腫瘤抑素19肽對SK-Hep-1細胞增殖和凋亡作用的影響

王 順 劉桃源 李 昂 衣同輝 潘洪明 李淑艷

齊齊哈爾醫(yī)學院醫(yī)學技術(shù)學院，黑龍江齊齊哈爾 161006

肝癌是一種惡性腫瘤，在全球惡性腫瘤發(fā)病中排名第六位，5年生存率僅為18%[1]，肝細胞癌占原發(fā)性肝癌4/5[2]。肝細胞癌起病隱匿，臨床癥狀不明顯，多數(shù)患者確診已屬于中晚期[3]。傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和化療等的治療效果均不理想，同時傳統(tǒng)的化療藥物副作用大，易出現(xiàn)多藥耐藥性，因此，探索高效低毒的抗腫瘤新藥是醫(yī)藥研究的首要任務。生物活性肽廣泛存在于自然界的生命體中，包括細菌、植物、無脊椎動物及脊椎動物中[4]。生物活性肽具有抗菌、抗癌和免疫調(diào)節(jié)等功能[5]，分子量相對較大的生物活性肽提純及合成難度大，副作用也大。因此，研發(fā)分子量小、具有高特異性、高效性、低毒性的抗癌生物活性肽成為近年來生物醫(yī)學領(lǐng)域研究的熱點[6-7]。腫瘤抑素是膠原蛋白Ⅳα3鏈非膠原區(qū)域的生物活性多肽片段[8]，腫瘤抑素靠近C 端的第185～203 位氨基酸之間的區(qū)域稱為腫瘤抑素19 肽。研究發(fā)現(xiàn)[9]，19 肽能抑制新生血管形成，誘導黑色素瘤等細胞凋亡，對低分化SGC-7901胃癌細胞、HepG2 肝癌細胞也有抑制增殖作用[10-11]。但19 肽對肝癌SK-Hep-1 細胞的增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移能力的影響還未見報道。本課題研究19 肽對SK-Hep-1細胞增殖能力和凋亡作用的影響，探討19 肽對SKHep-1 細胞轉(zhuǎn)移能力的影響，為肝癌的生物治療提供臨床應用的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

肝癌細胞株SK-Hep-1 購自中科院細胞庫，胎牛血清購自Biosharp 公司；腫瘤抑素19 肽購自安徽國肽生物科技有限公司；DMEM-H 培養(yǎng)基購自Gibco公司；CCK-8 試劑盒購自南京碧云天生物技術(shù)公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI 試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAPI 熒光染料購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 19 肽對SK-Hep-1 細胞增殖能力的影響 SKHep-1用含10%胎牛血清的DMEM-H 培養(yǎng)基在37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞融合度90%以上時，用0.25%胰酶消化，計數(shù)，調(diào)整細胞密度為1×104個/ml，每孔100 μl 接種于96 孔板中培養(yǎng)。向各孔中加入19 肽（濃度分別為0、50、100、150、200、250 μg/ml，每個濃度設3 個復孔）。分別培養(yǎng)24、48 h后，在450 nm 波長測吸光度值。通過計算半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），篩選出19 肽最佳作用濃度。

1.2.2 DAPI 染色觀察SK-Hep-1 細胞凋亡的形態(tài)學變化 19 肽處理細胞同“1.2.1 項”。細胞按1×106個/孔，接種于6 孔板，待細胞貼壁后培養(yǎng)24 h，用PBS 洗1次，每孔加4%多聚甲醛溶液，置-20℃固定20 min，PBS洗2 次，加DAPI 染液室內(nèi)避光染色10 min，PBS洗2次，鏡下340 nm 波長激發(fā)熒光，熒光顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)變化。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 細胞處理同“1.2.1項”，按1×106個/孔/3 ml，接種于6 孔板，待細胞貼壁后培養(yǎng)24 h，用PBS 洗2 次，加入100 μl 膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液重懸細胞，加入5 μl AnnexinⅤ-FITC 和5 μl PIstaining solution，混均室溫避光孵育10 min，染色完成后，加入400 μl 膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液，混勻，用流式細胞儀在488 nm 激發(fā)波長、530 nm 發(fā)射波長下檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計學軟件Graphpad 8.0 進行數(shù)據(jù)分析，定量資料采用均數(shù)±標準差（±s），組間比較采用t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 19 肽對肝癌SK-Hep-1 細胞增殖活性的抑制作用

0、50、100、150、200、250 μg/ml 濃度的19 肽作用SK-Hep-1 細胞24 h 后細胞存活率分別為（100.00±1.80）%、（95.64±1.92）%、（82.18±1.67）%、（68.43±1.39）%、（46.74±1.35）%、（42.49±1.85）%。作用48 h 后細胞存活率分別為（100.00±1.80）%、（87.27±1.96）%、（66.32±1.74）%、（58.78±1.94）%、（40.40±1.44）%、（22.15±1.51）%。細胞增殖活性明顯受到抑制。19肽作用24 h 的IC50為200.00 μg/ml（圖1）。

