RhaFGF局部外敷促進(jìn)糖尿病大鼠難愈性皮膚潰瘍修復(fù)的研究

宋久于 王敏華 李海坤 廖寶春 陳小波 朱賢森 曾祥泰▲

1.贛南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院皮膚科，江西贛州 341000；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科，江西贛州 341000；3.贛南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院康復(fù)科，江西贛州 341000；4.贛南醫(yī)學(xué)院病理教研室，江西贛州 341000

糖尿病皮膚潰瘍是糖尿病患者截肢的主要原因，該病致殘率和致死率高，且治療愈合后容易復(fù)發(fā)。糖尿病皮膚潰瘍是因糖尿病引起的內(nèi)環(huán)境改變（如高血糖、糖尿病性血管病變和神經(jīng)病變）和由糖尿病引起的皮膚局部病理變化（如傷口感染、愈傷組織形成和創(chuàng)傷性應(yīng)激）共同作用產(chǎn)生的嚴(yán)重并發(fā)癥。約有70%的2 型糖尿病患者將會發(fā)生外周神經(jīng)病變[1]，使下肢和足底肌肉群萎縮無力，足弓力學(xué)失衡致跖骨壓力明顯增高，最終導(dǎo)致糖尿病足難愈性潰瘍的發(fā)生[2-3]。糖尿病潰瘍患者的皮膚經(jīng)常摩擦衣物或鞋子等，加劇感染，導(dǎo)致異常疼痛[4-5]，給患者帶來巨大的痛苦。因此，有必要依據(jù)其發(fā)病機(jī)制，探索更安全、更有效的治療方法。

成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GF）是人體活性蛋白的一種微量元素，分為酸性成纖維細(xì)胞生長因子（acidic fibroblast growth factor，aFGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），可調(diào)控一系列復(fù)雜的病理生理過程[6]。aFGF可誘導(dǎo)不同細(xì)胞的分化和增殖，誘導(dǎo)缺血區(qū)域的血管形成[7]，并增強(qiáng)肉芽組織的形成[8]，目前已成為創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域的熱點。在糖尿病難愈性潰瘍初期，巨噬細(xì)胞和受損部分的內(nèi)皮細(xì)胞釋放aFGF，刺激成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白酶、膠原酶和各種細(xì)胞因子[9]。有學(xué)者對深Ⅱ度燒傷糖尿病大鼠模型進(jìn)行HE 染色，結(jié)果顯示aFGF 組細(xì)胞增殖明顯高于糖尿病組[10]。目前利用基因工程技術(shù)研發(fā)的一類新藥重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子（recombinant human acidic fibroblast growth factor，RhaFGF）已經(jīng)在臨床上用于糖尿病潰瘍治療，其臨床效果正在被越來越多的臨床數(shù)據(jù)所證實[11]。本研究旨在通過生化分析、組織病理學(xué)及免疫熒光的方法，探究RhaFGF 對糖尿病大鼠難愈性皮膚潰瘍愈合的影響，并進(jìn)一步研究其修復(fù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

于2020年2月至4月選取30 只健康雄性2月齡SPF 級SD 大鼠（湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司），體重180～200 g。本研究經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 藥品與試劑

鏈脲霉素（streptozotocin，STZ）購自北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Ki-67 抗體，CD31 抗體和HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠抗體購自北京生物科技有限公司；RhaFGF（商品名：艾夫吉夫）購自上海騰瑞制藥有限公司。

1.3 糖尿病大鼠潰瘍模型的制備

取30 只大鼠高脂高糖飼料（1.5%膽固醇、0.25%膽酸鈉、10%豬油、5%蔗糖、83.25%基礎(chǔ)飼料）喂養(yǎng)4周后，禁食過夜（不禁水）12 h 后在其腹腔注射STZ（35 mg/kg），5 d 后血糖≥11.1 mmol/L 為造模成功[12]。存活糖尿病大鼠用10%水合氯醛麻醉后，背部剃毛進(jìn)行常規(guī)消毒，在其背部用龍膽紫標(biāo)記兩等大圓形區(qū)域，總面積約為3.14 cm2。以外科手術(shù)剪小心沿標(biāo)記處剪去全層皮膚，深至筋膜。8 h 后大鼠背部創(chuàng)面無感染、紅腫，大鼠活動能力、生命體征正常為造模成功[12]。造模成功后的糖尿病潰瘍模型在SPF 級動物環(huán)境飼養(yǎng)（其中2 只大鼠造模未成功）。

