甘草查爾酮A對人腦膠質(zhì)瘤U251細胞增殖和凋亡的影響

萬珊珊 孫曉冬 閆 磊

牡丹江醫(yī)學院組胚教研室，黑龍江牡丹江 157011

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、對放療和化療抵抗并容易復(fù)發(fā)等特點[1-2]。腦膠質(zhì)瘤是由大腦和脊髓膠質(zhì)細胞惡變產(chǎn)生的，也是人腦原發(fā)性腫瘤中最常見的類型，包括星形細胞瘤，少突膠質(zhì)細胞瘤和室管膜瘤。根據(jù)世界衛(wèi)生組織標準，膠質(zhì)瘤分為4 個等級，包括毛細胞型星形細胞瘤（Ⅰ級）、彌散性星形細胞瘤（Ⅱ級）、間變性星形細胞瘤（Ⅲ級）以及多形性膠質(zhì)母細胞瘤（Ⅳ級）[3]。中藥治療作為新的治療方法越來越被關(guān)注。甘草查爾酮A 是從甘草根中提取出來的黃酮類化合物，具有多種藥理學活性，包括抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、抗寄生蟲及成骨活性、免疫調(diào)節(jié)、解痙攣等，目前最受關(guān)注的是甘草查爾酮A 的抗腫瘤活性[4]。本實驗選取人腦膠質(zhì)瘤U251 細胞為實驗對象，探討甘草查爾酮A對人腦膠質(zhì)瘤U251 細胞增殖和凋亡的影響。

1 對象與方法

1.1 細胞系

人腦膠質(zhì)瘤細胞系U251，購自美國ATCC 公司。

1.2 主要儀器與試劑

5417R 臺式高速離心機（德國Ep-pendorf 生命科學公司）；JYH27020 電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；ELX800 酶標儀（美國Bio-Tek 儀器公司）。

甘草查爾酮A，純度＞98%，購自成都瑞芬思生物科技有限公司；MTT 試劑購自美國Sigma 公司；胎牛血清購自美國invitrogen 公司。

1.3 實驗分組及處理

復(fù)蘇人腦膠質(zhì)瘤細胞系U251，將人腦膠質(zhì)瘤U251細胞分為四組（n=20），對照組予以等量0.9% NaCl 處理，甘草查爾酮A 低劑量組予以15 μmol/L 甘草查爾酮A處理，甘草查爾酮A 中劑量組予以30 μmol/L 甘草查爾酮A 處理，甘草查爾酮A 高劑量組予以45 μmol/L 甘草查爾酮A 處理，干預(yù)48 h。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 將人腦膠質(zhì)瘤U251 細胞培養(yǎng)至含10%胎牛血清、含100 U/L 青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中，每隔1～2 d 用胰蛋白酶傳代1 次。

1.4.2 細胞增殖實驗 將細胞按20 000 個/ml 的密度接種于96 孔培養(yǎng)板上，體積100 μl/孔，每組設(shè)3 個復(fù)孔。細胞80%融合后，按照分組與給藥方法處理細胞，接種48 h 后，取96 孔板行噻唑藍比色法（methyl thiazolyl tetrazolium colorimetry method，MTT）檢測。每孔加MTT 溶液20 μl，37℃避光培育，4 h 棄孔內(nèi)上清液，加入150 μl DMSO，振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶后用酶標儀測定在490 nm 處細胞的光密度（optical density，OD）值。

1.4.3 檢測各組細胞Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、Cyclin D1mRNA 表達水平 以實時熒光定量（real-time fluorescence quantification，PCR）法檢測各組細胞Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、Cyclin D1mRNA 表達水平。根據(jù)GeneBank的β-catenin 和Cyclin D1序列，利用Premier 5.0 軟件設(shè)計可擴增的產(chǎn)物。引物序列：β-catenin 正向引物5′-CTGCAGGGGTCCTCTGTG-3′，反向引物5′-TGCATATGTCGCCACACC-3′；Cyclin D1正向引物5′-GTCACCTAGCAAGCTGCCGAACC-3′，反向引物5′-CGACAGACAAAGCGTCCCTCAAG-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）正向引物5′-CAACGAATTTGGCTACAG CA-3′，反向引物5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3′。

反應(yīng)體系：cDNA 模板2 μl，正、反向引物（20 μmol/L）各0.8 μl，dH2O 6.4 μl，SYBR Green 10 μl，總體積20 μl。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸10 min，共40 個循環(huán)，末次循環(huán)72℃延伸7 min。重復(fù)實驗3 次。