圖1 19 肽對SK-Hep-1 細胞增殖活性的抑制作用

2.2 DAPI 染色觀察SK-Hep-1 細胞凋亡的形態(tài)學變化

如圖2 所示（封三），19 肽為0 μg/ml 時，SK-Hep-1細胞大部分染色均勻，呈藍色，細胞未發(fā)生凋亡。與0 μg/ml 相比，50、100、150、200、250 μg/ml 濃度 的19肽作用24 h 后，部分細胞呈亮藍色，細胞核出現(xiàn)濃縮、破裂、碎塊狀致密濃染或帽點狀凋亡形態(tài)，隨著藥物濃度增加，細胞凋亡比率增高。

2.3 19 肽對肝癌SK-Hep-1 細胞凋亡率的影響

0、100、150、200、250 μg/ml 的19 肽作用SK-Hep-1細胞24 h 后，凋亡率分別為（13.15±0.42）%、（13.87±0.64）%、（17.15±0.68）%、（26.84±0.40）%、（32.24±0.41）%。細胞凋亡率隨著19 肽濃度的增高而增加（圖3）。

圖3 19 肽對Sk-hep-1 細胞凋亡率的影響

3 討論

肝癌是一種惡性腫瘤，在我國發(fā)病率和致死率相當[12]，其治療方法以手術(shù)、放療、靶向及小分子化學藥物為主，手術(shù)后復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率高，放療和化療又存在特異性和敏感性差等問題[13]。而生物活性肽具有多種生理功能，如抗氧化、抗增殖和免疫功能等作用[14]，生物活性肽的這些活性具有抗癌潛力，有利于癌癥治療研究。腫瘤抑素是一種生物活性肽，具有抑制腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡的作用，但存在分子量大，相對副作用也大，以及存在難以提取或者合成等問題[15]。腫瘤抑素19 肽是通過肽的固相合成技術(shù)對腫瘤抑素進行改造修飾的小分子多肽，能夠顯著抑制腫瘤細胞的增殖。本研究探討19 肽對SK-Hep-1 細胞的抑制作用及機制，結(jié)果顯示CCK-8 實驗中，在24 h 的SK-Hep-1 細胞增殖活性檢測中，發(fā)現(xiàn)19 肽濃度為0～100 μg/ml 時，細胞存活率下降趨勢較為平緩；19 肽濃度處于100～250 μg/ml 時，細胞存活率下降較陡直，提示隨著19肽濃度的增加，肝癌SK-Hep-1 細胞的存活率逐漸降低。表明0～100 μg/ml 為平緩期，細胞對19 肽耐受；濃度在150～250 μg/ml 時，19 肽抑制SK-Hep-1細胞的增殖能力逐漸增強。另外，賀巖[10]動態(tài)觀察到19 肽對胃癌細胞的增殖有抑制作用，表明19 肽具有抑制消化道腫瘤細胞增殖的作用。

凋亡在維持細胞穩(wěn)態(tài)中至關(guān)重要，抗肝癌藥物根除癌細胞主要通過誘導細胞的凋亡來實現(xiàn)[16]。本研究DAPI 染色檢測可見，19 肽作用后SK-Hep-1 細胞的細胞膜變圓，細胞核大小不一，出現(xiàn)核內(nèi)部染色質(zhì)聚集、斷裂，形成半月狀或帽點狀。通過流式細胞術(shù)進一步研究19 肽對肝癌SK-Hep-1 細胞凋亡的影響，結(jié)果表明，隨著19 肽濃度的增加，早期凋亡和晚期凋亡細胞的概率均增加。19 肽濃度在0～100 μg/ml 時，細胞的凋亡率變化相對較?。?2.73%～14.51%）；19 肽濃度處于150～250 μg/ml 時，細胞的凋亡率變化幅度較大（14.51%～32.65%）。推測SK-Hep-1 細胞可能對低濃度的19 肽（0～100 μg/ml）具有耐受性，超過此范圍，稍微增加劑量就可以顯著增加細胞的凋亡率。

衣同輝等[11]發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑素19 肽能協(xié)同人參皂苷Rg3 誘導肝癌HepG2 細胞的凋亡。兩者聯(lián)合時，減少了人參皂苷Rg3 的用藥劑量，同時增加了療效?？梢?9 肽聯(lián)合藥物治療腫瘤能減少化療藥物劑量，對療效具有正相協(xié)同作用。

綜上所述，19 肽能夠抑制肝癌SK-Hep-1 細胞的增殖，促進其凋亡，今后將進一步探討19 肽對SKHep-1 細胞轉(zhuǎn)移能力的影響及機制，以及19 肽與化療藥物聯(lián)合治療腫瘤的效果及機制。為臨床腫瘤的生物治療提供理論指導。