缺氮脅迫下生長(zhǎng)素對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)及油脂積累的影響

耿媛媛，張賢明，聶煜東,2,3，姜 巖，楊哲涵，李 金，顏海燕，申 粵

(1.重慶工商大學(xué) 廢油資源化技術(shù)與裝備教育部工程研究中心，重慶 400067； 2.中國(guó)科學(xué)院 生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境水質(zhì)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085； 3.重慶理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400054)

國(guó)際局勢(shì)的復(fù)雜多變對(duì)能源供給安全造成了潛在威脅，這推動(dòng)了我國(guó)對(duì)能源多元化的需求，生物質(zhì)能源作為能源多元化的重要一環(huán)備受期待。生物柴油是一種常見(jiàn)生物質(zhì)能源，主要由生物油脂轉(zhuǎn)化而來(lái)，而產(chǎn)油微藻具有易培養(yǎng)、生長(zhǎng)快、耐受性強(qiáng)、富含油脂等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是生物柴油生產(chǎn)原料的理想來(lái)源[1-2]。藻細(xì)胞在高光照強(qiáng)度、高鹽、營(yíng)養(yǎng)缺乏等不利環(huán)境下會(huì)以積累油脂的方式儲(chǔ)存大量能量[3]，其中缺氮脅迫被認(rèn)為是增加細(xì)胞含油率最有效的方法之一[4]。然而，在氮缺乏的條件下微藻生物量也會(huì)降低，從而影響了微藻油脂的產(chǎn)量[5]。因此，有必要尋找一種既能夠提高微藻細(xì)胞含油率又能維持甚至增加微藻生物量的方法。

生長(zhǎng)素是植物在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一類(lèi)小分子物質(zhì)，在細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)及分化等方面調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育，因此在植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)中被廣泛應(yīng)用[6]。近年來(lái)，生長(zhǎng)素已被證實(shí)對(duì)微藻的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物合成有明顯的刺激作用。楊凱等[7]研究表明，吲哚乙酸(IAA)對(duì)杜氏鹽藻生長(zhǎng)和脂肪酸合成具有促進(jìn)作用；Liu等[8]研究表明，生長(zhǎng)素萘乙酸(NAA)對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)和油脂合成具有明顯的促進(jìn)作用，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)也具有同樣的效果[9]。因此，通過(guò)生長(zhǎng)素的調(diào)節(jié)補(bǔ)償缺氮導(dǎo)致的生物量下降具有一定可行性。

當(dāng)前，在常規(guī)培養(yǎng)條件下添加生長(zhǎng)素以提高微藻油脂產(chǎn)量已成為研究熱點(diǎn)之一，但在完全缺氮條件下生長(zhǎng)素對(duì)微藻生物量和油脂積累的影響研究仍有待完善。本研究以普通小球藻為研究對(duì)象，在缺氮條件下添加不同種類(lèi)的天然生長(zhǎng)素IAA、人工合成生長(zhǎng)素NAA和2,4-D，研究3種生長(zhǎng)素對(duì)微藻生長(zhǎng)、油脂積累以及油脂脂肪酸組成的影響，進(jìn)而確定普通小球藻產(chǎn)油最適生長(zhǎng)素及環(huán)境條件，為藻源生物柴油規(guī)?；瘧?yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藻種與培養(yǎng)基

普通小球藻(Chlorellavulgaris)，中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)；正常培養(yǎng)基(BG11)；完全缺氮培養(yǎng)基(ND，BG11中以等量NaCl代替NaNO3)。

1.1.2 主要試劑

吲哚乙酸(IAA)；萘乙酸(NAA)；2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)；氯仿、甲醇、氫氧化鉀、二甲基亞砜(DMSO)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；尼羅紅染料，阿拉丁試劑公司；37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，Anpel公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

MGC-450BP恒溫光照培養(yǎng)箱，DR6000紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，SQP電子天平，F(xiàn)iveEasy Plus pH計(jì)，LDZX-30KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋，血球計(jì)數(shù)板，BX51熒光顯微鏡，F(xiàn)-7100熒光分光光度計(jì)，SCIENTZ-10N真空冷凍干燥機(jī)，TD-24K離心機(jī)，DK-S24電熱恒溫水浴鍋，DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱，TOC-LCPH總有機(jī)碳分析儀，GC1960氣相色譜儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藻種培養(yǎng)