1.4 大鼠分組與給藥

造模成功的28 只糖尿病潰瘍大鼠編號后根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為RhaFGF 組和對照組，每組14 只。兩組大鼠的體重、潰瘍面積比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。RhaFGF 組給予RhaFGF 100 U/cm2局部外敷治療，對照組給予0.9%氯化鈉溶液0.1 ml/cm2局部外敷治療。

1.5 評估傷口愈合指標(biāo)及方法

分別于給藥治療后的第7、14 天進(jìn)行拍照（拍照使用5 cm 焦距1 倍視野）及收集皮膚潰瘍樣本，使用Image-J 軟件處理拍照圖片計算創(chuàng)面潰瘍面積，運(yùn)用SOD、MDA 試劑盒在酶標(biāo)記法檢測SOD、MDA 的絕對含量，HE 染色病理學(xué)觀察，免疫熒光檢測CD31 及Ki-67 表達(dá)的組織細(xì)胞陽性顆粒數(shù)并采用HPIAS-100 分析系統(tǒng)計算其陽性表達(dá)率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用率表示，兩組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組潰瘍創(chuàng)面面積的比較

治療前，兩組的潰瘍創(chuàng)面面積比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療第7、14 天，兩組的潰瘍創(chuàng)面面積均小于治療前，RhaFGF 組的潰瘍創(chuàng)面面積小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療第14 天，兩組的潰瘍創(chuàng)面面積均小于治療第7 天，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組潰瘍創(chuàng)面面積的比較（cm2，±s）

表1 兩組潰瘍創(chuàng)面面積的比較（cm2，±s）

對照組RhaFGF 組t 值P 值14 14 3.138±0.142 3.127±0.098 1.053＞0.05 1.590±0.099 1.204±0.021 5.437＜0.05 0.792±0.035 0.509±0.012 5.039＜0.05 7.063 7.963＜0.01＜0.01 8.459 8.834＜0.01＜0.01 6.495 6.073＜0.01＜0.01組別 例數(shù) 治療前 治療第7 天 治療第14 天 t 治療前與治療第7 天比較值P 治療前與治療第7 天比較值t 治療前與治療第14 天比較值P 治療前與治療第14 天比較值t 治療第7 天與治療第14 天比較值P 治療第7 天與治療第14 天比較值

2.2 兩組SOD 活性和MDA 含量的比較

治療第7、14 天，RhaFGF 組的MDA 含量低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；RhaFGF 組的SOD活性高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療第14 天，RhaFGF 組的MDA 含量低于本組治療第7天，SOD 活性高于本組治療第7 天，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組的MDA 含量、SOD 活性高于本組治療第7 天，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2～3）。

表2 兩組大鼠MDA 含量的比較（nmol/mg，±s）

表2 兩組大鼠MDA 含量的比較（nmol/mg，±s）

對照組RhaFGF 組t 值P 值14 14 0.50±0.05 0.38±0.04 4.517＜0.05 0.65±0.17 0.19±0.04 5.314＜0.05 3.623 5.764＜0.05＜0.05組別 例數(shù) 治療第7 天 治療第14 天 t 值 P 值

表3 兩組大鼠SOD 活性的比較（U/mg，±s）

表3 兩組大鼠SOD 活性的比較（U/mg，±s）

對照組RhaFGF 組t 值P 值14 14 0.08±0.09 0.19±0.01 4.843＜0.05 0.18±0.08 0.32±0.09 5.364＜0.05 3.342 5.343＜0.05＜0.05組別 例數(shù) 治療第7 天 治療第14 天 t 值 P 值

2.3 兩組CD31、Ki-67 陽性表達(dá)率的比較

治療第7、14 天，RhaFGF 組的CD31、Ki-67 陽性表達(dá)率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；治療第14 天，兩組的CD31、Ki-67 陽性表達(dá)率高于本組治療第7 天，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表4～5）。