目的基因mRNA 的相對表達量用內(nèi)參GAPDH基因進行均一化，以2-ΔΔCt值表示目的基因的相對表達量。

1.4.4 檢測各組目的蛋白表達水平 以蛋白印跡法（Western blot）檢測各組的增殖細胞核抗原-67（proliferative nuclear antigen Ki-67，Ki-67）、B 淋 巴細胞瘤-2（B lymphoma-2，Bcl-2）表達水平。收集各組后細胞裂解，離心速率為12 000 r/min，離心半徑為10 cm，離心10 min。二喹啉甲酸法進行蛋白定量，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離后電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，孵育30 min，通過凝膠成像分析系統(tǒng)，以GAPDH 為內(nèi)參對照，計算各個樣本目的蛋白條帶與GAPDH 條帶的灰度比值，作為目的蛋白的相對表達水平。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS for windows 21.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t 檢驗；計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 四組人腦膠質(zhì)瘤U251 細胞培養(yǎng)48 h 后OD 值的比較

MTT 結(jié)果顯示，甘草查爾酮A 低劑量組、甘草查爾酮A 中劑量組和甘草查爾酮A 高劑量組的OD 值均低于對照組，甘草查爾酮A 中劑量組和甘草查爾酮A 高劑量組的OD 值均低于甘草查爾酮A 低劑量組，甘草查爾酮A 高劑量組的OD 值低于甘草查爾酮A 中劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（表1）。

表1 四組人腦膠質(zhì)瘤U251 細胞培養(yǎng)48 h 后OD 值的比較（±s）

表1 四組人腦膠質(zhì)瘤U251 細胞培養(yǎng)48 h 后OD 值的比較（±s）

注 與對照組比較，aP＜0.01；與甘草查爾酮A 低劑量組比較，bP＜0.01；與甘草查爾酮A 中劑量組比較，cP＜0.01

組別 例數(shù) OD對照組甘草查爾酮A 低劑量組甘草查爾酮A 中劑量組甘草查爾酮A 高劑量組20 20 20 20 0.83±0.03 0.67±0.05a 0.42±0.04ab 0.30±0.01abc

2.2 四組人腦膠質(zhì)瘤U251 細胞β-catenin、Cyclin D1 mRNA 表達水平的比較

RT-qPCR 結(jié)果顯示，甘草查爾酮A 低劑量組、甘草查爾酮A 中劑量組和甘草查爾酮A 高劑量組的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相對表達量低于對照組，甘草查爾酮A 中劑量組和甘草查爾酮A 高劑量組的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相對表達量均低于甘草查爾酮A 低劑量組，甘草查爾酮A高劑量組的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相對表達量低于甘草查爾酮A 中劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（表2）。

表2 四組人腦膠質(zhì)瘤U251 細胞β-catenin、Cyclin D1 mRNA 表達水平的比較（±s）

表2 四組人腦膠質(zhì)瘤U251 細胞β-catenin、Cyclin D1 mRNA 表達水平的比較（±s）

注 與對照組比較，aP＜0.01；與甘草查爾酮A 低劑量組比較，bP＜0.01；與甘草查爾酮A 中劑量組比較，cP＜0.01

組別 例數(shù) β-catenin mRNA Cyclin D1 mRNA對照組甘草查爾酮A 低劑量組甘草查爾酮A 中劑量組甘草查爾酮A 高劑量組20 20 20 20 0.56±0.03 0.40±0.06a 0.29±0.04ab 0.21±0.01abc 0.86±0.09 0.65±0.10a 0.46±0.08ab 0.39±0.01abc

2.3 四組細胞Ki-67、Bcl-2 蛋白表達水平比較

Western blot 結(jié)果顯示，甘草查爾酮A 低劑量組、甘草查爾酮A 中劑量組和甘草查爾酮A 高劑量組的Ki-67、Bcl-2 蛋白表達水平均低于對照組，甘草查爾酮A 中劑量組和甘草查爾酮A 高劑量組的Ki-67、Bcl-2 蛋白表達水平均低于甘草查爾酮A 低劑量組，甘草查爾酮A 高劑量組的Ki-67、Bcl-2 蛋白表達水平低于甘草查爾酮A 中劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（表3）。

表3 四組細胞Ki-67 和Bcl-2 蛋白表達水平比較（±s）

表3 四組細胞Ki-67 和Bcl-2 蛋白表達水平比較（±s）

注 與對照組比較，aP＜0.01；與甘草查爾酮A 低劑量組比較，bP＜0.01；與甘草查爾酮A 中劑量組比較，cP＜0.01

組別 例數(shù) Ki-67 Bcl-2對照組甘草查爾酮A 低劑量組甘草查爾酮A 中劑量組甘草查爾酮A 高劑量組20 20 20 20 0.98±0.02 0.79±0.08a 0.66±0.03ab 0.34±0.01abc 0.64±0.07 0.55±0.02a 0.40±0.03ab 0.29±0.0abc