采用BG11培養(yǎng)基對(duì)普通小球藻進(jìn)行種子擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度(25±1)℃、光照強(qiáng)度4 500 lx、光照周期光暗比為12 h/12 h。待微藻生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，以6 000 r/min離心10 min，將藻細(xì)胞重懸于完全缺氮培養(yǎng)基。500 mL培養(yǎng)液以1×106mL-1的細(xì)胞接種密度分裝于1 000 mL的無(wú)菌三角燒瓶中，加入3種生長(zhǎng)素，調(diào)整其終質(zhì)量濃度梯度分別為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mg/L，每一質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)平行，常溫培養(yǎng)14 d。所有培養(yǎng)液的培養(yǎng)條件與種子液培養(yǎng)條件一致，以不添加生長(zhǎng)素的完全缺氮培養(yǎng)基(ND)和正常培養(yǎng)基(BG11)作為對(duì)照組。

1.2.2 藻細(xì)胞密度及生物量測(cè)定

采用血球計(jì)數(shù)板方法對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)過(guò)程藻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以此作為藻細(xì)胞密度；采用烘干稱重法對(duì)小球藻生物量進(jìn)行測(cè)定，具體為：每隔2 d取一定體積的藻液(V)經(jīng)0.45 μm濾膜(烘干濾膜質(zhì)量m1)抽濾，洗滌，于60℃烘干至恒重，冷卻后稱重(干藻與濾膜質(zhì)量m2)。生物量(DCW)按式(1)計(jì)算。

DCW=(m2-m1)/V

(1)

1.2.3 總脂含量及甘油三酯含量的測(cè)定

采用Bligh-Dyer法[10]測(cè)定總脂含量。取25 mg凍干藻粉(質(zhì)量記為m)于10 mL離心管中，加入4 mL氯仿-甲醇溶液(體積比2∶1)，旋渦混勻2 min后超聲(40 kHz,200 W)處理20 min，離心，收集有機(jī)相，重復(fù)提取3次，合并有機(jī)相至預(yù)烘干稱重的稱量瓶(m1)中，待有機(jī)溶劑完全揮發(fā)后，于60℃烘箱中烘干至恒重(m2)，得到小球藻總脂。藻細(xì)胞總脂含量(Y1)按式(2)計(jì)算，總脂產(chǎn)量(Y2)按式(3)計(jì)算。

Y1=(m2-m1)/m×100%

(2)

Y2=DCW×Y1

(3)

采用尼羅紅染色-熒光分光光度計(jì)法[11]對(duì)藻細(xì)胞內(nèi)甘油三酯進(jìn)行測(cè)定，以三油酸甘油酯為標(biāo)準(zhǔn)品，采用外標(biāo)法得到細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量(Y3)與相對(duì)熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，見(jiàn)式(4)。甘油三酯產(chǎn)量(Y4)按式(5)計(jì)算，其他脂質(zhì)含量(Y5)按式(6)計(jì)算。

Y3=0.118 6×A482+0.008 2(R2=0.995 4)

(4)

Y4=Y3×DCW

(5)

Y5=Y1-Y3

(6)

1.2.4 脂肪酸組成測(cè)定

脂肪酸甲酯化：取1.2.3獲得的小球藻總脂，加入2 mL 4%氫氧化鉀-甲醇溶液，于40℃水浴60 min,然后加入1 mL正己烷萃取，待混合溶液靜置分層后，取200 μL上清液至氣相色譜專(zhuān)用玻璃瓶中密封。采用氣相色譜分析樣品的脂肪酸組成。

氣相色譜條件：DB-FAST毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 cm)；升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0℃，以40℃/min升溫到165℃，保持1 min，再以4℃/min升溫到230℃，保持10 min；載氣為氮?dú)?，進(jìn)樣口溫度250℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度260℃；進(jìn)樣量1 μL。