表4 兩組大鼠CD31 陽性表達(dá)率的比較（%，±s）

表4 兩組大鼠CD31 陽性表達(dá)率的比較（%，±s）

對照組RhaFGF 組t 值P 值14 14 7.33±2.17 20.13±3.78 7.306＜0.01 13.70±2.54 29.54±6.35 6.551＜0.01 6.327 7.154＜0.01＜0.01組別 例數(shù) 治療第7 天 治療第14 天 t 值 P 值

表5 兩組大鼠Ki-67 陽性表達(dá)率的比較（%，±s）

表5 兩組大鼠Ki-67 陽性表達(dá)率的比較（%，±s）

對照組RhaFGF 組t 值P 值14 14 6.27±1.53 20.79±10.79 6.768＜0.01 10.73±2.54 36.95±8.25 7.591＜0.01 5.327 7.954＜0.05＜0.01組別 例數(shù) 治療第7 天 治療第14 天 t 值 P 值

2.4 組織病理學(xué)檢查結(jié)果

分別在第7、14 天取兩組大鼠潰瘍組織進(jìn)行HE染色，每個觀察時間點取4 張切片，在每張切片中隨機(jī)選取4 個高倍視野；40 倍鏡下完成計數(shù)。結(jié)果見圖1（封四），第7 天對照組大鼠有大量的炎癥細(xì)胞浸潤，只有少量的成纖維細(xì)胞和新生的毛細(xì)血管，而RhaFGF 組新生的毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞數(shù)量和膠原蛋白表達(dá)量明顯增加。第14 天RhaFGF 組發(fā)現(xiàn)有大量的毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞和膠原蛋白在潰瘍邊緣形成，再上皮化水平及成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯高于對照組。

3 討論

糖尿病皮膚潰瘍的修復(fù)是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，包含創(chuàng)面氧化應(yīng)激炎癥反應(yīng)、肉芽組織增生和再上皮化等方面，受多種細(xì)胞因子參與及調(diào)控。FGF 是一種能促使細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)因子家族，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和分裂的功能，調(diào)控血管生成、創(chuàng)傷修復(fù)等過程[13]。MDA 是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物；SOD 是一種生物活性物質(zhì)，可以消除代謝產(chǎn)物。本研究結(jié)果顯示，使用RhaFGF 可以減少皮膚潰瘍處的MDA 含量，提高SOD 的活性，有效減輕糖尿病皮膚潰瘍的氧化應(yīng)激帶來的損傷程度，提示RhaFGF 可促進(jìn)糖尿病大鼠難愈性皮膚潰瘍的修復(fù)。

新生毛細(xì)血管可改善傷口微循環(huán)，為組織修復(fù)提供氧氣和營養(yǎng)，促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面的愈合[14]。成纖維細(xì)胞是傷口修復(fù)的主要細(xì)胞，在潰瘍形成后合成和分泌足夠的膠原蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)成分，參與肉芽組織增生、創(chuàng)面愈合和組織再生過程[15]。HE 染色結(jié)果顯示，RhaFGF 組與糖尿病組比較，新生的毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞的含量以及膠原蛋白的表達(dá)量顯著增加，提示RhaFGF 通過誘導(dǎo)血管分化、增加新生毛細(xì)血管的數(shù)量改善潰瘍創(chuàng)面微循環(huán)，為其提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面修復(fù)。

RhaFGF 通過增強(qiáng)CD31 和Ki-67 增殖蛋白的表達(dá)，可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖。CD31 是一種表達(dá)于造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面的130-kD 的糖蛋白，是一種細(xì)胞黏附分子[16]，CD31 分子的密集程度可以反映新生血管的密集程度，表達(dá)量與細(xì)胞增殖密切相關(guān)[17]。Ki-67 是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，其功能與細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān)。導(dǎo)致糖尿病足潰瘍創(chuàng)面難愈的主要原因在于創(chuàng)面肉芽組織中細(xì)胞成分增殖不足和過度氧化應(yīng)激[18-19]。本研究結(jié)果顯示，RhaFGF 可促進(jìn)CD31 和Ki-67 的釋放，增強(qiáng)成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白表達(dá)。

綜上所述，RhaFGF 通過促進(jìn)糖尿病難愈性潰瘍的氧化應(yīng)激、增加潰瘍組織的毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞生成提高上皮再生水平，從而促進(jìn)大鼠糖尿病潰瘍組織的修復(fù)。