程度發(fā)生，平均發(fā)病率在5%～15%之間，個別地塊發(fā)病較重，煙株出現大面積死亡。由表1和圖1 可以看出，采集的644 份根莖類病害樣品中共分離培養(yǎng)出519 株真菌菌株和5 株細菌菌株。通過形態(tài)學和分子生物學手段，鑒定出疫霉菌（Phytophthora nicotianae）145 株，鐮刀菌（Fusarium spp.）273株，立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）65株，齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）3 株，擬莖 點 霉菌（Phomopsis sp.）22 株，辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）6 株，瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）5 株，青枯菌（Ralstonia solanacearum）5 株。其中鐮刀菌屬真菌的平均檢出率最高，占52.10%。其次是疫霉菌和立枯絲核菌，平均檢出率分別為27.67%和12.40%，其他5 種病原菌的平均檢出率均低于5%。表明由鐮刀菌屬真菌引起的煙草根腐病、疫霉菌引起的煙草黑脛病和立枯絲核菌引起的煙草立枯病是河南煙區(qū)的主要根莖類病害，由擬莖點霉菌引起的煙草莖枯病是煙草上的新病害，近兩年的發(fā)生率有逐漸上升的趨勢。

圖1 2017—2019年河南省煙草根莖類病害病原鑒定Fig.1 Pathogen identification of tobacco rhizomatic diseases in Henan Province from 2017 to 2019

表1 煙草根莖類病害樣本采集及病原分離Tab.1 Sample collection and pathogen isolation of tobacco rhizomatic diseases

2.2 煙草根莖類病害的生態(tài)區(qū)分布

疫 霉 菌（Phytophthora nicotianae）、鐮 刀 菌（Fusarium spp.）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）和辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）在4 個生態(tài)種植區(qū)均有分布（圖2），其中鐮刀菌在4個生態(tài)種植區(qū)的平均檢出率均在50%左右，疫霉菌在豫東和豫西的平均檢出率達到20%以上，立枯絲核菌在豫中煙區(qū)的平均檢出率最高，在15%以上，辣椒炭疽菌平均檢出率最低，在1%左右。擬莖點霉菌（Phomopsis sp.）在豫中和豫西煙區(qū)的檢出率較高，平均檢出率在5%左右。齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）、瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）和 青 枯 菌（Ralstonia solanacearum）僅在豫南煙區(qū)有檢出，平均檢出率在4%以下。表明煙草黑脛病、鐮刀菌根腐病和立枯病等主要根莖類病害在4個生態(tài)種植區(qū)均有不同程度發(fā)生，其他病害均為零星發(fā)生。

圖2 2017—2019年不同煙區(qū)的煙草根莖類病害病原檢出率Fig.2 Pathogen identification of rhizomatic diseases in different tobacco growing areas from 2017 to 2019

2.3 擬莖點霉菌的鑒定

觀察發(fā)現，擬莖點霉菌在PDA培養(yǎng)基上于25 ℃下培養(yǎng)，菌落生長茂盛，氣生菌絲白色棉絮狀，具有同心輪紋，菌絲較濃密，20 d后觀察菌落顏色加深呈暗黃色，菌絲聚集形成小黑點，即分生孢子器（圖3a、3b）。分生孢子無色，橢圓形或紡錘形，具有2個明顯的油球（圖3c）。

圖3 擬莖點霉菌平板培養(yǎng)及分生孢子形態(tài)Fig.3 Plate culture and conidium morphology of Phomopsis sp.

利用真菌鑒定通用引物ITS1 和ITS4 對擬莖點霉菌代表菌株編號為NJD-1～NJD-8（表2）的ITS 序列進行PCR 擴增，測序得到長度約為550 bp 的片段。將片段序列與GenBank數據庫的基因序列進行同源性比對，這8個菌株的rDNA 序列與擬莖點霉屬（Phomopsis）及其有性態(tài)間座殼屬（Diaporthe）真菌的相似性均在99%以上。系統(tǒng)發(fā)育樹結果（圖4）表明，這8個擬莖點霉菌株與Phomopsis屬或Diaporthe屬的多個種遺傳距離較近且位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支。

表2 擬莖點霉菌代表菌株及來源Tab.2 Representative strains and sources of Phomopsis sp.