通過(guò)比較樣品中未知色譜峰與37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間對(duì)樣品中脂肪酸進(jìn)行定性，采用面積歸一化法定量。

1.2.5 總氮含量測(cè)定

參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法(第四版)》[12]檢測(cè)微藻培養(yǎng)后培養(yǎng)基中的總氮(TN)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 缺氮脅迫下生長(zhǎng)素對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響

在缺氮條件下分別添加0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mg/L的IAA、NAA和2,4-D，考察其對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，所有缺氮組中普通小球藻在培養(yǎng)前期生長(zhǎng)均呈快速上升趨勢(shì)，后期生物量和細(xì)胞密度均略微下降，而B(niǎo)G11組普通小球藻生物量和細(xì)胞密度前期雖增長(zhǎng)速率慢于部分缺氮組，但培養(yǎng)12 d內(nèi)均保持上升趨勢(shì)。1.0 mg/L IAA組培養(yǎng)8 d獲得最大細(xì)胞密度，為2.94×106mL-1，培養(yǎng)6 d獲得最大生物量，為158 mg/L。2.5 mg/L NAA組培養(yǎng)6 d獲得最大細(xì)胞密度和生物量，分別為2.85×106mL-1和159 mg/L。1.0 mg/L 2,4-D組培養(yǎng)6 d獲得最大細(xì)胞密度，為3.05×106mL-1，培養(yǎng)8 d獲得最大生物量，為164 mg/L。2,4-D對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)促進(jìn)效果略優(yōu)于其他兩類(lèi)生長(zhǎng)素。與各實(shí)驗(yàn)組相比，ND組由于缺乏外界刺激誘導(dǎo)，培養(yǎng)4 d時(shí)胞內(nèi)氮源耗盡，生長(zhǎng)陷入停滯。綜上，生長(zhǎng)素最佳添加量分別為IAA 1.0 mg/L，NAA 2.5 mg/L，2,4-D 1.0 mg/L。

分別在1.0 mg/L IAA、2.5 mg/L NAA、1.0 mg/L 2,4-D 3種生長(zhǎng)素作用下，最大細(xì)胞密度相對(duì)于ND組(最大細(xì)胞密度1.98×106mL-1)提升至1.48、1.44、1.54倍，而最大生物量相對(duì)于ND組(最大生物量124 mg/L)分別提升至1.27、1.28、1.32倍，與整個(gè)培養(yǎng)周期前8 d BG11組相比，生物量無(wú)顯著性差異，這說(shuō)明在缺氮條件下，生長(zhǎng)素更多的是促進(jìn)細(xì)胞的分裂與增殖，細(xì)胞個(gè)體的生長(zhǎng)由于氮素的缺乏而受到了一定抑制，同時(shí)生長(zhǎng)素有效抵消了缺氮脅迫對(duì)生物量的負(fù)面影響。

圖2為BG11、ND與最佳外源生長(zhǎng)素添加量下ND中總氮含量的變化。

由圖2可知：缺氮條件下細(xì)胞初始破裂情況較為嚴(yán)重，大量胞內(nèi)氮素溢出，后隨細(xì)胞的生長(zhǎng)又逐漸被吸收；NAA組由于添加量較高，也對(duì)藻細(xì)胞有一定脅迫作用，而在低添加量的IAA和2,4-D刺激下，缺氮藻細(xì)胞迅速地適應(yīng)環(huán)境，因此由于細(xì)胞破裂而釋放的氮素較少。實(shí)際上，生長(zhǎng)素是藻細(xì)胞的一種化學(xué)信號(hào)分子，其通過(guò)調(diào)節(jié)有絲分裂中涉及的信號(hào)通路來(lái)刺激細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[13-14]。此外，圖1結(jié)果表明高濃度生長(zhǎng)素對(duì)普通小球藻細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用明顯低于低濃度生長(zhǎng)素，該現(xiàn)象與生長(zhǎng)素對(duì)高等植物的影響一致，即低濃度促進(jìn)，高濃度抑制?？偠灾?，在氮限制條件下添加生長(zhǎng)素能有效地促進(jìn)普通小球藻細(xì)胞的增殖，一定程度上抵消缺氮對(duì)小球藻生長(zhǎng)的負(fù)面影響；這同時(shí)表明生長(zhǎng)素能夠誘導(dǎo)普通小球藻細(xì)胞通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性氮的利用來(lái)維持其生長(zhǎng)。