3 討論

盡管目前腦膠質(zhì)瘤治療技術(shù)有了較大進步，患者預(yù)后有了較大改善，但腦膠質(zhì)瘤的治療仍缺乏突破性進展[5-7]。腦膠質(zhì)瘤治療以手術(shù)為首選，但由于腦膠質(zhì)瘤具有浸潤生長的特性，與腦組織間無明顯邊界，難以做到全部切除，必須輔以術(shù)后放、化療殺傷殘余腫瘤細胞。膠質(zhì)瘤的化療依然存在許多局限性，因此急需革新治療理念，研發(fā)新型藥物來有效殺傷膠質(zhì)瘤細胞，降低復(fù)發(fā)率及死亡率，提高生活質(zhì)量以及改善預(yù)后等。探索新的治療藥物抑制腦膠質(zhì)瘤已經(jīng)成為醫(yī)學的研究熱點，中藥治療將具有非常好的前景。

甘草為我國中醫(yī)藥學中常見的補氣類藥用植物，其藥性平和通行十二經(jīng)脈，有調(diào)和諸藥、解毒、補虛、止咳潤肺等多種功能，為常用處方藥[8]。甘草首載于東漢的《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，有悠久的藥用歷史。中醫(yī)處方離不開甘草，有“十方九草”之說。甘草的主要成分是三萜類化合物和黃酮類化合物[9]。甘草查爾酮A是傳統(tǒng)中藥甘草的主要成分，其抗腫瘤活性正在成為研究熱點[10-12]。

Wnt/β-catenin 信號通路，是一條極其保守的信號轉(zhuǎn)導通路，參與胚胎發(fā)育及細胞增殖與分化等正常生理過程，同時，Wnt/β-catenin 通路也是腫瘤進展的關(guān)鍵性通路之一，在很多腫瘤中過渡激活，包括腦、乳腺、結(jié)腸、皮膚和肝臟等[13-17]。β-catenin 是Wnt/βcatenin 通路的正性調(diào)控因子，生理狀態(tài)下主要表達在細胞膜上，參與介導同型細胞之間的粘連。Wnt/βcatenin 通路在腫瘤細胞內(nèi)被激活后促使β-catenin轉(zhuǎn)移，致下游靶基因c-myc、MMP-7 等活化，從而促使腫瘤進展。β-catenin 也是腫瘤干細胞增殖所必需的因素[18]。Wnt/β-catenin 通路的異常激活促進腫瘤的增殖、遷移和侵襲，而阻斷Wnt/β-catenin 信號通路除可以抑制腫瘤的遷移、侵襲和血管生成之外，還可能調(diào)節(jié)腫瘤的化療敏感性[19-20]。Cyclin D1是Wnt/βcatenin 信號通路的下游原癌基因，它控制著細胞周期從G1 期向S 期的轉(zhuǎn)變，主要促進細胞增殖。本研究結(jié)果顯示，甘草查爾酮A 低劑量組、甘草查爾酮A 中劑量組和甘草查爾酮A 高劑量組的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相對表達量低于對照組，甘草查爾酮A 中劑量組和甘草查爾酮A 高劑量組的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相對表達量均低于甘草查爾酮A 低劑量組，甘草查爾酮A 高劑量組的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相對表達量低于甘草查爾酮A中劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），這表明了甘草查爾酮A 可能通過Wnt/β-catenin 信號通路抑制人腦膠質(zhì)瘤U251 細胞增殖。

增殖細胞核抗原Ki-67 是細胞作為細胞周期中核抗原的決定簇，在細胞周期中所有處于活動期的細胞均可表達，在腫瘤細胞中廣泛應(yīng)用作為處于增殖狀態(tài)的標志物。Bcl-2 能夠抑制細胞凋亡，延長細胞壽命，屬于抗凋亡基因[20]。本研究結(jié)果顯示，甘草查爾酮A低劑量組、甘草查爾酮A 中劑量組和甘草查爾酮A高劑量組的Ki-67、Bcl-2 蛋白表達水平均低于對照組，甘草查爾酮A 中劑量組和甘草查爾酮A 高劑量組的Ki-67、Bcl-2 蛋白表達水平均低于甘草查爾酮A低劑量組，甘草查爾酮A 高劑量組的Ki-67、Bcl-2 蛋白表達水平低于甘草查爾酮A 中劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），這表明了甘草查爾酮A 可能通過Ki-67 和Bcl-2 蛋白抑制人腦膠質(zhì)瘤U251 細胞增殖和促進凋亡。

綜上所述，甘草查爾酮A 對人腦膠質(zhì)瘤U251 細胞有抑制增殖和促進凋亡作用，其機制可能與下調(diào)β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA、Ki-67 和Bcl-2 表達水平有關(guān)。腫瘤增殖是腫瘤患者致死的最直接原因，本實驗提示中藥治療腦膠質(zhì)瘤可能發(fā)揮較好作用，這為腦膠質(zhì)瘤的治療提供了一個新的方向。