圖4 擬莖點霉菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Phomopsis sp.

2.4 擬莖點霉菌的致病性

用針刺接種菌絲塊法將8 株擬莖點霉菌代表菌株接種到健康的中煙100 煙莖上，5 d 后發(fā)現接種NJD-1、NJD-2、NJD-5和NJD-6菌株的煙株接種部位出現褐色病斑，隨后沿莖的一側逐漸向上蔓延，使莖部萎縮，變黃干枯；葉脈失綠，葉片上呈現水漬狀病斑，并逐漸萎蔫變干（圖5a），表明這4株擬莖點霉菌具有較強的致病性。接種NJD-4 和NJD-7 菌株的煙株接種部位出現褐色病斑，但病斑僅限于接種傷口處，擴展較?。▓D5b），致病性較弱。接種NJD-3 和NJD-8 菌株的煙株未見發(fā)病癥狀，與對照接種癥狀相同（圖5c）。表明所分離的擬莖點霉菌具有明顯的致病性分化。

圖5 擬莖點霉菌的回接試驗Fig.5 Back infestation test of Phomopsis sp.

3 討論

已有研究表明，河南省煙草根莖類病害有10余種，其中煙草黑脛病、根黑腐病和根腐病為主要病害［6,13-16］。本研究中從河南省各煙葉產區(qū)共分離出煙草根莖類病害的病原8種，其中黑脛病、根腐病、立枯病為主要根莖類病害，這與前人研究的結果稍有不同，可能與近年來氣候條件、土壤微生態(tài)和耕作制度的變化關系較大。本研究中發(fā)現煙草立枯病已逐漸演變?yōu)榇筇锲诓『?，在河南各產煙區(qū)大田期均有不同程度的發(fā)生危害，已成為河南煙區(qū)主要根莖類病害之一，這與譚海文［7］、霍行等［17］的研究結果一致；煙草鐮刀菌根腐病的發(fā)生已超過煙草黑脛病，平均檢出率高達50%以上，且對煙草具有不同程度的致病性［18］，已成為危害煙草的重要根莖部真菌病害；未分離到煙草根黑腐病的病原—基生根串珠霉菌（Thielaviopsis basicola），這可能是由于近年來氣候環(huán)境等因素的變化易引起高溫高濕病害的發(fā)生，而低溫病害煙草根黑腐病幾乎很少發(fā)生所致。

擬莖點霉屬是重要的植物病原菌，寄主范圍廣泛，主要危害癥狀表現為潰瘍、果腐、葉枯、枝枯、根腐等［19］，如由扁桃擬莖點霉菌（Phomopsis amygdali）引起的桃縊縮潰瘍病是桃生產上重要的病害之一［20］；由油橄欖擬莖點霉（Phomopsis olea-europaea）可引起油橄欖葉枯?。?1］。本研究中從豫南、豫中和豫西部分煙區(qū)樣品中均分離獲得擬莖點霉屬（Phomopsis sp.）真菌，在培養(yǎng)條件下僅可獲得小型分生孢子，能侵染煙株莖部和葉片，這與苗圃［6］的研究結果基本一致，但這些病害的發(fā)生范圍更廣，且不同來源的分離菌株致病力存在顯著差異，可能與不同地域環(huán)境和栽培條件不同有關，其遺傳多樣性有待進一步深入研究。

4 結論

由鐮刀菌屬（Fusarium spp.）引起的煙草根腐病、疫霉菌（Phytophthora nicotianae）引起的煙草黑脛病和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的煙草立枯病是目前河南煙區(qū)大田期的主要根莖類病害。其中煙草根腐病在4個煙草生態(tài)種植區(qū)均有發(fā)生，平均檢出率在50%以上，遠超過煙草黑脛病和立枯病的發(fā)生率，已成為危害煙草的重要根莖類真菌病害。由齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）引起的煙草白絹病、辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）引起的煙草低頭黑病、瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）引起的煙草猝倒病和青枯菌（Ralstonia solanacearum）引起的煙草青枯病在個別煙區(qū)零星發(fā)生，檢出率均在5%以下，危害不大。煙草新發(fā)生病害—擬莖點霉菌（Phomopsis sp.）引起的煙草莖（葉）枯病的發(fā)生近兩年有逐漸上升的趨勢，生產上應引起重視。