圖2 BG11、ND與最佳生長(zhǎng)素添加量下ND中總氮含量變化趨勢(shì)

2.2 缺氮脅迫下生長(zhǎng)素對(duì)微藻油脂合成的影響(見(jiàn)圖3)

由圖3可知，在缺氮條件下添加生長(zhǎng)素IAA、NAA、2,4-D整體上均可以顯著提高微藻總脂含量，生長(zhǎng)素IAA、NAA和2,4-D添加量分別為1.0、2.5、1.0 mg/L時(shí)，對(duì)微藻油脂合成的促進(jìn)效果最好，最大總脂含量分別為38.85%、37.00%和39.16%，而ND組最大總脂含量為30.95%。相對(duì)于BG11組最大總脂含量22.55%而言，ND組和IAA(1.0 mg/L)、NAA(2.5 mg/L)、2,4-D(1.0 mg/L)組最大總脂含量分別是BG11組的1.37、1.72、1.64、1.74倍。1.0 mg/L IAA、2.5 mg/L NAA和1.0 mg/L 2,4-D組微藻最大總脂產(chǎn)量分別為61.38、58.83、64.22 mg/L，是BG11組最大總脂產(chǎn)量(41.27 mg/L)的1.49、1.43、1.56倍，而ND組最大總脂產(chǎn)量為38.38 mg/L ，較BG11組的低，這是由于缺氮條件下微藻生長(zhǎng)受到極大限制，導(dǎo)致其雖然單個(gè)細(xì)胞總脂含量高，但總脂產(chǎn)量低。因此，在產(chǎn)油微藻缺氮培養(yǎng)時(shí)添加生長(zhǎng)素刺激微藻的生長(zhǎng)是十分必要的。

微藻油脂主要以結(jié)構(gòu)脂如磷脂、糖脂以及儲(chǔ)存脂如甘油三酯的形式存在，其中甘油三酯可以通過(guò)酯交換反應(yīng)制備性能良好的生物柴油[15]。因此，油脂的成分對(duì)于生物柴油的品質(zhì)至關(guān)重要。不同培養(yǎng)條件下普通小球藻細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量、其他脂質(zhì)含量、甘油三酯產(chǎn)量與總脂產(chǎn)量如圖4所示。

圖4 不同生長(zhǎng)素對(duì)普通小球藻甘油三酯含量、其他脂質(zhì)含量、甘油三酯產(chǎn)量與總脂產(chǎn)量的影響

由圖4可知，氮限制培養(yǎng)條件下甘油三酯含量相對(duì)于正常培養(yǎng)有顯著提升，其中1.0 mg/L IAA、2.5 mg/L NAA、1.0 mg/L 2,4-D組分別獲得最大甘油三酯含量，相對(duì)于ND組的最大甘油三酯含量19.88%而言，分別提高至27.97%、25.66%、33.21%，且分別是BG11組最大甘油三酯含量(12.31%)的2.27、2.08、2.70倍。說(shuō)明生長(zhǎng)素促進(jìn)了微藻油脂的合成。由于生物量、總脂含量、甘油三酯含量隨生長(zhǎng)素添加量的變化趨勢(shì)幾乎一致，因此生長(zhǎng)素在添加量IAA 1.0 mg/L、NAA 2.5 mg/L、2,4-D 1.0 mg/L時(shí)獲得最大甘油三酯產(chǎn)量，分別為44.19、40.80、54.46 mg/L。

實(shí)驗(yàn)表明，生長(zhǎng)素在合適的添加量下可同步促進(jìn)微藻生長(zhǎng)和油脂合成。生長(zhǎng)素進(jìn)入細(xì)胞后首先會(huì)與受體相結(jié)合，而后通過(guò)復(fù)雜的生理生化反應(yīng)誘導(dǎo)特定基因加速表達(dá)，從而改變?cè)寮?xì)胞的相關(guān)代謝[9]。生長(zhǎng)素同步提高藻細(xì)胞生物量及總脂含量的原因可能是由于生長(zhǎng)素可以提高微藻光合作用過(guò)程中的固碳關(guān)鍵酶核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶和油脂合成關(guān)鍵酶乙酰輔酶A羧化酶的活性，進(jìn)而增強(qiáng)微藻光合作用，促進(jìn)微藻生長(zhǎng)和油脂積累[14]。還有證據(jù)表明其他油脂合成相關(guān)酶的表達(dá)也受到了生長(zhǎng)素的影響，如綠藻屬NC-M5中添加IAA和細(xì)胞分裂素促進(jìn)了甘油三酯合成的關(guān)鍵酶甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶和甘油二酯?；D(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)[16]。此外，由于生長(zhǎng)素在氮脅迫條件下能誘導(dǎo)超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶等抗氧化酶的活性表達(dá)，猝滅了氮脅迫下產(chǎn)生的過(guò)多活性氧，從而減輕了缺氮造成的細(xì)胞氧化損傷[17]，這也減緩了部分氮限制造成的生長(zhǎng)抑制。

2.3 生長(zhǎng)素對(duì)普通小球藻油脂脂肪酸組成的影響

脂肪酸是組成微藻油脂的關(guān)鍵成分，其碳鏈長(zhǎng)度、飽和度等與生物柴油的品質(zhì)直接相關(guān)，因此本研究進(jìn)一步對(duì)普通小球藻油脂的脂肪酸組成進(jìn)行了分析，結(jié)果如表1所示。

表1 不同培養(yǎng)條件下普通小球藻油脂脂肪酸組成及含量

由表1可知，在BG11培養(yǎng)條件下C16～C20為代表的柴油優(yōu)質(zhì)成分僅占總脂肪酸的54.59%，在氮限制培養(yǎng)條件下提高到64.23%，而添加生長(zhǎng)素IAA、NAA、2,4-D后進(jìn)一步增加到71.99%、73.75%、84.81%。這可能是由于生長(zhǎng)素誘導(dǎo)甘油三酯的前體物單半乳糖二?；视桶l(fā)生水解，進(jìn)而提高了C16和C18脂肪酸含量[18]。因此，生長(zhǎng)素不僅促進(jìn)了微藻總脂含量，而且還促進(jìn)了生物柴油優(yōu)質(zhì)成分來(lái)源C16、C18脂肪酸的含量，且其中2,4-D的作用效果最佳。

3 結(jié) 論

以最常見(jiàn)的產(chǎn)油微藻普通小球藻為模板藻種，研究在氮限制條件下通過(guò)添加IAA、NAA、2,4-D 3種生長(zhǎng)素對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)和油脂積累的影響。結(jié)果表明：3種生長(zhǎng)素的最佳添加量分別為IAA 1.0 mg/L、NAA 2.5 mg/L、2,4-D 1.0 mg/L；在IAA、NAA、2,4-D最佳添加量下，小球藻最高生物量分別為158、159、164 mg/L，是單一缺氮培養(yǎng)(ND)下生物量的1.27、1.28、1.32倍，與整個(gè)培養(yǎng)周期前8 d正常培養(yǎng)(BG11)下的微藻生物量相比無(wú)顯著性差異，生長(zhǎng)素有效抵消了缺氮脅迫對(duì)生物量的負(fù)影響。在IAA、NAA、2,4-D最佳添加量與ND培養(yǎng)條件下，普通小球藻最大總脂含量分別是BG11培養(yǎng)條件下的1.72、1.64、1.74、1.37倍；最大總脂產(chǎn)量分別是BG11組的1.49、1.43、1.56、0.93倍，胞內(nèi)最大甘油三酯含量分別為27.97%、25.66%、33.21%、19.88%，最大甘油三酯產(chǎn)量分別為44.19、40.80、54.46、24.65 mg/L，C16～C20脂肪酸成分分別占總脂肪酸的71.99%、73.75%、84.81%、64.23%。3種生長(zhǎng)素的作用效果依次是2,4-D、IAA、NAA。